黑水虻(Hermetia illucens L.)幼蟲脂肪抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的體外增殖

吳芷慧，劉元，胡文鋒，曹永長*

(1. 中山大學生命科學學院，有害生物控制與資源利用國家重點實驗室,廣東 廣州 510006;2. 華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；3. 廣州無兩生物科技有限公司，廣東 廣州 510640)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于套式病毒目(Nidovirales)動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)，是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，是豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)的病原。感染PRRSV的豬群會出現持續且嚴重的呼吸道疾病，體重和生長性能下降，母豬出現繁殖障礙[1]。PRRSV的感染具有免疫抑制、抗體依賴性增強、多毒株混合感染和繼發感染等特征，畜群持續帶毒，再加上PRRSV基因組和抗原的不斷變異，傳統PRRSV疫苗免疫效果不理想，難以控制和根除PRRSV在豬場的存在和流行。

目前對抗PRRS的另一條思路是尋找抗病毒藥物[2]。PRRSV是囊膜病毒，入侵細胞需要經過膜融合的過程[3]，因此通過使用阻斷膜融合的藥物，可以阻止病毒入侵細胞。分子結構中同時具有親水端和疏水端的一類分子，可以插入囊膜，影響囊膜曲度或造成囊膜瓦解，從而阻斷病毒囊膜和細胞的膜融合。Thormar等[4]研究發現，飽和中鏈脂肪酸、不飽和長鏈脂肪酸及它們的單甘油酯可以插入病毒囊膜，導致囊膜病毒瓦解。Yuan等[5]研究表明，脂肽表面活性素(surfactin)可以插入豬流行性腹瀉病毒(PEDV)囊膜，通過影響囊膜曲度，抑制囊膜與細胞膜的融合，自助口服脂肽可以更好地抵抗PEDV。動物試驗證明，仔豬口服脂肽可以更好地抵抗PEDV的感染。張西奎[6]動物試驗顯示，給PRRSV陽性母豬飼喂月桂酸單甘油酯，可以提高繁育和生長性能。

黑水虻(black soldier fly,HermetiaillucensL.)幼蟲脂肪中富含月桂酸(C12：0)，含量可超過30%，具有抗囊膜病毒的潛能[7-8]。動物試驗亦已證明，黑水虻幼蟲蟲粉代替血漿蛋白粉和魚粉用于保育豬飼養的可行性[9]。本研究將探究黑水虻幼蟲脂肪的抗PRRSV能力及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 黑水虻幼蟲脂肪的獲取

黑水虻新鮮幼蟲由華南農業大學食品學院胡文鋒副教授提供。黑水虻新鮮幼蟲清洗干凈，干燥粉碎后，用連續相變萃取裝置提油，毛油經去除固體雜質、脫膠、脫酸，得到精煉黑水虻幼蟲脂肪[10]。常溫密封避光保存；或置于-20 ℃冰箱，密封避光長期保存。

1.2 細胞和病毒

Marc-145細胞(非洲綠猴胚胎腎細胞)生長并維持在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)在Marc-145細胞上增殖培養，并保存于-80 ℃。

1.3 黑水虻幼蟲脂肪的水解和乳化

用豬胰脂肪酶對黑水虻幼蟲脂肪進行酶解消化。20 mg/mL豬胰脂肪酶與等體積黑水虻幼蟲脂肪混合，37 ℃搖24 h。常溫6 000 r/m離心5 min，分離油相，得到水解黑水虻幼蟲脂肪。向水解黑水虻幼蟲脂肪中加入3% Span-80，ddH2O中加入3% Tween-80，振蕩搖勻。脂肪與水的體積比為1∶4，分散機攪拌5 min，得水解黑水虻幼蟲脂肪乳化液。微波爐高火微波30 s滅菌。乳化液中水解黑水虻幼蟲脂肪濃度記為200 mg/mL。

將黑水虻幼蟲脂肪和水解黑水虻幼蟲脂肪乳化液(BSFLh)送至中國廣州分析測試中心，檢測其脂肪酸組成。

1.4 月桂酸單甘油酯水溶液和乳化劑水溶液的制備

稱取1 g月桂酸單甘油酯(GML)溶于4 mL無水乙醇，加入3% Span-80。配制含3% Tween-80的ddH2O，往水中4∶1加入月桂酸單甘油酯-無水乙醇溶液，攪拌5 min。月桂酸單甘油酯水溶液成品為澄清溶液。微波爐高火微波30 s滅菌，保存在37 ℃，用于細胞試驗。

