lncRNA HOXA?AS2在胰腺癌組織中的表達及對細胞增殖和侵襲力的影響

陳升陽 陳艷軍 胡水全 程冰冰 仝昊 周百中 李曉勇

鄭州大學第五附屬醫院（鄭州450052）

胰腺癌作為消化系統惡性程度極高的腫瘤類型，發病率呈逐年升高的趨勢［1］，臨床上目前治療該腫瘤主要以手術切除為主，但由于患者發病隱匿，早期尚無有效的診斷手段，多數患者確診時已出現浸潤或轉移，手術根除困難，病死率高，預后差［2］。因此，深入研究胰腺癌發生機制，尋找與其發病和轉移相關靶基因，對其早期診療及改善預后具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）作為一種廣泛存在于機體細胞內的長度在200 nt 以上的RNA 分子，雖本身不具備編碼蛋白功能，但可通過調控表觀遺傳基因、轉錄或轉錄后翻譯等而參與諸多生物學功能［3］，越來越多的研究發現，其在腫瘤組織中出現表達異常［4-5］，參與了腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移［6］。HOXA 簇反義RNA 2（HOXA cluster antisense RNA 2，HOXA?AS2）作為一種與癌癥相關的lncRNA，已發現其在多種惡性腫瘤中異常表達［7］，且與腫瘤惡性進展有關［8］。本研究通過分析胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達，探討其與臨床指標的相關性，并利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術沉默該基因在人胰腺癌PANC?1 和AsPC?1 細胞中表達，觀察其對細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為胰腺癌機制研究提供參考資料。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料選取2015年8月至2020年8月在我院行根治性手術治療的胰腺癌患者，納入標準：（1）術前未接受任何治療；（2）術后病理示胰腺導管癌；（3）臨床病歷資料完整。排除標準：（1）心肝腎等臟器嚴重功能障礙者；（2）合并有其他系統惡性腫瘤者；（3）患有免疫系統疾病或在使用免疫抑制劑治療者。共入選97例，其中，男58例，女39例；年齡41～76 歲，平均（60.62±10.13）歲，腫瘤部位：胰頭55 例，胰體尾42 例；根據第七版TNM 分期標準：Ⅰ-Ⅱ期53 例，Ⅲ-Ⅳ期44 例；分化程度：高分化43 例，中低分化54 例；發生淋巴結轉移46 例。留取胰腺癌和癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣在2 cm 以上）組織，迅速置于液氮中，-70 ℃保存。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑和設備PANC?1 和AsPC?1 細胞購自上海通派生物科技有限公司，RPMI?1640 培養液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司，總RNA 提取試劑（Trizol 法）和Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen 公司，逆轉錄和PCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司，HOXA?AS2 和內參引物由上海生工生物工程公司設計合成，HOXA?AS2 干擾序列和陰性對照序列由上海捷蘭生物技術有限公司設計合成，CCK?8 試劑購自北京鼎盛偉業生物科技有限公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司，基質膠購自美國BD 公司，CFX96 實時熒光定量PCR 儀購自美國Bio?Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 RT?PCR 檢測胰腺癌和癌旁組織中HOXA?AS2 表達將胰腺癌和癌旁組織取出，剪碎，研磨，加入細胞裂解液，使用總RNA 提取試劑（Trizol法）提取總RNA，利用紫外分光光度計檢測其純度和濃度。按逆轉錄試劑盒說明對總RNA 逆轉錄獲得cDNA，并按照PCR 試劑盒試劑盒說明使用實時熒光定量PCR 儀對目的基因擴增。序列：HOXA?AS2：上游：5′?CTGTCTGCGAAGGCCTAAAG?3′，下游：5′?CTAGGTAAGCGCTGCTCCAA?3′；GAPDH：上游：5′?GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG?3′下游：5′?ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT?3′。反應條件：95 ℃2 min，94 ℃30 s，59 ℃20 s，70 ℃40 s，38次循環。使用2-△△Ct法計算組織中HOXA?AS2表達量。

1.2.2 細胞培養和處理將PANC?1 和AsPC?1 細胞用含10%胎牛血清的RPMI?1640 培養液培養，條件：5%CO2、37 ℃，培養液每隔24 h 更換1 次，待細胞融合度在80%以上時，胰酶消化，傳代培養。將對數生長的細胞分為三組：（1）干擾序列（si?HOXA?AS2）組：按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明轉染siRNA 序 列5′?CAAGCUUGACAAGUUCAGCU?CAA?3′：（2）陰性對照（si?Con）組：按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明轉染對照序列5′?GAUUCCCC?GGACUUCUCACAG?3′；（3）空白組：不作任何處理。處理后繼續培養48 h。

