一種馬勃屬野生真菌分離鑒定及生物學特性研究

摘要 采用形態鑒定與ITS分子序列鑒定相結合的方法，對采集的一株馬勃屬野生真菌進行鑒定，并對該菌種菌絲生物學特性進行研究。結果表明，初步通過形態鑒定法鑒定為梨形馬勃，后進一步用ITS分子序列鑒定法鑒定，分離株rDNA ITS 片段長度為697 bp，測序結果登錄NCBI與GenBank中已知菌種進行BLAST比對，采用MEGA 2.0軟件構建系統發育樹，鑒定分離菌種為網紋馬勃，結合形態特征，最終鑒定該菌種為網紋馬勃（Lycoperdon perlatum）。生物學特性研究結果表明，可溶性淀粉為該菌絲生長的最適碳源，硝酸銨為最適氮源，7.0為最適pH，菌絲最適溫度為25 ℃。

關鍵詞 網紋馬勃;分離;鑒定;生物學特性

中圖分類號 S-646? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）13-0120-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Identification and Biological Characteristics of a Wild Lycoperdon perlatum

ZHANG Yan

（Liaoning Provincial Institute of Poplar， Gaizhou， Liaoning 115213）

Abstract A wild macrofungi fruiting body was isolated by tissue isolation method， identified by morphological identification and its molecular sequence identification， and the biological characteristics of the mycelium were studied. The results showed that the strain was identified as Lycoperdon pyriforme Schaeff.：Pers by morphological identification and ITS molecular sequence identification. The length of ITS fragment of rDNA was 697 bp. The sequencing results were registered in NCBI and compared with the known strains in GenBank by blast， the ITS sequence with similar height was downloaded and compared with cluster W. Mega 2.0 software was used to construct the system tree， and the isolated strain was identified as Lycoperdon perlatum. The results showed that the suitable carbon source for mycelium growth was soluble starch， the suitable nitrogen source was ammonium nitrate， the suitable pH value was 7.0， and the optimum temperature was 25 ℃.

Key words Lycoperdon perlatum;Isolation;Identification;Biological characteristics

網紋馬勃（Lycoperdon perlatum），馬勃菌目馬勃菌科馬勃屬。夏秋季林中常見，幼時可食，子實體有消腫、止血、解毒作用。可與松樹、櫟樹、云杉等形成外生菌根，具有良好的經濟價值和生態價值，有必要開展深入研究。筆者對該野生菌種進行了鑒定，并初步研究其生物學特性，旨在為其進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

該林場距哈爾濱市108 km，地處127°30′～127°34′E，45°20′～45°25′N，年平均氣溫2.6 ℃，最低溫度在1月，為-31.9 ℃，最高溫度在7月，為32 ℃。年均降水量723.8 mm，多集中在7、8月，占全年總降水量的54%，蒸發量1 093.3 mm，無霜期120～140 d，年日照時數2 471.3 h，春季有很強的西南、西北氣流侵入，少雨干旱。該地區地帶性土壤為暗棕壤，有機質含量較為豐富。

1.2 試驗材料

1.2.1 子實體。子實體采自東北林業大學帽兒山試驗林場（圖1）。

1.2.2 培養基。

菌種分離及擴繁采用PDA加富培養基。

1.2.3 主要試劑及引物。

選用TIANGEN-DNA secure-新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），引物ITS1/ITS4（寶生物工程有限公司）[1]。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種分離。

將球狀子實體表面用75%乙醇棉輕輕擦拭干凈，放入超凈工作臺上，在菇柄處用手術刀切開0.5 cm深，用手輕輕掰開，從露出的新鮮菌肉處切取米粒大小的菌肉接入培養基。然后于25 ℃暗培養，標記為LXMB。記錄分離成功率、菌絲塊萌發時間、菌絲顏色、密度、長勢[2]。

1.3.2 菌種鑒定。

1.3.2.1 形態鑒定法。

對照圖譜等工具書，觀察子實體的形狀、顏色等形態特征，進行初步鑒定。

1.3.2.2 分子鑒定法。

刮取新鮮菌絲，使用DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取，并將提取的DNA溶于25 μL TE（pH 8.0）中，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

