海蜇病原菌輪蟲弧菌的分離及鑒定

高楊

摘 要：海蜇生長階段分為螅狀體、碟狀體、水母體三個階段。海蜇潰爛病主要發生在水母體階段。從傘部凹陷、潰爛的海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）體內分離到3株優勢菌株DS2020072901、DS2020072902、DS2020072903。通過全自動細菌分析儀及16S rDNA基因序列同源性分析鑒定，分別為溶藻弧菌、副溶血弧菌、輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）。其中輪蟲弧菌為首次在患病海蜇中分離得到，初步判定為致病菌。人工感染試驗確定了海蜇潰爛病的病原菌為輪蟲弧菌。藥敏分析結果顯示，該菌株對氟苯尼考、多西環素、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等抗生素敏感。

關鍵詞：海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）;輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）;藥敏試驗

海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）是海水立體生態養殖模式中重要的養殖生物，具有較高的營養價值和藥用價值。隨著養殖環境的惡化，近年來海蜇病害日益嚴重，疾病成為制約海蜇養殖健康發展的關鍵因素[1]。海蜇易發生的病害有氣泡病、長脖、平頭、萎縮、頭部潰爛、爛邊、鲺病、小蝦附著等[1-4]。輪蟲弧菌作為水產養殖病害新發病原[5]，可引起青蟹幼體、半滑舌鰨、許氏平鲉等養殖品種的皮膚潰瘍癥。作者通過對丹東東港市某立體養殖池患病的海蜇傘體部和口腕部進行細菌分離與鑒定， 16s rDNA序列分析，感染試驗和藥敏試驗，分析影響海蜇生長和病害發生的原因，為海蜇的健康養殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年7月29日，東港市某立體養殖池海蜇出現傘部凹陷、潰爛等癥狀（見封三，圖1）。患病海蜇傘蓋下充滿棕黃色黏液，游動緩慢，緊貼池邊游動，頂網，影響生長。

1.2 試驗方法

1.2.1 肉眼檢查及剖檢 將患病海蜇通過肉眼觀察體表癥狀，解剖傘體部和口腕部，對胃腔、中膠層和口柱進行鏡檢，并記錄。

1.2.2 細菌分離 在無菌條件下，用接種環穿刺挑取海蜇的胃腔、中膠層和口柱， 用接種環接種于2216E瓊脂海水培養基和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）培養基上[1]，劃線分離，28 ℃恒溫培養箱培養24 h，挑取優勢菌的單菌落，在胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）平板上純化培養。將純化后的分離株在常溫和低溫（-80 ℃）下保種。

1.2.3 細菌鑒定

1.2.3.1 分子生物學鑒定 對分離菌株進行常規16s rDNA基因序列鑒定，將得到的產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對。選取同源性較高的序列，采用 Clustal X 1.83軟件進行多重序列比對分析，并通過MEGA 6軟件采用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.3.2 生化鑒定 采用法國生物梅里埃公司生產的微生物自動分析系統進行生化特征分析。

1.2.4 人工感染試驗 試驗用海蜇為東港地區某立體養殖池健康海蜇10尾，體重400～500 g，暫養于四個200 L水族箱中，溫度控制在18 ℃，充氣增氧。試驗組與對照組各10 L水體分別放入3尾海蜇，采用浸泡感染方法，每組采用致病菌的菌懸液濃度約107cfu/mL，對照組加入同等體積培養基。觀察記錄發病癥狀及死亡情況。

1.2.5 藥敏試驗 對所分離并經鑒定的致病菌株，采用瓊脂擴散紙片法（K-B）進行對常用抗菌類藥物的敏感性測定。

2 結果與分析

2.1 菌株形態特征

在海蜇的胃腔和口柱內分離獲得3株優勢菌，分別編號為DS2020072901、DS2020072902和DS2020072903。菌落呈淡黃色、圓形、濕潤;表面光滑、不透明;菌落直徑1.5～2 mm，其中DS2020072901菌落形狀呈彌散型。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察均為革蘭氏陰性菌。

2.2 菌株的生理、生化鑒定

由全自動細菌分析儀對病原菌的生理生化檢測結果可知，3株菌初步鑒定為弧菌屬細菌。

2.3 菌株16s rDNA基因序列分析及致病菌株系統發育樹的構建

將分離菌所擴增的16s rDNA基因序列進行BLAST比對結果顯示，從胃腔和口柱內分離出的菌株 DS2020072901、DS2020072902和DS2020072903分別為溶藻弧菌、副溶血弧菌和輪蟲弧菌。由于溶藻弧菌和副溶血弧菌在健康海蜇上均分離得到過，因此初步判斷輪蟲弧菌為該病的致病菌。從胃腔和口柱內分離出的菌株DS2020072903的基因與輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）相應基因的相似率達99%。將致病菌所擴增的16s rDNA基因序列提交到GenBank，獲得序列號為MW990094，所構建的系統發育樹見圖2，致病菌株與輪蟲弧菌聚為一支。

2.4 人工感染試驗

試驗組的5尾海蜇感染后的4～5 d死亡2尾，發病3尾，解剖觀察，對發病海蜇進行細菌分離與鑒定，結果與原致病菌一致 。

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，該菌株DS2020072903對氟苯尼考、多西環素、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等抗生素敏感，對青霉素、制霉菌素耐藥（表1）。不同菌株間耐藥差異不明顯。

3 討論

本文首次報道引起海蜇頭部潰爛病的病原菌為輪蟲弧菌。輪蟲弧菌是引起魚類潰爛病的主要病原[6-8]。藥敏試驗表明該致病菌對氟苯尼考、沙星類抗生素等敏感，對其他抗生素敏感度低。本試驗采用16s rDNA鑒定分離的基因序列，在系統進化樹中與輪蟲弧菌[10-11]聚為一支，相似度>99%。海蜇疾病相關報道較少，而微生態制劑對于弧菌的抑制作用是較為顯著的[12-15]。芽孢桿菌、蛭弧菌等益生菌作為抗生素的替代品，能有效抑制病原菌，具有提高養殖動物的免疫力，改善水質及生態環境的作用。

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（收稿日期：2021-04-23）