乙型肝炎后肝硬化患者外周血免疫指標的水平及臨床意義

邢亞斯 秦方園 楊靜文 翟亞萍

乙型肝炎病毒（HBV）感染人體后，主要通過免疫損害引起肝臟病變。肝硬化是HBV感染后肝病發展的晚期階段。該病并發癥多，且發病率和死亡率均較高，發展成為肝衰竭和肝癌的風險極大[1]。乙型肝炎肝硬化（乙肝肝硬化）的發病機制與HBV感染機體后的一系列免疫反應所致的免疫病理損害相關，多種免疫細胞和細胞因子共同參與了其發生和發展的過程[2]。本研究對慢性乙肝、乙肝肝硬化患者及健康志愿者外周血中淋巴細胞亞群及其血清中細胞因子的水平變化進行了對比，從細胞免疫的角度分析了乙肝肝硬化患者的免疫狀態，為乙肝肝硬化患者的臨床評估和早期干預提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 選擇2017年1月～2018年5月在我院感染科就診的30例慢性乙肝患者（A組），男15例，女15例，平均年齡（45.37±10.28）歲；32例乙肝肝硬化患者（B組），男17例，女15例，平均年齡（48.75±9.43）歲，另選取同期30例健康志愿者作為對照組（C組），男15例，女15例，平均年齡（46.40±13.77）歲。以2015版《慢性乙型肝炎防治指南》及2012版《肝衰竭診療指南》作為診斷標準[3，4]。患者排除其它病原體感染、自身免疫性疾病、酒精性肝病、肝癌、三個月內使用過免疫調節劑或者激素等情況。三組性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究經我院倫理委員會批準，且所有入組患者或家屬簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器 流式細胞術檢測淋巴細胞亞群，標記所用抗體：CD3 FITC、CD4 PE-Cy7、CD8 APC-Cy7、CD45 PerCP-Cy5-5、CD19 APC、CD16+CD56 PE、CD4 FITC、CD25 PE、CD127 APC、CD3 PE-Cy7、CD5 APC、CD19 FITC、HLA-DR APC（BD公司，美國），AimPlex流式多因子檢測試劑盒（曠博生物公司，北京），流式細胞儀（BD公司Canto Plus，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集 清晨采集患者及健康志愿者空腹時肘靜脈血，2ml置于乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）抗凝管中，2ml置于無抗凝劑的采血管中。EDTANa2抗凝管顛倒混勻數次并于2h內進行淋巴細胞亞群的檢測。無抗凝血采集后避免顛倒混勻以免發生溶血，室溫靜置2h，待紅細胞凝固自然析出血清后，取出上清液，置-80℃冰箱保存備檢。采用流式法檢測外周血淋巴細胞亞群比例及細胞因子含量。

1.2.2 淋巴細胞亞群檢測 采用淋巴細胞亞群檢測試劑檢測三組受試者外周血中各細胞亞群百分比，所用試劑及檢測內容見表1。在流式管中分別取相應量的試劑及50μl抗凝血混勻，室溫避光孵育20min，每管中分別加入1ml溶血劑，混勻，室溫避光孵育9min，1 500r/min離心5min,棄上清，加入2ml流式鞘液，1 500r/min洗滌5min，棄上清并加入500μl流式鞘液重懸，立即用流式細胞儀檢測。采用Diva Analysis軟件分析淋巴細胞百分比。

表1 淋巴細胞亞群及其試劑

1.2.3 血清中相關細胞因子的檢測 取出-80℃冰箱保存備用的血清，采用AimPlex流式多因子檢測試劑盒對三組受試者血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、INF-γ、TNF-α七種因子同時進行處理，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，流式細胞儀上機檢測并分析結果。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行分析，A、B、C三組同時符合正態分布的計量資料采用t檢驗，以均數±標準差（±s）表示，三組中有一組或多組不符合正態分布的計量資料采用非參數檢驗，用中位數（四分位數間距）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 B組患者外周血淋巴細胞亞群流式結果通過三種組合Panel檢測乙肝肝硬化患者的外周血淋巴細胞亞群流式結果，見圖1。