以提取DNA為模板，應用真菌通用引物對ITS1和ITS4進行PCR擴增，采用張妍等[2]的反應體系及反應程序進行。將PCR產物用凝膠成像系統檢測拍照，依據條帶清晰情況，確定是否進行進一步測序。

將測得的序列輸入GenBank進行BLAST比對，比對出最為相似的已有序列，節選比對出相似序列的ITS區域，用Clustalw（BioEdit 7.0軟件）進行多序列比對。將比對結果輸入MEGA 5.2軟件，采用N-J法構建測得序列的系統發育樹，進行系統發育分析[3]。

1.3.3 生物學特性分析。

開展不同碳源、氮源、pH、溫度4個單因素試驗（表1），每處理5次重復，培養30 d后，測量菌絲直徑，同時觀察菌絲長勢、濃密度、色澤等生長指標。

2 結果與分析

2.1 分離結果

分離第2天可見菌塊上長出白色絨毛狀菌絲，菌絲生長初期顏色潔白、菌絲整齊，待菌絲快要長滿培養皿時，菌絲較密，邊緣整齊，有束狀菌絲（圖2、3）。 在分離過程中，污染情況發生較少，可見組織分離是該菌種適宜的分離方法。菌絲平均生長速度為0.148 cm/d，長速較慢。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態鑒定。

子實體小，高2.0～3.5 cm，梨形至近球形，不孕基部發達，由白色菌絲束固定于基物上。初期包被色淡，后呈茶褐色至淺煙色，外包被形成微細顆粒狀小疣，內部橄欖色，后變為褐色。孢子橄欖色，平滑，球形，直徑3.5～4.5 μm。初步鑒定為梨形馬勃（Lycoperdon pyriforme Schaeff.：Pers）[4-5]。

2.2.2 分子鑒定。

2.2.2.1 菌絲總DNA 提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測。

提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，DNA樣品條帶有降解現象（圖4），嘗試作為PCR反應模板進行PCR擴增。

2.2.2.2 PCR擴增。

經凝膠成像檢測擴增產物發現，成功擴增出了目的條帶，且條帶整齊明亮（圖5），目的片段大小在700 bp左右，可以進行測序。

2.2.2.3 內轉錄間隔區（ITS）序列。

序列測定結果顯示，其PCR擴增產物長度為堿基697 bp，登錄NCBI經Blast比對測序，結果表明，與LXMB相似性最高的菌株序列號分別為AB669511.1、FM999681.1、DQ112630.1、DQ421095.1、FM999608.1，菌種名稱分別為Uncultured ectomycorrhizal fungus（不能培養的外生菌根真菌）、Uncultured fungus、Lycoperdon perlatum（網紋灰包）、Uncultured soil fungus、Uncultured fungus，Query cover分別為99%、100%、99%、99%、99%，ident均為99%。排名靠前的多為不能培養的外生菌根真菌，只有一個給出種名的為網紋灰包及網紋馬勃，根據第5位往后的比對結果，菌種名絕大多數為Lycoperdon perlatum（網紋灰包），下載相似高的29個ITS序列，用ClustalW進行序列比對，用MEGA 5.2軟件構建系統樹，分析序列采用 Ki mura雙參數模型。EU 780685.1為外類群（outgroup），從中間生根（The tree ism idpoint rooted）。圖6只顯示用百分數表示的大于50%的Bootstrap值，從圖6可看出，MB與所有的Lycoperdon perlatum序列聚為一支，親緣關系較近，因此將MB形態學鑒定的梨形馬勃更正為網紋馬勃。

經形態鑒定與分子鑒定綜合分析，最終鑒定該菌種為網紋馬勃（Lycoperdon perlatum），屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）腹隔擔子菌綱（Gasteromycetes）馬勃目（Lycoperdales）馬勃科（Lycoperdaceae）馬勃屬（Lycoperdon）。

