熱休克轉錄因子1和血管內皮生長因子在肝癌組織中的表達及其對血管生成的影響

肖億 侯晴晴 張智 施顯茂 龍中榮 孫興 阮婕

【摘要】 目的 探討熱休克轉錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肝癌組織中的表達以及對肝癌血管生成的影響。

方法 通過免疫組化法檢測HSF1、VEGF在68例肝癌組織中的表達水平，分析其臨床病理特征。通過siRNA沉默PLC/PRF5肝癌細胞HSF1基因表達。利用小管形成實驗觀察小管形成，ELISA實驗檢測細胞VEGF分泌情況，最后通過WB實驗檢測HSF1、pP13K、pAKT、mTOR蛋白的表達。

結果 免疫組化實驗提示：HCC組織HSF1、VEGF在肝癌組織中的陽性表達率分別為67.65% （46/68）和66.18% （45/68），均高于癌旁組織的14.71% （10/68）和 19.12% （13/68） ，差異有統計學意義（P<0.001）。HSF1表達與HBsAg、肝內PVTT/HVTT形成、微血管侵犯、病理分期相關（P<0.05或0.01），與腫瘤大小等無關（P>0.05）。VEGF的表達與微血管侵犯、肝內PVTT/HVTT形成、病理分期相關（P<0.05或0.01），與 HBsAg、腫瘤分化程度等無關（P>0.05）。HSF1表達和VEGF表達呈正相關（r=0.287，P=0.018）。和Mock/PLC/PRF5組相比，sh/PLC/PRF5組明顯抑制小管形成、VEGF分泌，下調HSF1、VEGF、pP13K、pAKT、mTOR蛋白的表達。

結論 肝癌組織中HSF1和VEGF的表達可促進肝癌腫瘤血管生成，其作用機制可能和P13K/AKT/mTOR通路有關。

【關鍵詞】 肝癌;VEGF;HSF1;臨床病理特征;信號通路

中圖分類號：R737.7 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.05.004

【Abstract】 Objective To investigate the expressions of heat shock transcription factor 1 （HSF1） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in hepatic carcinoma tissues and their effects on angiogenesis.

Methods The expression levels of HSF1 and VEGF in hepatocellular carcinoma tissues in 68 cases were detected by immunohistochemical experiment to analyze their clinicopathological characteristics. HSF1 gene expression of PLC/PRF5 cell was silenced by siRNA. Tubule formation was observed by tubule formation assay， the secretion of VEGF was detected by ELISA， and the expressions of HSF1， pP13k， pAkT and mTOR were detected by WB assay.

Results Immunohistochemical experiment showed that the positive expression rates of HCC tissue HSF1 and VEGF in liver cancer tissues were 67.65% （46/68） and 66.18% （45/68） respectively， which were higher than those in adjacent tissues （14.71% [10/68]and 19.12% [13/68]）， and difference was statistically significant （P < 0.001）. HSF1 expression was correlated with HBsAg， ?intrahepatic PVTT/HVTT formation， microvascular invasion and pathological staging （P < 0.05 or 0.01）， but it was not correlated with tumor size （P > 0.05）. The expression of VEGF was correlated with microvascular invasion， intrahepatic PVTT/HVTT formation and pathological staging （P < 0.05 or 0.01）， but it was not correlated with HBsAg and tumor differentiation （P > 0.05）. The expression of HSF1 was positively correlated with the expression of VEGF （r = 0.287， P = 0.018）. Compared with Mock/PLC/PRF5 group， sh/PLC/PRF5 group could significantly inhibit tubule formation and VEGF secretion and down regulate the expressions of HSF1， VEGF， pP13K， pAKT and mTOR.

Conclusion The expressions of HSF1 and VEGF in liver cancer tissues can promote the angiogenesis of liver cancer tumor， and the mechanism of which may be related to PI3K/AKT/mTOR pathway.

【Key words】 liver cancer; VEGF; HSF1; clinicopathological characteristic; signal pathway