圖1 乙肝肝硬化患者外周血淋巴細胞亞群鑒別

2.2 三組外周血中淋巴細胞亞群水平比較B組外周血中淋巴細胞、Th、NK、T、Tc、NKT細胞比例、CD4+/CD8+均低于A組和C組，差異有統計學意義（P＜0.05），A組除Tc細胞較C組稍高，其余指標均低于C組，但只有NK細胞的降低比例較C組差異有統計學意義（P＜0.05），其余差異均無統計學意義（P＞0.05）。B組中B、B1、B2、Treg、活化T細胞比例顯著高于A、C組（P＜0.05），且A組中除B2細胞低于C組，其余指標均較C組升高，但只有Treg細胞及活化T細胞的升高比例較顯著（P＜0.05），見表2。

表2 三組外周血中淋巴細胞亞群水平比較（%）

2.3 三組血清中細胞因子水平的比較外周血血清中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、INF-γ在B組中的含量顯著高于A、C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。TNF-α在B組中的含量顯著高于C組（P＜0.05）,但與A組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A組中IL-6、IL-10、IL-17A、INF-γ與C組相比顯著升高（P＜0.05），而IL-2、IL-4、TNF-α較C組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 三組外周血血清中細胞因子水平比較（pg/ml）

3 討論

宿主免疫調控紊亂是導致肝損傷的主要原因，肝硬化相關的免疫功能紊亂包括一系列的免疫功能異常、免疫缺陷和全身性的炎癥。乙肝肝硬化的病程也與宿主的免疫狀態相關[5]。

T淋巴細胞亞群介導的細胞免疫及細胞因子網絡在免疫調控中起著重要作用。T淋巴細胞主要分為Th、Tc亞群，Th細胞又分為Th1、Th2、Treg和Th17。Th細胞在免疫應答中被抗原激活后誘導細胞免疫和體液免疫，能促進B細胞、Tc細胞及其它免疫細胞的增殖和分化，具有較強的抗病毒作用[6]。Tc細胞包括抑制性T細胞和殺傷性T細胞，其在被細胞因子激活后，產生穿孔素和顆粒酶，將靶細胞破壞，這是HBV感染機體后引起肝細胞損傷的主要原因，也是機體清除細胞內病毒的主要機制[7]。Treg細胞在機體自身耐受的維持中發揮著重要作用，與免疫調節、自身免疫性疾病、移植耐受、腫瘤免疫、乙肝慢性化等相關。B淋巴細胞主要分為B1a、B1b和B2三個細胞亞群，B細胞分泌多種自身抗體及抗病原菌抗體，參與許多自身免疫性疾病和腫瘤的發生。NK細胞是機體重要的執行非適應性免疫反應的免疫細胞，它介導天然的免疫應答，不依賴抗體和補體，能直接殺傷靶細胞，具有抗感染、免疫調節和免疫監視的作用[8]。本研究結果顯示B組患者外周血中總淋巴、T、Th、Tc、NK、NKT細胞比例及CD4+/CD8+均低于A組和C組，差異有統計學意義（P＜0.05），A組中除Tc細胞較C組稍高外，其余指標均低于C組，但只有NK細胞的降低比例較C組差異有統計學意義（P＜0.05），其余差異均無統計學意義（P＞0.05）。提示隨著乙肝病情的進展，患者體內的T細胞和NK細胞的比例逐漸降低，長期的HBV感染可導致機體免疫功能降低，且病情越重免疫功能降低的越明顯，這可能是導致HBV感染慢性化的原因之一[9，10]。B組中B、B1、B2、Treg、活化T細胞比例顯著高于A、C組（P＜0.05），且A組中除B2細胞低于C組，其余指標均較C組升高，但只有Treg細胞及活化T細胞的升高比例較顯著（P＜0.05）。提示HBV感染機體后，B細胞主要發揮體液免疫應答和抗原遞呈作用，B細胞比例的升高，提示B細胞可能參與乙肝肝硬化的進展。Treg細胞是具有免疫抑制功能的T細胞亞群，能負向調節對自身和外來抗原的免疫反應，慢性乙肝和肝硬化患者中Treg細胞比例逐漸升高，認為其可抑制HBV抗原特異性T細胞，從而導致免疫耐受和免疫逃逸而使病毒長期存在，最終致使肝細胞損傷發生[11]。患者機體被HBV抗原刺激后，T細胞及B細胞處于活化狀態。T細胞的活化與病毒的殺傷和清除相關，雖然T細胞處于活化狀態，但慢性乙肝及肝硬化患者中T細胞的比例降低，長期持久的病毒抗原刺激導致T細胞應答能力較弱，故而不能有效清除病毒[12]。而B細胞的活化與體液免疫及肝病的進程相關。HBV感染機體后通過各種病毒抗原激發機體免疫系統使致敏的B細胞轉化為漿細胞，并產生相應抗體，從而對HBV進行反應并殺滅，而在此過程中受感染的肝細胞亦遭到攻擊，使肝細胞受到損傷[13]。有研究報道，外周血B1細胞隨著乙肝轉為慢性乙肝到重癥乙肝最后發展成肝硬化，其水平有逐步升高的趨勢，說明B1細胞可能參與多種肝病的發展過程[14]。