向ddH2O中加入3% Tween-80和0.6% Span-80，振蕩搖勻，即得乳化劑水溶液。

1.5 細胞毒性檢測

在96孔板中接種Marc-145細胞，待測藥物(BSFLh、GML或乳化劑水溶液)用細胞維持液梯度稀釋，每孔加100 μL，孵育24 h，吸出上清，用PBS緩沖液清洗3遍后，加入100 μL含10% CCK-8溶液的DMEM培養基，培養箱中孵育1 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.6 病毒增殖抑制

在12孔板中接種細胞懸液，放在培養箱(37 ℃、5% CO2)中培養至細胞完全匯合，棄上清，加入感染比(MOI)為1病毒液，37 ℃孵育1 h，棄上清，用適量PBS清洗3遍，加入培養基，在37 ℃繼續培養至相應時間點。

PRRSV在Marc-145細胞上增殖的過程如圖1A所示，分為4個階段：感染前、吸附、侵入和復制階段。在感染前，PRRSV放置于4 ℃，Marc-145細胞處于37 ℃培養箱；在吸附階段，將PRRSV添加到Macr-145細胞上，4 ℃孵育30 min，PRRSV吸附在Macr-145細胞上但未侵入細胞；在侵入階段，將添加了PRRSV的Marc-145細胞置于37 ℃孵育1 h，使得以PRRSV侵入細胞；在復制階段，培養液上清中的游離PRRSV被清除，侵入Marc-145細胞的PRRSV開始增殖。

為了研究BSFLh在哪個階段抑制PRRSV增殖，階段抑制試驗設計了8個BSFLh添加模式，如圖1B所示。模式1全程不加BSFLh，為對照組，模式2全程加BSFLh，模式3在細胞感染前和吸附階段加BSFLh，模式4在細胞感染前加BSFLh，模式5在病毒感染前和吸附階段加BSFLh，模式6在吸附階段加BSFLh，模式7在侵入階段加BSFLh，模式8在復制階段加BSFLh。

A. PRRSV在Marc-145細胞上增殖的過程區分為4個階段；B. 階段抑制試驗8個加藥模式，分別為模式1～模式8，加藥開始和結束如雙向箭頭所標注

1.7 細胞RNA的提取和逆轉錄

收集了細胞的TRIZOL裂解液中加入100 μL氯仿，充分振蕩，室溫靜置5 min后4 ℃ 12 000g離心15 min。吸取上層清液到新的1.5 mL RNase-free EP管中，加入等體積預冷的異丙醇，充分混勻后靜置10 min，4 ℃ 12 000g離心10 min。棄上清，加入1 mL預冷的75%乙醇清洗RNA沉淀，4 ℃ 7 500g離心5 min。棄上清， RNA沉淀干燥至無色透明，加入適量DEPC水使沉淀溶解，即獲得細胞總RNA。cDNA的合成按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover說明書進行。

1.8 實時定量熒光PCR(RT-qPCR)

RT-qPCR按翊圣生物qPCR試劑盒Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)說明書進行操作。每一個樣品設3個重復孔，在LightCycler 480 Ⅱ儀上進行反應。反應條件為：預變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，10 s，退火58 ℃，20 s，延伸72 ℃，20 s，40個循環；溶解曲線：95 ℃，5 s，65 ℃，1 min，97 ℃，10 min，40 ℃，10 s。設置細胞GADPH作為內參基因，用相對定量法分析基因的mRNA水平。qPCR引物序列如表1所示。

表1 qPCR所用引物及其序列

2 結果與分析

2.1 水解黑水虻幼蟲脂肪乳化液的理化性質

檢測黑水虻幼蟲脂肪經水解、乳化處理后理化性質是否有顯著改變，測算脂肪酶水解前后黑水虻幼蟲脂肪的酸值。未水解黑水虻幼蟲脂肪的酸值為1.21 mg/g，水解后酸值為81.48 mg/g，說明黑水虻幼蟲脂肪經水解后產生大量游離脂肪酸。