肝細胞癌（hepatocellular cancer，HCC）是全球常見惡性腫瘤之一，相關研究顯示我國HCC發病率、病死率約占世界范圍50%，且近年來呈逐漸上升趨勢。HCC發生發展涉及多個病理階段、多種分子改變，發展較快，預后較差[1]。熱休克轉錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）通過編碼蛋白質調控細胞內基因的穩態促進蛋白質合成、細胞增殖和糖代謝，參與HCC發生發展[2]。HCC新生血管的形成在促進腫瘤增殖、侵襲轉移的過程中發揮重要的介導作用。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在HCC中高表達和不良預后呈正相關，這提示抑制HCC血管生成對患者預后有著重要意義[3]。但HSF1和VEGF表達在HCC中的相關性研究未見文獻報道。因此，我們首先采用免疫組化法檢測HCC組織中HSF1、VEGF的表達變化，并探討其與臨床病理特征的相關性及臨床意義。接著通過siRNA沉默PLC/PRF5肝癌細胞HSF1基因表達，觀察小管形成、VEGF分泌以及HSF1、VEGF、pP13K、pAKT、mTOR蛋白的表達，以便更進一步明確HSF1和VEGF相互作用對HCC血管形成的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集2015年1 月～2018 年12月廣西醫科大學第五附屬醫院病理科存檔的具有完整資料的68例HCC及癌旁組織標本。根據原發性肝癌規范化病理診斷指南[4]，由兩位資深病理醫師采用雙盲法重新閱片診斷。其中，男性42例，女性26例;年齡28～68歲，平均62歲;瘤直徑≤5 cm者22例，>5 cm者46例;分化程度： 低分化24例，中分化29例，高分化15例;微血管侵犯47例。所有組織置入10%中性福爾馬林中固定。該研究通過醫院倫理委員會審查及批準，組織標本采集依據相關機構指導方針。所有受試者均簽署書面知情同意，遵循醫院倫理委員會審核的相關程序。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）所選病例均為首次發現，術前均未行任何抗癌治療。（2）患者的病理資料均完整。（3）均為原發性HCC。排除標準：（1）轉移性HCC患者。（2）無手術治療指征HCC患者。（3）合并其他部位惡性腫瘤的HCC患者。

1.3 細胞和試劑

PLC/PRF5細胞、HUVEC細胞購于中國科學院上海細胞庫。鼠抗VEGF（ab1316） 購自Abcam公司，兔抗pAKT（#9614）、mTOR（#2983）;鼠抗HSF1（#12972），pP13K（#17366），鼠二抗（#59997）、兔二抗（#7074）購自美國CST公司，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化實驗

常規病理切片，行免疫組化SP 法檢測HCC及癌旁組織中HSF1、VEGF表達水平。實驗操作步驟嚴格按試劑盒說明。光學顯微鏡（OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司）下觀察病理切片檢測組織形態變化并記錄實驗結果。免疫組化結果判定：HSF1、VEGF的陽性表達呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于腫瘤細胞膜和細胞質中，見圖1。陽性判斷采用半定量積分法[5]，每張切片隨機選取8個高倍視野，按照免疫組化染色反應的深度和陽性細胞分別記分，染色深度以多數細胞的呈色反應作為標準。淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分，不著色0 分。陽性細胞數<5%為0 分，<10%為1 分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分，將這兩項積分相乘，<3為陰性，≥3為陽性。

1.4.2 細胞培養

PLC/PRF5細胞置10% FBS DMEM、37℃、5% CO2培養箱常規培養。HUVEC細胞置10% FBS DMEM，按 1∶3比例傳代培養，取3～7代的細胞用于實驗。

1.4.3 HSF1-siRNA瞬時轉染PLC/PRF5細胞

由蘇州吉瑪基因股份有限公司設計合成和純化針對HSF1基因的特異性siRNA 序列：上游5'-GCACATTCCATGCCCAAGTAT-3'，下游5'- GGCCTCTCGTCTATGCTCC-3'。取對數生長期的PLC/PRF5 細胞，胰酶消化，按 1×105個/孔，接種于5 cm培養皿常規培養，待細胞密度達 75%左右進行轉染。根據脂質體2000說明書轉染PLC/PRF5細胞，分別獲得Mock/PLC/PRF5細胞（對照組）和sh/PLC/PRF5細胞（實驗組）。

1.4.4 Western blot 實驗

Mock/PLC/PRF5和sh/PLC/PRF5細胞長至90%密度，胰酶消化離心收集細胞，每管細胞加400 μL裂解液（RIPA：PMSF/100∶1），冰上裂解30分鐘，10 000 rpm，離心15分鐘，留上清液。按照BCA試劑測細胞總蛋白濃度、制備蛋白樣品。配置10% SDS聚丙烯酰胺凝膠，進行穩壓電泳、轉膜;PVDF膜用5%牛奶室溫封閉液1小時，TBST洗滌3次，每次5分鐘，加入目的抗體（1∶1000），4℃孵育過夜，TBST洗滌PVDF膜3次，每次5分鐘，加入對應二抗（1∶2000）室溫孵育2小時，TBST洗滌PVDF膜3次，每次5分鐘。最后，加入ECL發光液，曝光、顯影、定影、晾干保存、拍照記錄實驗結果。

