犬瘟熱病毒N基因克隆及生物信息學分析

鄭慶禮 潘書磊 劉秉琿 福建農業職業技術學院動物科學學院 福州 350119

犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）可感染多種動物，可導致80%病死率[1]。該病毒可感染犬科類、鼬科和浣熊類動物，近年來發現大熊貓也可感染[2]。犬瘟熱主要發生于5月齡以下，臨床癥狀表現復雜多樣，主要癥狀包括白細胞減少、雙相熱、咳嗽流鼻涕和腹瀉便秘等，某些病例還可能會出現共濟失調、肌肉強直等神經癥狀[3-4]。CDV是副粘膜病毒科RNA病毒，全基因組大約包含16689 bp，存在6個結構蛋白，其中N基因編碼的N蛋白已被證明在疾病的轉錄和復制過程中起著十分關健的作用，同時是比較保守的免疫原性蛋白，可以有效誘導機體產生中和抗體[5-7]。目前還未見有人對CDV的N基因進行清晰的生物信息學分析，因此本文通過臨床病料分離CDV，并把該病毒的N基因克隆測序后進行相關生物信息學分析，為今后N基因抗原多表位疫苗的研究提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品 臨床送檢犬瘟熱病料。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑有病毒RNA提取試劑盒，基因克隆試劑盒，高保真PCR mix（購自北京全式金生物技術有限公司），反轉錄試劑盒（購自Promega生物科技有限公司）。主要儀器有PCR擴增儀（T100，購自伯樂Bio-Rad），水平電泳系統（DYCZ-24KS，購自北京六一生物科技有限公司）。

1.3 引物的設計與合成 根據NCBI上GenBank公布的CDV核酸序列(AB932517.1)，利用Oligo7設計特異性常規引物CDV-Ngene F:atggctagccttctcaagag；CDV-Ngene R:gtagctctctatcattatagacaggag，引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.4 CDV核酸提取及N基因克隆 根據操作說明書提取病料RNA，將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，合成引物為模板進行PCR擴增，擴增體系見表1。將擴增結果凝膠電泳并拍照保存。

表1 PCR擴增反應條件及體系

對PCR產物根據操作說明進行膠回收純化，將PCR產物與pEASY-T1克隆載體室進行連接。連接結束后將載體轉入DH5a感受態細胞中并置于LB瓊脂平板培養過夜。第2 d挑菌進行PCR鑒定，將鑒定正確的PCR產物送上海生物工程技術有限公司測序。

1.5 CDV N基因生物信息學分析 利用DNA Star、DNA MAN對CDV N基因進行遺傳進化樹和同源性分析；利用DNAMAN分析CDV N基因親疏水性，跨膜性和抗原位點；利用利用在線軟件GOR4預測蛋白質二級結構(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.Pl page=npsa_gor4.html)；利用Net-NG-Lyc1.0和NetPhos 2.0在線分析軟件預測N-糖基化位點和磷酸化位點；利用SWISS-MODEL在線軟件預測CDV N基因的三級結構(https://swissmodel.expasy.org/interactive)。

2 結 果

2.1 CDV N基因PCR擴增結果 根據凝膠電泳結果顯示，在1572 bp左右位置出現明顯的特異性條帶（見圖1），與預期相符合。

圖1 CDV基因PCR擴增結果

2.2 CDV N基因遺傳進化樹及同源性分析 將CDV N基因克隆測序，將測序結果命名為FJ-CDVN gene并與NCBI庫的參考序列構建遺傳進化樹及進行同源性分析，分析結果表明（見圖2-圖3）：測序得到的FJ-CDV-Ngene株與11株參考序列同源在96.9%～99.2%，其中與HM596310.1的同源性最高，同源性為99.2%，與MT136724.1的同源性最低，同源性為96.9%。