檢測黑水虻幼蟲脂肪水解、乳化前后脂肪酸組成的改變，結果見表2。水解、乳化操作對黑水虻脂肪中含量大于1%的脂肪酸變異小于3%，認為水解、乳化操作對黑水虻幼蟲脂肪的肪酸組成無顯著影響。該批黑水虻脂肪的脂肪酸組成月桂酸(C12：0)和油酸(C18：1)含量最高，均達到22%以上；其次為棕櫚酸(C16：0)和亞油酸(C18：2)，含量在18%～20%之間。

表2 水解、乳化前后黑水虻幼蟲脂肪中脂肪酸組含量 %

2.2 水解黑水虻幼蟲脂肪乳化液抑制PRRSV的感染

要驗證BSFLh是否具有抑制PRRSV感染的活性，首先需要驗證BSFLh對Marc-145細胞是否具有細胞毒性。向Marc-145細胞中加入不同濃度(62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)的BSFLh，對照組不加BSFLh，培養24 h，進行CCK8試驗并繪制細胞活力曲線，結果如圖2所示。BSFLh濃度的升高會導致Marc-145細胞活力的下降，當BSFLh濃度不高于500 μg/mL時，其細胞活力與對照組細胞活力(100%)相比沒有顯著差異。

BSFLh各試驗組與對照組相比，***表示P≤0.001，****表示P≤0.000 1。下同

為了驗證BSFLh抑制PRRSV感染的活性，在PRRSV感染Marc-145細胞全程加入BSFLh(加藥模式2)，濃度分別為0 μg/mL、250 μg/mL和500 μg/mL，在3 h、6 h、12 h和24 h收取細胞樣，并用實時定量PCR檢測PRRSV N基因在RNA水平，單因素方差分析計算差異，結果如圖3所示。含有BSFLh 250 μg/mL和500 μg/mL的試驗組在所有時間點，RNA水平較對照組均顯著降低，說明PRRSV的增殖被BSFLh抑制。

A.3 h；B.6 h；C.12 h；D.24 h

2.3 BSFLh抑制PRRSV增殖前期

通過分階段加藥試驗探究BSFLh抑制PRRSV增殖的機制。BSFLh的濃度為500 μg/mL，收樣時間分別為3 h和6 h，用熒光定量PCR檢測PRRSV N基因的變化，結果如圖4所示。模式3(在細胞前處理和吸附階段加藥)、模式5(在病毒前處理和吸附階段加藥)、模式6(在吸附階段加藥)這3個模式的RNA水平在3 h和6 h較對照組均顯著下降；模式4(在細胞前處理階段加藥)和模式7(在侵入階段加藥)的RNA水平，在3 h時較對照組無顯著差異，在6 h時顯著低于對照組；模式8(在復制階段加藥)RNA水平在3 h和6 h較對照組均無顯著差異。上述結果說明，BSFLh抑制PRRSV增殖作用是在抑制PRRSV增殖的前期，尤其是吸附階段產生，在PRRSV增殖的后期無法抑制，當病毒已經進入細胞并開始復制，培養基中添加BSFLh無法對PRRSV的增殖起抑制作用。

A. 收樣時間為處理3 h；B. 收樣時間為處理6 h;加藥模式2～模式8分別與加藥模式1(對照組)進行比較，*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，****表示P≤0.000 1

2.4 探究BSFLh的有效成分

為了排除乳化劑本身對試驗造成的影響，比較了含有相同濃度乳化劑的BSFLh和乳化劑水溶液(emu)對PRRSV增殖的影響，用CCK8檢測emu對Marc-145細胞的細胞毒性，結果如圖5所示。與BSFLh相比，emu對Marc-145細胞的細胞活力無顯著影響。

橫坐標所標濃度表示BSFLh中水解黑水虻幼蟲脂肪的濃度，相同橫坐標，BSFLh和emu中乳化劑含量相同； **表示P≤0.01，****表示P≤0.000 1。下同