1.4.5 ELISA實驗

收集Mock/PLC/PRF5和sh/PLC/PRF5細胞培養基，按照ELISA試劑盒檢測VEGF蛋白表達情況。實驗重復3次。

1.4.6 小管形成實驗

Matrigel基質膠置于4℃冰箱融化，按照50 μL/孔加入到96孔板，4℃冰箱孵育1小時。7代內的HUVEC細胞常規培養，離心收集細胞，細胞計數調整為2×105/mL，每孔加入50 μL細胞混懸液。收集Mock/PLC/PRF5和sh/PLC/PRF5細胞條件培養基，分別加入到96孔板中，每組設3個副孔。8小時后電子顯微鏡下觀察HUVEC細胞小管形成，并拍照記錄實驗結果。實驗重復3次。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據處理，計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，組內比較采用配對樣本均數t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本均數t檢驗，計數資料用例數和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，Pearson相關性分析HSF1與VEGF相關性，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結 ?果

2.1 HSF1與VEGF在HCC組織及癌旁正常組織中的表達情況

HCC組織HSF1、VEGF在肝癌組織中的陽性表達率分別為67.65% （46/68）和66.18% （45/68），均高于癌旁組織的14.71% （10/68）和 19.12% （13/68），差異有統計學意義（P<0.001）。HSF1、VEGF蛋白的陽性著色表達于細胞膜和細胞質中，癌旁組織細胞質HSF1未見陽性表達、VEGF弱陽性表達;僅在癌旁血管內皮細胞及血管基底膜細胞中見VEGF表達（見圖1，表1）。在HCC組織中，HSF1與VEGF的陽性表達呈正相關（r=0.287，P=0.018）。

2.2 HSF1、VEGF表達與臨床及病理特征的關系

HSF1表達與HBsAg、肝內PVTT/HVTT形成、微血管侵犯、病理分期相關（P<0.05或0.01），與腫瘤大小等無關（P>0.05）。VEGF的表達與微血管侵犯、肝內PVTT/HVTT形成、病理分期相關（P<0.05或0.01），與 HBsAg、腫瘤分化程度等無關（P>0.05）。見表2。

2.3 siRNA沉默PLC/PRF5細胞VEGF、HSF1、pP13K、pAKT、mTOR蛋白表達

Western blot實驗結果如圖2所示：和Mock/PLC/PRF5組相比，PLC/PRF5細胞轉染siRNA-HSF1質粒后，明顯沉默HSF1、VEGF、pP13K、pAKT、mTOR蛋白表達。

2.4 ELISA實驗檢測PLC/PRF5細胞VEGF表達

ELISA實驗結果如圖3所示：和Mock/PLC/PRF5組相比，PLC/PRF5細胞轉染siRNA-HSF1質粒后，明顯抑制VEGF的分泌（P<0.05）。

2.5 小管形成實驗檢測sh/PLC/PRF5細胞條件培養基對內皮細胞小管形成的影響

小管形成實驗結果如圖4所示： Mock/PLC/PRF5細胞組接種后6小時，相鄰細胞逐漸的突起組相比相互連接形成空腔，形成完整的網狀結構。對照組sh/PLC/PRF5細胞條件培養基明顯抑制內皮細胞生長，細胞退化未能誘導小管形成（P<0.05）。

3 討 ?論

HCC屬富血供腫瘤，血管生成被認為是其發生發展、侵襲轉移的關鍵步驟。研究表明，HCC血管密度和腫瘤的不良預后呈正相關，這提示抑制HCC血管生成對患者預后有著重要意義[6]。抗血管生成藥物索拉非尼目前在臨床上廣泛應用于晚期HCC患者的治療并達到較為理想的治療效果，但它仍面臨著副反應和耐藥性兩大挑戰[7]。雖然目前已有許多關于HCC血管生成各個步驟的研究，但對HCC血管生成的重要事件仍不清楚，無法實施精準靶向治療。因此，深入研究HCC血管生成的分子機制，尋找新的更為有效的抗HCC血管生成抑制劑，具有非常重要的臨床診療價值和社會價值。

