基于網絡藥理學的爵床抗腫瘤活性成分及作用機制研究

胡進 陳輝 張歡 謝周濤

中藥爵床為爵床科植物爵床Rostellularia procumbens （L.） Nees的干燥全草，是傳統的中草藥。爵床具有清熱解毒、利尿消腫之功效，臨床用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、痢疾、腸炎、腎盂腎炎等癥，外用治療癰瘡癤腫等[1]。爵床全草的現代研究表明，其主要化學成分為木脂素及其苷類、黃酮類、生物堿、三萜類化合物等。現代藥理研究表明，爵床具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等多種生物活性[2]，目前爵床的藥理作用研究仍不夠系統與全面。

網絡藥理學作為一種系統性、整體性的研究藥物、疾病、靶點之間相互關系的分析方法，與中藥多成分、多靶點、多途徑作用特征相吻合，可系統發掘中藥潛在活性成分和作用靶點[3，4]。我們采用網絡藥理學的研究方法，預測爵床抗腫瘤的活性成分、治療靶點和信號通路，并使用分子對接進行驗證。

1 材料與方法

1.1 化學成分庫構建通過檢索國內外相關文獻，構建爵床的化學成分庫，結合 Pubchem數據庫，采用 Chemoffice軟件繪制成分的化學結構并保存為MOL2格式。

1.2 活性成分篩選藥物的體外篩選模型主要涉及藥物的腸吸收、血腦屏障滲透性、體外代謝、藥物相互作用和各種體外毒性模型等，并以人體腸道吸收（HIA）、Caco-2細胞滲透性（簡稱Caco-2）和血漿蛋白結合（PPB）作為關鍵參數進行篩選[5]。將該格式的化合物導入 https://preadmet.bmdrc.kr/網站，計算并預測藥物吸收、分布及代謝。篩選出HIA大于20，Caco-2滲透性大于4和PPB大于70的所有化學成分作為候選藥效成分。

1.3 藥效成分靶點預測將篩選好的各成分的MOL2結構導入 Pharm Mapper服務器中，采用反向藥效團匹配方法進行靶點預測，將匹配得分靠前的靶點在Uniprot數據庫進行檢索，限定物種為人，對靶點名稱進行統一。

1.4 疾病相關靶點篩選通過 GeneCards數據庫檢索關鍵詞“cancer”，得到與腫瘤相關的基因，最后導入 Uniprot數據庫進行基因名標準化處理后歸納整理，獲得腫瘤潛在相關基因靶點。

1.5 構建蛋白互作（PPI）網絡將潛在靶點導入 String數據庫，獲得PPI關系，設置置信度大于0.900，隱藏無PPI關系的靶點，以 TSV格式保存結果，再將數據導入 Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化處理和分析。

1.6 靶點通路注釋分析KEGG（Kyoto encyclopediaof genes and genomes）在網絡藥理學中常用于信號通路的注釋，對靶點基因進行通路注釋，可以了解靶點基因參與的信號通路。Gene Ontology（GO）數據庫涵蓋的生物學包括：細胞組分（Cell component，CC）、分子功能（Molecular function，MF)、生物過程（Biological process，BP）3個方面。將所有潛在靶點基因上傳至 DAVID數據庫，進行 KEGG通路注釋與 GO富集。設置閾值P＜0.05，根據P值排序保留得分靠前的結果，并進行可視化分析。

1.7 “成分-靶點-通路”網絡構建利用Cytoscape 3.6.1軟件構建靶點基因-活性成分網絡及靶點基因-富集通路網絡，網絡節點表示活性成分、作用靶點及作用通路，網絡邊表示兩節點之間存在關聯。通過構建網絡模型研究爵床多成分、多靶點、多通路的抗腫瘤作用機制。

1.8 分子對接從PBD數據庫下載度值較高的靶點蛋白結構文件（PBD格式），利用 AutoDockTools軟件對下載的靶蛋白進行加氫、加電子等前處理；靶點與活性成分進行 AutoDock分子對接驗證實驗，同時遴選陽性藥進行分子對接，以此結合能比較靶點和活性成分結合的性能。

2 結果

2.1 藥效成分篩選通過篩選共得到 27種候選藥效成分，其中有17個為木質素類成分，如 Justicidin C等；5個三萜類化合物，如friedelin；4個為黃酮類成分，如kaempferol；1個有機酸化合物，如 Palmitic acid。見表1。

表1 藥效成分篩選結果

2.2 腫瘤相關靶點的篩選分析通過 GeneCards數據庫檢索關鍵詞“cancer”，得到與腫瘤相關的基因，最終得到腫瘤靶點基因 1 480個，選取得分≥20的 397個基因進行分析。得分位于前10的基因為BRCA2、BRCA1、TP53、CDH1、MLH1、MSH2、MSH6、APC、ATM、PTEN。

2.3 PPI網絡構建與分析將活性成分作用的潛在靶點與腫瘤相關疾病基因進行比對，獲得爵床抗腫瘤活性成分潛在靶點基因，共得到54個與腫瘤聚集相關的基因數據，見表2。使用 Network Analyse功能對PPI網絡進行分析，見圖1。圖中共有54個節點，176條邊，平均度值為6.52。在PPI網絡中度值較高的靶點有SRC、蘇氨酸激酶1（Akt1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、PIK3R1、PTPN11等。