圖2 CDV基因PCR擴增結果

圖3 FJ-CDV-Ngene株同源性分析

2.3 CDV N蛋白N-糖基化及磷酸化位點預測利用NetNGlyo1.0在線分析軟件對CDV N蛋白氨基酸序列進行分析，分析結果顯示該蛋白不存在N-糖基化位點。利用Netphos2.0在線軟件分析結果顯示（見圖4），CDV N基因氨基酸序列存在32個絲氨酸位點，分別位于第3,7,75,78,83,98,122,125,169,191,228,243,290,298,325,328,355,372,377,395,399,414,422,439,465,469,471,489,504,509,512,513位點；存在15個蘇氨酸位點，分別位于9,14,115,200,290,272,279,294,347,402,409,434,460,500,508位點；存在5個酪氨酸位點，分別位于199,260,306,311,516位點。

圖4 CDVN蛋白磷酸化位點預測

2.4 CDV N蛋白親疏水性及跨膜結構分析 利用DNAMAN對CDV N蛋白氨基酸序列進行親疏水性分析，結果顯示該蛋白親水性及疏水性主要分布區間為-4～4，親水氨基酸明顯多于疏水氨基酸，占據了該蛋白的主要成分（見圖5-A）。跨膜分析結果顯示（見圖5-B），N蛋白存在4個跨膜片段，跨膜區域分別為：第29-52aa，多肽長度為24aa；第66-85aa，多肽長度為20aa；第172-196aa，長度為25aa；第249-277aa，長度為29aa。

圖5 CDV N蛋白疏水性及跨膜結構分析

2.5 CDV N蛋白二級結構預測 二級結構預測結果顯示（見圖6），CDV N蛋白氨基酸序列由α-螺旋結構、β-折疊和隨機卷曲三種結構組成。其中α-螺旋結構占比為33.84%，β-折疊占16.44%，無規則卷曲結構占49.72%。

圖6 CDV N蛋白二級結構預測

2.6 CDV N蛋白三級結構預測 在SWIS-MODEL數據庫中匹配到CDV N蛋白的模板（見圖7-A），CDV N蛋白與模型蛋白的同源性為54%（見圖7-B），N蛋白的QMEAN為-1.69（見圖7-C）。CDV N蛋白氨基酸與模型氨基酸的對應序列見圖7-D，從建模結果得知CDV N蛋白的三維結構與預測結果基本一致。

圖7 CDV N蛋白三級結構預測

2.7 CDV N蛋白抗原位點分析 利用DNAMAN對CDV N蛋白進行抗原位點分析，結果顯示該蛋白共含有22個抗原位點，最大分值為1.225（見表2）。

表2 CDV N蛋白抗原位點分析

3 討論

生物信息學分析是利用計算機對基因編碼的蛋白結構進行預測，是現代分子生物學重要的研究方法之一。CDV N基因編碼的N蛋白具有良好免疫原性，能夠誘導機體產生細胞免疫和體液免疫。N基因同源性分析發現。經親疏水性預測，發現N蛋白親水作用較強，因此推測該蛋白可溶于水中。蛋白質磷酸化修飾與DNA損傷修復、轉錄、信號傳導、細胞凋亡等生物學過程相關，通過研究蛋白質磷酸化可闡述多種生物學過程機理[8]。磷酸化主要指肽鏈中有絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的側鏈被修飾，經過生物學軟件分析可知N蛋白存在32個絲氨酸位點，15個蘇氨酸位點，5個酪氨酸位點，為今后研究該蛋白的相關生物學過程機理奠定前期基礎。糖基化能改變多肽構象，因而增加蛋白質的穩定性[9]。對N蛋白進行生物信息學分析，發現該蛋白不存在糖基化位點，無糖基化位點對該蛋白穩定的影響還有待進一步研究。通過對N蛋白的跨膜域分析顯示存在4個跨膜域，推測該蛋白有可能作為膜受體起作用或離子通道蛋白。蛋白質不同的二級、三級結構對其功能起著至關重要作用，通過對N蛋白分析發現該蛋白二級結構主要是由無規則卷曲構成，并在數據庫中找到與該蛋白相似的模型結構。抗原肽一般指具有免疫原性的多肽或抗原衍生肽，對動物免疫功能具有重要意義[10-11]。經分析，CDV N蛋白有22個抗原位點，具有豐富的抗原位點，為今后多抗原表位篩選做好前期工作基礎。

本研究通過對CDV N基因進行生物學分析，為進一步對CDV N相關功能及機理的闡釋及研究提供前期理論基礎。