活躍的血管生成能力和轉移能力是惡性腫瘤主要特征，對腫瘤發生發展至關重要。腫瘤長到1～2 mm3，需要新生血管提供營養才能維持生長。新生血管壁的通透性高，腫瘤細胞可以穿透血管壁發生遠處轉移[8]。可見，血管生成是腫瘤發生、轉移的基礎，抑制腫瘤血管生成有望控制腫瘤的發生發展。研究表明許多惡性腫瘤細胞都具有自分泌VEGF 的能力，且VEGF 可與酪氨酸跨膜受體結合誘導血管內皮細胞的分化和成熟，并抑制內皮細胞凋亡，誘導新生血管生成，增加血管的通透性，促進癌細胞侵襲轉移[9～10]，提示VEGF有望作為其生物學標志物。

HSF1是調控熱休克蛋白表達最關鍵的轉錄因子，由529個氨基酸組成，包括DNA結合域、三聚化結構域、調節結構域和轉錄活化域[11]。HSF1在非應激情況下以無活性單體的形式存在于細胞質中[12];在高溫、缺血、炎癥、氧化等應激狀態下，HSF1轉化為三聚體，誘導絲氨酸殘基磷酸化，穿過核膜轉移到細胞核，通過和熱休克蛋白基因啟動子結合形成熱休克元件，誘導分子伴侶基因表達產生熱休克蛋白（heat shock protein，Hsps），參與細胞分化、血管生成、增殖、凋亡、周期、轉移和耐藥[13]。

DU等[14]利用脂質體將過表達和沉默miR-199b-5p的質粒分別轉染小鼠內皮細胞，結果發現，過表達miR-199b-5p組明顯抑制內皮細胞侵襲和小管形成，同時下調HSF1和VEGF蛋白的表達。KUBO等[15]研究發現，HSF1敲除后的小鼠缺血組織VEGF、SDF-1、MVD均明顯少于野生型小鼠，同時伴有骨髓干/祖細胞的減少，具體分子機制未明確。以上研究結果提示HSF1和VEGF相互作用具有促進血管新生的作用，可能是抑制血管生成靶點之一。

本研究發現，肝癌組織中的HSF1、VEGF蛋白表達陽性率均明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義，且HSF1與VEGF的陽性表達呈正相關。盧鵬[16]回顧性分析40例原發性肝癌組織的免疫組化結果，發現癌組織中的HSF1陽性表達水平為 62.5%（25/40），癌旁組織陽性率為 35%（14/40）。馬薇等人[17]通過免疫組化實驗檢測94 例肝癌組織中VEGF 蛋白，癌組織陽性表達率為65.96%，癌旁組織陽性表達率為19.15%。這與本研究的結論較為一致。

近年來對分子生物學的研究正在逐步深入，腫瘤相關基因信號通路成為研究熱點。與肝癌有關的細胞信號轉導通路有：Ras/Raf/MEK信號通路、酪氨酸激酶信號轉導通路、Notch信號轉導通路、PDK/AKT信號通路、核轉錄因子kappaB（NF-κB）通路、Wnt通路和Hedgehog（Hh）信號通路等。其中P13K/Akt（phosphatidylinositol3 kinase-protein kinase B，P13K/Akt）信號通路在細胞中廣泛存在，與肝癌細胞增殖、生長、分化、凋亡等密切相關[18]。研究發現，VEGF受體包括VEGF-1（Flt-1），VEGF-2（KDR）和VEGF-3（Flt-4），屬于跨膜酪氨酸激酶受體，分布在血管內皮細胞表面，通過特異性與VEGF結合，激發下游P13K/Akt/mTOR信號通路引起細胞內酶聯反應，促進肝癌血管生成[19]。本研究發現，沉默PLC/PRF5肝癌細胞HSF1基因表達明顯抑制小管形成、VEGF分泌，下調HSF1、VEGF、pP13K、pAKT、mTOR蛋白的表達。此外，研究表明RET基因過表達可激活P13K/Akt/mTOR信號通路，進一步誘導HSF1的表達，誘導血管生成，促進細胞惡性轉化[20]，這與本研究的結論較為一致。

綜上所述，在臨床及病理特點的關系方面，HSF1、VEGF 表達陽性者在Ⅲ期、肝內PVTT/HVTT形成、微血管形成方面比例較高，且在HCC組織中HSF1與VEGF的陽性表達呈正相關。沉默PLC/PRF5肝癌細胞HSF1基因表達明顯抑制小管形成、VEGF分泌，下調HSF1、VEGF、pP13K、pAKT、mTOR蛋白的表達，提示HSF1可能通過VEGF調控P13K/Akt/mTOR信號通路參與了肝癌的血管生成，但本研究僅局限于初步研究，具體的分子機制還需要進一步實驗驗證，為以血管生成為靶點的靶向治療提供新的實驗依據。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-12-09 修回日期：2021-04-12）

（編輯：梁明佩）