2.3 菌絲生物學特性

2.3.1 不同碳源對網紋馬勃菌絲生長的影響。

由表2可知，不同碳源對網紋馬勃菌絲生長的影響差異極顯著。可溶性淀粉作碳源時，菌絲生長速度最快，且較為健壯濃密。但加入果糖的菌絲長勢最旺，在6個處理中最為濃密。可見，綜合可溶性淀粉與果糖作為碳源最有利于網紋馬勃菌絲生長。

2.3.2 不同氮源對網紋馬勃菌絲生長的影響。

由表3可知，4種氮源處理間差異極顯著。硝酸銨作為氮源時，菌絲生長速度最快、健壯、濃密，是網紋馬勃菌絲生長的最佳氮源。

2.3.3 不同pH對網紋馬勃菌絲生長的影響。

由表4可知，不同pH對網紋馬勃菌絲生長的影響差異極顯著。當pH為7.0時，菌絲生長速度最快、最濃密;當pH為6.0、6.5、7.5時，菌絲生長速度及長勢均為中等;當pH為5.5時，菌絲生長速度最慢，長勢弱且稀。可見，pH為7.0時最適合網紋馬勃菌絲生長。

2.3.4 不同溫度對網紋馬勃菌絲生長的影響。

由表5可知，不同溫度處理差異極顯著，網紋馬勃菌絲在25 ℃時生長最快，30 ℃次之，15～30 ℃時均可生長。

3 結論與討論

3.1 菌種鑒定

該研究最初采用形態鑒定法鑒定菌種為梨形馬勃，但對于難以人工成功培養子實體的菌根菌，單純的形態鑒定法不夠準確。近年來，形態鑒定輔以ITS序列分子鑒定，已被廣大研究人員廣泛應用于大型真菌鑒定[6-11]。因此，進一步采用ITS序列分子鑒定法，將菌種進一步修正為網紋馬勃，可見ITS序列分子鑒定法結合形態鑒定對于鑒定難以人工培養成功子實體的菌根菌是非常有必要的。

3.2 生物學特性

該研究利用碳源、氮源、pH、溫度單因素試驗初步確定了網紋馬勃菌絲生長最適宜生長條件。但總體來說，外生菌根真菌菌絲生長速度仍較慢，還需要在該試驗的基礎上，進一步探索影響菌絲生長的其他因素，以及各因素之間是否存在交互作用，進而優選出最優培養方式。

參考文獻

[1] 馮連榮，張妍，梁德軍，等.林地蘑菇ITS鑒定及生物學特性初步研究[J].林業科技，2016，41（4）：20-23.

[2] 張妍，馮連榮，王克瀚，等.卷邊樁菇組織分離與ITS序列分子鑒定[J].林業科技通訊，2016（5）：8-11.

[3] 張妍，馮連榮，矯麗曼，等.野生花臉香蘑的分離鑒定及生物學特性初探[J].林業科技通訊，2020（7）：30-33.

[4] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州：河南科學技術出版社，2000：220.

[5] 袁明生，孫佩瓊.中國大型真菌彩色圖譜[M].成都：四川出版集團，四川科學技術出版社，2013：474.

[6] 高山，胡平，邊銀丙，等.基于ITS序列對3個側耳菌種的分子鑒定[J].湖北農業科學，2008，47（12）：1390-1393.

[7] 田慧敏，劉鐵志，連靜，等.基于形態特征及ITS序列對內蒙古紅菇的分類鑒定[J].食用菌學報，2014，21（4）：15-19，91.

[8] 王桂文，孫文波.廣西紅菇子實體及分離株的rDNA ITS序列分析[J].廣西科學，2004，11（3）：261-265.

[9] 熊濤，肖滿，曾哲靈，等.松乳菇組織分離菌株的rDNA ITS序列分子鑒定[J].微生物學通報，2006，33（4）：1-4.

[10] 李海波，吳學謙，魏海龍，等.基于形態特征和ITS序列對7個鵝膏菌屬菌株的分類鑒定[J].菌物研究，2007，5（1）：14-19，50.

[11] 宋立志，馮連榮，梁德軍，等.一株野生大型真菌的菌種分離及ITS序列鑒定[J].安徽農業科學，2018，46（11）：113-115.