在PRRSV感染Marc-145細胞全程加入250 μg/mL BSFLh或含乳化劑的emu(加藥模式2)后，3、6、12和24 h檢測N基因RNA水平，比較含有等濃度乳化劑的BSFLh和emu對PRRSV增殖的影響，結果如圖6所示。 含等濃度乳化劑(加藥模式2)的emu組的N基因RNA水平在3 h與對照組相比無顯著差異，在6 h、12 h和24 h顯著降低；含與emu組相同濃度乳化劑的BSFLh組的RNA水平在所有時間點顯著低于emu組，表明BSFLh組對PRRSV增殖的抑制效果較emu組更強。試驗結果說明，水解黑水虻幼蟲脂肪乳化液抑制PRRSV增殖的能力來自于水解黑水虻幼蟲脂肪和乳化劑。

各組分別與對照組(NC)進行比較并通過單因素方差分析計算顯著性，同時間點收樣的BSFLh組和emu組通過雙尾t檢驗計算顯著性。ns表示P>0.05

月桂酸在黑水虻幼蟲脂肪的脂肪酸組成中含量最高(表2)，黑水虻脂肪補充動物消化吸收過程中，主要以月桂酸單甘油酯和游離月桂酸的形式存在。為探究了月桂酸單甘油酯對PRRSV增殖的影響，以驗證月桂酸單甘油酯是黑水虻幼蟲脂肪抑制PRRSV增殖的原因。以驗證月桂酸單甘油酯是黑水虻幼蟲脂肪抑制PRRSV增殖的原因。向Marc-145細胞中分別加入濃度4、8、16、32和64 μg/mL的月桂酸單甘油酯后，培養24 h，進行CCK8試驗并繪制細胞活力曲線，結果如圖7所示。當培養液中月桂酸單甘油酯含量不超過16 μg/mL時，月桂酸單甘油酯對Marc-145細胞的細胞活力沒有顯著影響。

不同濃度GML試驗組與NC組相比

PRRSV在Marc-145細胞上增殖的全程以加藥模式2加入濃度分別為0(對照組)、16 μg/mL、8 μg/mL的月桂酸單甘油酯后，對3 h、6 h和12 h收取的細胞RNA樣品，經實時定量PCR檢測PRRSV N基因水平，并進行單因素方差分析，結果見圖8。在3個時間點，含不同濃度月桂酸單甘油酯的試驗組N基因水平與對照組相比均無顯著下降，反而在6 h和12 h時出現了顯著上升。說明該條件下的月桂酸單甘油酯無法抑制PRRSV的增殖。

A. GML作用PRRSV 3 h；B. GML作用PRRSV 6 h；C. GML作用PRRSV 12 h；與NC組相比，*P≤0.05，***P<0.001

3 討論

PRRSV是一種具有囊膜的RNA病毒，可以感染各年齡段豬群。感染豬群會出現程度不一的呼吸道疾病并導致生長性能下降，母豬出現繁殖障礙。由于PRRSV的感染具有免疫抑制、抗體依賴性增強的特點，再加上變異毒株的不斷出現，傳統的PRRSV疫苗不足以防控PRRSV的傳播。因此抗病毒藥物的開發具有重要意義。

前人針對囊膜病毒的研究表明，人乳汁中的脂質在嬰兒腸胃中經脂蛋白脂肪酶水解后，脂肪酸和其他產物對囊膜病毒具有顯著抑制作用[4]。其中，長鏈不飽和脂肪酸和中鏈飽和脂肪酸，尤其是月桂酸(C12：0)和豆蔻酸(C14：0)，對囊膜病毒的抑制最為顯著。癸酸單甘油酯和月桂酸單甘油酯對囊膜病毒抑制作用比游離癸酸(C10：0)和月桂酸更強，起效濃度僅為后者的1/10；而豆蔻酸單甘油酯抑制囊膜病毒的效果相對較弱。長鏈飽和脂肪酸和短鏈脂肪酸則幾乎沒有抗囊膜病毒作用。脂肪酸及其單甘油酯對囊膜病毒的抑制作用主要是通過插入病毒囊膜、破壞囊膜結構達成。往人乳汁或嬰兒配方奶粉中添加中鏈脂肪酸或單甘油酯，可以提高它們的抗病毒活性[10]。