圖1 PPI網絡圖

表2 爵床抗腫瘤活性成分潛在靶點基因

續表2

2.4 活性成分潛在靶點的通路注釋利用 DAVID數據庫對爵床抗腫瘤的靶點進行富集分析，將P＜0.05作為注釋結果的篩選條件并繪圖。

GO功能富集分析結果顯示，在BP與正調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄、正調控細胞增殖、負調控 RNA聚合酶Ⅱ促進轉錄相關性最大；MF與生長因子活性、ATP結合、受損 DNA結合相關性最大；CC與細胞外空間、核漿、細胞質相關性最大。見圖2～4。

圖2 GO功能富集 BP分析

圖3 GO功能富集 CC分析

圖4 GO功能富集 MF分析

KEGG通路注釋結果顯示，有96條抗腫瘤相關信號通路，排名前十的通路為：PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、Ras信號通路、催乳激素信號通路、甲狀腺激素信號通路、ErbB信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路、趨化因子信號通路和MAPK信號通路。見圖5。

圖5 相關通路 KEGG富集分析

2.5 “活性成分－靶點－通路”網絡構建分析選取了 27個活性成分、53個靶點基因和 KEGG通路分析的 15條通路，構建“活性成分-靶點-通路”網絡圖。該網絡共包含 95個節點， 456條邊，見圖 6。

圖6 活性成分-靶點-通路網絡分析圖

2.6 分子對接驗證結合文獻分析選擇排名靠前的基因，選擇 AKT1、MAPK1兩個靶點作為分子用于對接實驗。從PBD數據庫中分別選擇了3O96（AKT1），5NHO（MAPK1）作為對接的蛋白結構。選擇度值較高的化合物Chinensinaphthol，Diphyllin，Taiwanin E，tormentic acid與上述2個靶點蛋白進行分子對接 ;通過文獻分析并結合當前的研究熱點，選取了 ulixertinib、resveratrol分別作為MAPK1、AKT1蛋白靶點的陽性對照藥，以結合能判斷化合物與靶點蛋白的親和力。見表3。

表3 有效成分與核心靶點的分子對接

3 討論

腫瘤已經成為嚴重影響人類生命健康的常見疾病，近年來其發病率和死亡率呈現不斷上升趨勢。中醫學歷史悠久，在研究腫瘤的發生、發展和防治方面已形成了特色鮮明的腫瘤學科體系，在預防腫瘤發生以及減毒增效、抗耐藥、防止復發轉移等方面具有明顯優勢，已成為防治腫瘤疾病不可或缺的重要醫療措施[6]。

本研究發現爵床的主要抗腫瘤活性成分有山荷葉素（Diphyllin）、委陵菜酸（Tormentic acid）、木犀草苷等化學成分。Diphyllin屬于木脂素類化合物，有研究證明具有較好的抗腫瘤活性，且對正常細胞毒性小[7]。Tormentic acid可誘導白血病細胞的凋亡，導致細胞核固縮以及核碎裂，提高了其細胞中Caspase-3的表達水平，促進了細胞色素 C的釋放，表現出明顯的抗腫瘤作用[8]。木犀草苷的低、中、高劑量組對 A431細胞的增殖抑制率上升，遷移和侵襲細胞數均降低。沈琴等[9]研究發現，木犀草苷可抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲 ,可能與其促進 ST7L基因表達有關。

基于 PPI網絡分析可知爵床抗腫瘤的主要靶點為 SRC、Akt1、MAPK1、PIK3R1、PTPN11等。SRC基因是具有內在酪氨酸激酶活性的人類癌基因，SRC蛋白能介導生長因子、黏附因子、趨化因子等多條下游信號通路[10]。研究表明，SRC的過度表達和活化，在調節腫瘤血管生成、細胞增殖、遷移及侵襲等方面起著十分重要的作用[11～13]。MAPK1作為 MAPK家族中的一員，在腫瘤的增殖、分化和侵襲過程中也發揮著十分重要的作用[14，15]。Lei等[16]研究表明，MAPK1的表達上調與多種腫瘤的發生與發展有著十分密切的聯系。

從通路富集結果可知，爵床抗腫瘤的主要通路有PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路、MAPK信號通路等。 PI3KAkt通路可在多種腫瘤中引發細胞生長、上皮間質轉化和血管生成[17]。Hirashima等[18]研究發現PI3K-Akt通路可刺激食管癌增殖、侵襲與轉移，所以激活PI3K-Akt通路可促進食管癌進展。Rap1信號通路調控細胞黏附、遷移及血管生成等，其過程與惡性腫瘤的發生、發展有著非常強的相關性[19，20]。FoxO信號通路與細胞凋亡有著十分密切的相關性，FoxO家族參與線粒體依賴性和非依賴性的凋亡過程，因而激活死亡受體配體的表達[21]。雌激素在肝細胞癌中具有保護性作用，雌激素可抑制炎癥誘導的肝細胞癌發生，其介導各種致癌信號通路的抑制[22～25]。以上研究結果都驗證了雌激素在肝細胞癌發生、發展中具有十分重要的調控作用。

綜上所述，抗腫瘤的作用機制復雜，涉及多個基因與多個信號通路。本研究借助中藥網絡藥理學的方法，初步預測爵床的主要活性成分、靶點與抗腫瘤的相關靶點，為爵床有效成分的篩選及深入研究提供一定科學依據。