TNRC6C-AS1和miR-129-5p對甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

李化靜,任婉麗,郝潤梅,汪世洋,白艷霞,趙 謙

(西安交通大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:entzhao@xjtu.edu.cn)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)是最常見的內分泌腫瘤,其中包括乳頭狀甲狀腺癌、濾泡性甲狀腺癌、間變性甲狀腺癌和甲狀腺髓樣癌;TC的發病率一直居高不下[1]。TC的發生與遺傳異常和環境因素有關[2,3]。目前,常見的傳統治療方法有外科手術、放療和化療療法;但由于TC易于轉移,傳統方法受到局限,故新型分子靶向治療方法已成為一種有前途的治療策略而備受關注[4]。因此,尋找潛在的靶點對于更好地治療TC至關重要。

研究發現,lncRNA的大小范圍為200 bp至100 kb的RNA分子[5]。lncRNA參與了許多基因的基因表達的表觀遺傳調控,并被認為是腫瘤生物學的重要組成部分[6]。研究發現,TNRC6C-AS1移碼突變在胃癌和高微衛星不穩定性的大腸癌中很常見,并且在這些癌癥中有超過50%觀察到TNRC6C-AS1表達缺失[7]。在另一項研究中,TNRC6C-AS1被證明是食管鱗狀細胞癌GAEC1癌基因的下游調控基因[8]。這些數據表明,TNRC6C-AS1表達的喪失可能是幾種癌癥發生的特征。但是,大多數lncRNAs在TC中的功能尚未確定。

miRNAs廣泛存在于真核細胞中,其大小約為22個核苷酸[7]。miRNAs可以調控靶基因,進而調控細胞分化、生長、增殖、代謝和凋亡等基本生理過程[9]。在甲狀腺癌研究領域,大量的甲狀腺癌相關miRNAs被研究和鑒定[10]。其中,miR-129-5p的過表達可以促進TC細胞的凋亡,并被證明其在TC中發揮抑瘤作用[11]。Unc-5netrin受體B(unc-5 netrin receptor B,Unc5b)是netrin-1的依賴性受體,通過與netrin-1結合參與軸突遷移和血管形成,并在腫瘤抑制中發揮重要作用[12]。然而,到目前為止,Unc5b在TC中的作用尚不清楚。故本研究旨在探究lncRNA TNRC6C-AS1在TC中的生物學功能,并揭示它與miR-129-5p和Unc5b的調控關系。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

本研究所使用的細胞系均購自美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC,北京);RPMI-1640培養基、F12K培養基、高糖DMEM培養基、LipofectamineTM3000、TRIZOLTM試劑、PVDF膜均購自美國Invitrogen公司;miR-129-5p模擬物、miR-129-5p抑制劑和sh-Unc5b和CCK-8細胞計數試劑盒購于上海吉瑪制藥技術有限公司;氯仿、異丙醇、乙醇購于上海生工有限公司;DEPC水購于碧云天生物技術有限公司;PrimeScript?First Strand合成試劑盒購于日本TaKaRa公司;QuantiTect SYBR?Green RT-PCR試劑盒購于德國QIAGEN公司;RIPA細胞裂解液、RNase抑制劑購于美國Thermo Fisher公司;所有一抗和二抗均購自英國Abcam公司;雙熒光素酶報告試劑盒購于美國Promega公司;Matrigel購于美國BD公司。

1.2 組織樣本

收集2018年1月至2020年6月期間于本院入住的甲狀腺癌患者40例,入選所有患者均經甲狀腺手術后石蠟切片病理確診,其中男性患者17例,女性患者23例,平均年齡(48.23±10.25)歲。采用AJCC第七版分化型甲狀腺癌分期標準:Ⅰ期患者25例(62.5%),Ⅱ期患者2例(5%),Ⅲ期患者5例(12.5%),Ⅳ期患者8例(20%)。手術中留取40份腫瘤組織樣品,以及40份鄰近正常對照甲狀腺組織樣品。取出的組織樣品立刻放入液氮中冷凍,2 h后放入-80 ℃保存。患者在手術前沒有接受過化療、放療或其他治療。本研究經本院倫理委員會批準。