黑水虻是一種新興資源昆蟲。黑水虻幼蟲干制后可以用于動物飼料的額外營養添加，一定程度上可以取代目前廣泛使用的魚粉和血漿蛋白粉[8]。月桂酸在黑水虻幼蟲脂肪酸組成中含量最高，最高時可占總脂肪酸組成的約40%，其次是豆蔻酸、棕櫚酸、油酸和亞油酸[6-7,11]。根據黑水虻幼蟲脂肪的這種特性，推測黑水虻幼蟲脂肪與母乳一樣，其代謝產物在一定濃度下同樣具有破壞病原膜結構、抑制病原體內增殖的作用，并在體外進行了水解黑水虻幼蟲脂肪抑制PRRSV增殖的試驗。

在研究BSFLh在體外對PRRSV的抑制作用中，發現在細胞安全濃度下，BSFLh對PRRSV具有顯著抑制作用。分階段加藥抑制試驗表明，BSFLh主要在PRRSV侵入細胞前起抑制作用，PRRSV侵入細胞后加藥無法抑制病毒的增殖。這與前人研究中的描述(脂肪酸及其單甘油酯抗囊膜病毒主要是通過插入病毒囊膜破壞囊膜結構)是吻合的。因此推測，在PRRSV侵入細胞前，添加BSFLh可對暴露在細胞外的病毒粒子的囊膜造成破壞，抑制PRRSV與細胞的膜融合；在PRRSV侵入細胞后，細胞安全濃度下的BSFLh無法對細胞內的病毒造成影響，因此無法抑制PRRSV的增殖。

為了模擬油脂消化后的狀態，試驗中的黑水虻幼蟲脂肪經過了水解和乳化。脂肪酶水解后的酸值檢測表明，游離脂肪酸主要存在于油相中(數據未展示)，因此必須通過添加乳化劑對其進行水包油乳化，方能使其均勻分布于水相的細胞培養液或維持液。然而，乳化劑本身化學組成與結構令其同樣具備插入并破壞膜結構并抑制囊膜病毒的能力，為了區分乳化劑和水解黑水虻幼蟲脂肪的作用，本研究比較了乳化劑水溶液和BSFLh的抑制效果。結果和預測一致，乳化劑具備抑制PRRSV的作用，但含有相同濃度乳化劑的BSFLh對PRRSV的抑制效果顯著更強，說明水解黑水虻幼蟲脂肪本身對PRRSV增殖的抑制作用是確實存在的。

給PRRSV陽性母豬飼喂月桂酸單甘油酯3個月，母豬發情率大大提高，產仔數提高，死胎比例大大降低，斷奶率提高8%，保育豬的生長速度和成活率都有提高[9]。在椰子油中，月桂酸約占總脂肪酸組成的45%～53%。在斷奶仔豬的日糧中添加蒸餾椰子脂肪酸鈉鹽，減少了斷奶仔豬腸道中致病菌的定植數，有利于腸道健康，改善了仔豬的生產性能[12-13]。但本研究在細胞安全濃度下，月桂酸單甘油酯沒有抑制PRRSV在Marc-145細胞中的增殖，相反，還起到了促進作用。究其原因，月桂酸單甘油酯可能無法抑制PRRSV的增殖，抑制PRRSV增殖的是黑水虻幼蟲脂肪中的其他成分。Issacs等[10]的研究發現，月桂酸單甘油酯抑制呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的效果較差，說明月桂酸單甘油酯不是對所有囊膜病毒都能起到良好抑制作用，其機制還需要進一步探討。另外一個可能原因是，Marc-145細胞對月桂酸單甘油酯耐受較低，可能月桂酸單甘油酯對PRRSV起抑制效果需要更高的濃度。除此以外，也可能是因為本試驗中月桂酸單甘油酯以無水乙醇作為溶劑，而無水乙醇影響了細胞或病毒的正常增殖。本研究中月桂酸單甘油酯在Marc-145細胞上的細胞安全濃度為16 μg/mL，而在Thormar等[4]的研究中，月桂酸單甘油酯抑制水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和I型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1，HSV-1)的有效濃度為250 μg/mL。

綜上，水解黑水虻幼蟲脂肪可抑制PRRSV在細胞上的增殖。在對PRRSV進行進一步增殖抑制試驗后發現，抑制作用主要發生在病毒侵入細胞前。月桂酸單甘油酯可能不是水解黑水虻幼蟲脂肪抑制病毒增殖的主要原因。