1.2.3 RT?PCR 檢測細胞中HOXA?AS2 表達取各組培養48 h 的細胞，用細胞裂解液裂解后，其他操作步驟同1.2.1。

1.2.4 CCK?8 檢測細胞增殖活性將各組細胞消化后，制備成2.5×104/mL 細胞懸液，分別取200 μL接種在96 孔板，每個樣本設復孔5 個，分別在培養12、24、48、72 和96 h 時，將CCK?8 液10 μL 加入各孔，培養120 min，使用酶標儀在450 nm 波長處檢測各孔吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell 法檢測細胞侵襲力用培養液對基質膠進行稀釋后平鋪在Transwell 小室上室，過夜風干。取各組培養48 h 的細胞，消化、用無血清培養液制備成密度為2.5×105/mL的懸液，取200 μL 接種于小室上室，下室則加入含20%胎牛血清培養液600 μL，培養24 h，取出小室，PBS 沖洗3 次，甲醛固定，去除邊緣散落的細胞，0.1%結晶紫染色，倒置顯微鏡觀察，計數穿膜細胞數。重復實驗3 次。

1.3 統計學方法使用SPSS 21.0 軟件分析，計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌和癌旁組織中HOXA?AS2表達HOXA?AS2 在胰腺癌組織中表達量為（2.21 ± 0.20），高于癌旁組織的（1.03 ± 0.14），差異有統計學意義（t=48.030，P＜0.001）。

2.2 胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達與臨床指標的相關性胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達量與年齡、性別和腫瘤大小無關（P＞0.05），而在不同TNM分期、分化程度和是否發生淋巴結轉移差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 細胞中HOXA?AS2 表達PANC?1 細胞中，與si?Con 組和空白組比較，si?HOXA?AS2 組HOXA?AS2表達量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），同樣，AsPC?1 細胞中si?HOXA?AS2 組HOXA?AS2表達量比si?Con 組和空白組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.4 細胞增殖活性PANC?1 和AsPC?1 細胞中，si?HOXA?AS2 組24、48、72 和96 h 時吸光度OD值均低于si?Con 組和空白組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、4。

2.5 細胞侵襲力PANC?1 和AsPC?1 細胞中，si?HOXA?AS2組侵襲細胞數均低于si?Con 組和空白組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5 和圖1、2。

3 討論

胰腺癌作為惡性程度高、病死率高的消化道腫瘤，早期癥狀不典型，且病情進展快，易發生淋巴結和遠處轉移［9］，盡管現有的治療手段不斷進步，但患者總體預后改善有限，5年生存率較低［10］。研究表明［11］，高侵襲轉移性是影響胰腺癌患者預后的獨立風險因素。因此，進一步明確與胰腺癌侵襲轉移相關分子機制，尋找敏感基因對指導患者早期診療具有重要意義。lncRNA 作為近年來研究熱點，已發現其參與了惡性腫瘤發生進展過程［12］，且與腫瘤侵襲轉移關系密切［13］。有研究指出［14］，lncRNA 對胰腺癌發生發展及預后影響顯著，有望為胰腺癌的靶向治療及預后評估提供新的治療靶點和分子標志物。HOXA?AS2作為一種lncRNA，定位于人染色體7p15.2，屬于HOXA 簇成員，與急性髓系白血病發病關系密切［15］，在細胞增殖過程發揮重要作用［16］，參與了非小細胞肺癌惡性進展［17］，且參與了骨肉瘤細胞遷移及侵襲過程［18］。本研究結果顯示，HOXA?AS2 在胰腺癌組織中表達量高于癌旁組織，說明胰腺癌組織中HOXA?AS2 呈高表達，可能與胰腺癌發生相關。TNM 分期Ⅲ-Ⅳ期、中低分化和發生淋巴結轉移胰腺癌患者組織中HOXA?AS2 表達量明顯升高，說明HOXA?AS2 表達量與胰腺癌惡性程度有關，可能是判定患者惡性程度的潛在生物學標志物。

表1 不同臨床指標胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達量比較Tab.1 Comparison on the expression of HOXA?AS2 in pancreatic cancer tissues with different clinical indexes±s

表1 不同臨床指標胰腺癌組織中HOXA?AS2 表達量比較Tab.1 Comparison on the expression of HOXA?AS2 in pancreatic cancer tissues with different clinical indexes±s

指標年齡≥61 歲＜61 歲性別男性女性腫瘤部位胰頭胰體尾腫瘤大小≥2 cm＜2 cm TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期分化程度高分化中低分化淋巴結轉移是 否例數57 40 58 39 55 42 41 56 53 44 43 54 46 51 HOXA?AS2 表達量2.23±0.20 2.17±0.19 2.19±0.21 2.22±0.19 2.18±0.19 2.24±0.21 2.22±0.19 2.19±0.20 2.15±0.18 2.27±0.20 2.12±0.17 2.27±0.19 2.28±0.21 2.14±0.17 t 值1.487 0.775 1.443 0.684 2.941 3.855 3.628 P 值0.140 0.440 0.152 0.496 0.004＜0.001＜0.001