1.3 細胞培養

本研究中所使用的細胞系包括人甲狀腺癌細胞系(NPA87、KAT-5和FTC-133)和正常人甲狀腺細胞系HTori3。NPA87、KAT-5、HToris3細胞和FTC-133細胞所使用的培養基為RPMI-1640培養基。所有細胞的培養條件為37 ℃、5% CO2,培養基添加10%胎牛血清(FBS)。

1.4 細胞轉染

由上海生物技術有限公司合成lncRNA TNRC6C-AS1和陰性對照的干擾序列(見表1)。根據說明書,將TNRC6C-AS1-wt(AS1-wt)、TNRC6CAS1-mut(AS1-mut)、Unc5b-wt和Unc5b-mut插入到pGL3質粒中,構建重組pGL3質粒。按照以下實驗分組使用LipofectamineTM3000將對應產物轉染至FTC-133細胞;實驗分組為AS1-wt組(轉染pGL3-AS1-wt質粒)、AS1-mut組(轉染pGL3-AS1-mut質粒)、Unc5b-wt組(轉染pGL3-Unc5b-wt質粒)和Unc5b-mut組(轉染pGL3-Unc5b-mut質粒)。

表1 引物序列

1.5 qRT-PCR檢測甲狀腺腫瘤組織及細胞系中TNRC6C-AS1、miR-129-5p和Unc5b的相對表達量

使用Trizol試劑裂解甲狀腺癌細胞系(NPA87、KAT-5和FTC-133)及正常細胞HTori3,并以氯仿/異丙醇抽提分離RNA沉淀物;再經過乙醇沉淀,最終得到總RNA。使用RNA prep pure Tissue Kit提取甲狀腺腫瘤組織中的RNA。使用PrimeScript RT合成試劑盒將1 μg RNA逆轉錄合成cDNA,采用SYBR?Green qRT-PCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR。GADPH和U6 snRNA分別作為mRNA和miRNA的內參,用2-ΔΔCt法計算TNRC6C-AS1、miR-129-5p和Unc5b的相對表達量。

1.6 蛋白質印跡檢測Unc5b的蛋白表達水平

使用RIPA細胞裂解液裂解細胞;將RIPA細胞裂解液與細胞混合,使用180 W超聲儀1 min(超聲3 s,停頓4 s),然后將混合物在4 ℃下12 000 r/min離心10 min,收集沉淀蛋白質。提取的蛋白經SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜上,然后使用5%脫脂牛奶封閉1 h。采用TBST緩沖液清洗PVDF膜1次,然后與一抗Unc5b(1 ∶1 000)和GADPH(1 ∶1 000)于4 ℃過夜孵育。然后用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次,與二抗IgG-HRP(1 ∶1 000)于室溫孵育1.5 h。利用谷胱甘肽脫氫酶(GAPDH)作為對照,定量檢測蛋白質水平。使用ECL檢測系統(Thermo Science)進行Unc5b蛋白條帶的可視化。

1.7 CCK-8檢測TC細胞的增殖能力

為評估轉染12,24,36,48,72,96 h后TC細胞的增殖能力,將細胞接種于96孔板中培養(2×103個細胞/孔),然后用NC或sh-TNRC6C-AS1(sh-AS1組)做轉染處理。按照細胞計數試劑盒-8(CCK-8)說明書方法測定細胞數量,使用酶標儀(Thermo Science)在450 nm處測量吸光度(OD)。

1.8 Transwell實驗檢測TC細胞的侵襲和遷移能力

本研究進行Transwell實驗以分析細胞的侵襲和遷移能力。收集FTC133細胞,懸浮于無血清DMEM培養基中。將細胞接種于含或不含Matrigel(100 μl)的無血清培養基(400 μl)Transwell上室(每孔40 μl),下室充入700 μl的完整DMEM培養液作為化學誘導劑。37 ℃孵育48 h后,用棉簽將上腔內未侵入的細胞取出,用4%多聚甲醛將侵入的細胞固定在下層。然后用0.1%結晶紫染色10 min,在顯微鏡下(德國卡爾·蔡司)拍攝并計數侵襲和遷移的細胞數。