Th細胞中的Th1細胞亞群主要分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ。IL-2能反映機體的免疫狀態，是重要的免疫增強劑，它能刺激T細胞增殖，激活NK和巨噬細胞。TNF-α可增強抗原提呈細胞促進免疫應答的能力，也可產生抗病毒蛋白，起到抑制病毒復制的作用。IFN-γ也具有抗病毒和免疫調節的功能，可激活肝細胞自身抗病毒機制從而抑制HBV DNA的復制[15]。本研究中IL-2、TNF-α和IFN-γ在A組和B組中有所升高，且與C組相比，B組的升高比例更顯著，說明HBV感染機體后，患者體內的T細胞被病毒抗原所激活，使體內的細胞因子含量逐漸升高，這些因子又可使機體產生大量的Tc細胞，從而有利于HBV的清除。但由于T細胞的比例隨著病情的進展逐漸降低，導致其分泌的因子含量不足以抑制和清除病毒，最終導致病毒長期存在和疾病進展。Th2細胞亞群主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，主要作用于B細胞，刺激B細胞的活化并分泌免疫球蛋白，介導體液免疫。IL-4是誘導前體細胞向Th2分化的直接刺激因子，是Th2應答強度的重要衡量指標，王茸等[16]研究表明，IL-4在慢性肝炎、重型肝炎組中呈升高趨勢，說明IL-4升高與HBV感染病情進展及肝硬化、肝癌的發生有關，與本研究中的結果一致。IL-6和IL-10都是具有多種功能的細胞因子[17，18]，HBV感染機體后可刺激單核巨噬細胞產生IL-6和IL-10, IL-6在肝內可以調節許多急性期反應蛋白的合成，同時也是一種與慢性肝病相關的調節因子。IL-10是免疫抑制劑，可通過抑制Th1細胞的增殖及IFN-γ等細胞因子的分泌而抑制機體的抗病毒能力。本研究中乙肝肝硬化患者IL-6水平顯著高于正常人和慢性乙肝患者，說明IL-6與乙肝的慢性化相關，IL-10水平的升高提示其合成的增加限制了機體清除HBV的能力，導致病程的延長。IL-17A是由Th17細胞分泌的一種重要的促炎因子，且與HBV感染后肝臟的炎性損傷密切相關。IL-17A可以動員、募集和激活中性粒細胞，引發嚴重的組織炎癥，并促進自身免疫性疾病的發展[19]。有研究表明血清IL-17A水平的升高，可作為肝損傷嚴重程度的標志物[20]。本研究中IL-17A在乙肝肝硬化患者體內的水平顯著高于正常人和慢性乙肝患者，且慢性乙肝患者中該水平顯著高于正常人，反映了HBV感染機體后，隨著病情進展，患者肝臟的損傷程度進一步惡化，提示IL-17A可做為檢測肝臟損傷程度的重要參考指標。

乙肝肝硬化的發生是一個復雜的過程，免疫系統紊亂在其發病過程中起著重要作用，乙肝肝硬化患者外周血淋巴細胞亞群、血清中細胞因子的水平較正常人及慢性乙肝患者都發生了明顯變化，免疫功能的失調使得乙肝肝硬化的病死率和肝移植風險顯著升高。因此，在乙肝肝硬化發生的早期對其進行診斷，并采取有效的措施進行治療干預，對提高患者的生存質量具有重要意義。