表2 不同組PANC?1 和AsPC?1 細胞中HOXA?AS2 表達量比較Tab.2 Comparison on the expression levels of HOXA?AS2 in PANC?1 and AsPC?1 cells in different groups x±s

表3 不同組PANC?1 細胞不同時點增殖活性Tab.3 The proliferation activities of PANC?1 cells in different groups at different time points ±s

表3 不同組PANC?1 細胞不同時點增殖活性Tab.3 The proliferation activities of PANC?1 cells in different groups at different time points ±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與si?Con 組比較，#P ＜0.05

組別si?HOXA?AS2 組si?Con 組空白組F 值P 值12 h 0.52±0.04 0.48±0.06 0.47±0.06 1.199 0.329 24 h 0.81±0.12*#0.96±0.09 0.94±0.10 3.874 0.044 48 h 1.20±0.03*#1.37±0.12 1.42±0.07 12.620 0.001 72 h 1.33±0.10*#1.68±0.07 1.64±0.06 33.661＜0.001 96 h 1.65±0.11*#1.91±0.07 1.98±0.09 21.403＜0.001

表4 不同組AsPC?1 細胞不同時點增殖活性Tab.4 The proliferation activities of AsPC?1 cells in different groups at different time points ±s

表4 不同組AsPC?1 細胞不同時點增殖活性Tab.4 The proliferation activities of AsPC?1 cells in different groups at different time points ±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與si?Con 組比較，#P ＜0.05

組別si?HOXA?AS2 組si?Con 組空白組F 值P 值12 h 0.37±0.07 0.39±0.08 0.43±0.07 0.864 0.441 24 h 0.62±0.09*#0.81±0.03 0.78±0.08 11.880 0.001 48 h 0.81±0.12*#0.95±0.05 0.97±0.06 6.795 0.008 72 h 1.02±0.10*#1.27±0.16 1.32±0.09 10.768 0.001 96 h 1.25±0.04*#1.61±0.09 1.66±0.13 31.626＜0.001

表5 不同組PANC?1 和AsPC?1 細胞侵襲力比較Tab.5 Comparison on the invasion abilities of PANC?1 and AsPC?1 cells in different groups ±s

表5 不同組PANC?1 和AsPC?1 細胞侵襲力比較Tab.5 Comparison on the invasion abilities of PANC?1 and AsPC?1 cells in different groups ±s

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與si?Con 組比較，#P ＜0.05

組別si?HOXA?AS2 組si?Con 組空白組F 值P 值PANC?1 細胞97.83±9.11*#118.50±10.52 123.83±7.03 13.968＜0.001 AsPC?1 細胞88.00±5.22*#111.67±5.68 113.17±7.47 31.130＜0.001

圖1 不同組PANC?1 細胞侵襲情況（結晶紫染色，×200）Fig.1 Invasion of PANC?1 cells in different groups（crystal violet staining，×200）

圖2 不同組AsPC?1 細胞侵襲情況Fig.2 Invasion of AsPC?1 cells in different groups（crystal violet staining，×200）

有研究［19］指出，HOXA?AS2 通過調控miR?520c?3p/GPC3 軸促進肝癌細胞增殖。WANG 等［20］則指出，HOXA?AS2 通過調節miR?125b/Smad2 軸促進膀胱癌的遷移和侵襲。本研究利用siRNA 技術特異性沉默PANC?1 和AsPC?1 細胞中HOXA?AS2 表達，結果顯示，兩種細胞中si?HOXA?AS2 組中HOXA?AS2 表達量明顯降低，說明細胞中HOXA?AS2 表達被成功抑制。本研究結果顯示，PANC?1 和AsPC?1細胞中，si?HOXA?AS2 組24、48、72 和96 h 時吸光度OD 值均低于si?Con 組和空白組，說明沉默細胞中HOXA?AS2 表達細胞增殖活性被明顯抑制，提示HOXA?AS2 可能參與了胰腺癌細胞增殖過程。本研究結果顯示，PANC?1 和AsPC?1 細胞中，si?HOXA?AS2 組侵襲細胞數均低于si?Con 組和空白組，說明沉默細胞中HOXA?AS2 表達細胞侵襲能力被抑制，HOXA?AS2 可能參與了胰腺癌細胞侵襲過程。

綜上所述，HOXA?AS2 在胰腺癌組織中表達量升高，且與惡性進展臨床指標相關，沉默其表達可減少細胞增殖、抑制細胞侵襲力，但具體機制有待進一步研究明確。