1.9 雙熒光素酶報告測定miR-129-5p與TNRC6-AS1及Unc5b的結合關系

本實驗按照研究分組為:空載體組、miR-129-5p模擬物組(模擬物組)、miR-129-5p抑制劑組(抑制劑組)、sh-TNRC6C-AS1+miR-129-5p抑制劑組(sh-AS1+抑制劑組)、sh-Unc5b組和sh-TNRC6C-AS1組(sh-AS1組)。空載體組僅使用LipofectamineTM3000將空載體質粒pGL3-NC轉染FTC-133細胞;模擬物組僅使用LipofectamineTM3000將空載體質粒pGL3-NC和miR-129-5p模擬物共轉染FTC-133細胞;抑制劑組僅使用LipofectamineTM3000將空載體質粒pGL3-NC和miR-129-5p抑制劑共轉染FTC-133細胞;sh-TNRC6C-AS1+抑制劑組使用LipofectamineTM3000將pGL3-AS1-wt質粒及干擾序列和miR-129-5p抑制劑共轉染FTC-133細胞;sh-Unc5b組僅使用LipofectamineTM3000將pGL3-Unc5b-wt質粒及干擾序列共轉染FTC-133細胞;sh-AS1組僅使用LipofectamineTM3000將pGL3-AS1-wt質粒及干擾序列共轉染FTC-133細胞。轉染48 h后,根據試劑盒說明書,通過雙熒光素酶報告試劑盒測定報告基因的熒光素酶活性。

1.10 數據分析

采用SPSS18.0統計軟件進行統計分析。所有實驗重復3次,數據用平均值±標準差表示。采用t檢驗比較兩組間正態分布數據,采用單因素方差分析比較多組數據,對非正態分布數據進行Kruskal Wallis檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNRC6C-AS1基因敲除抑制TC細胞的增殖、遷移和侵襲

與甲狀腺癌旁正常組織相比,TNRC6C-AS1在甲狀腺腫瘤組織中的表達明顯升高(P<0.01,見圖1)。與正常甲狀腺上皮細胞HTori3相比,TNRC6CAS1在TC細胞(NPA87、KAT-5和FTC-133)中的表達水平也顯著升高(P<0.05,見圖1)。在FTC-133細胞中,與對照組相比,sh-AS1組中TNRC6C-AS1表達水平顯著下調(P<0.01,見圖1),FTC-133細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01,見圖2)。

與正常組織比較,**P<0.01;與HTori3細胞比較,#P<0.05,###P<0.001;與空載體組比較,△△△P<0.001圖1 TNRC6C-AS1在組織和細胞中表達情況Figure 1 The expression of TNRC6C-AS1 in tissues and cells

圖2 TNRC6C-AS1表達下調抑制FTC133細胞增殖、遷移和侵襲Figure 2 The downregulation of TNRC6C-AS1 expression inhibited the proliferation, migration and invasion of FTC133 cells

2.2 在TC細胞中miR-129-5p與TNRC6CAS1相互作用

根據生物信息學分析,預測miR-129-5p與AS1-wt的3′-UTR結合(見圖3A)。在AS1-wt組中,與空載體組相比,模擬物組中共轉染FTC-133細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01);而在AS1-mut組中,模擬物組與空載體組相比差異無統計學意義(P>0.05,見圖3B)。與甲狀腺癌旁正常組織相比,miR-129-5p在TC組織中的表達顯著降低(P<0.01,見圖3C);與正常甲狀腺上皮細胞HTori3相比,TC細胞系NPA87、KAT-5和FTC-133中miR-129-5p相對表達量顯著降低,在FTC-133細胞中差異最顯著(P<0.01,見圖3D)。與對照組相比,sh-AS1組FTC-133細胞中的miR-129-5p相對表達量顯著升高(P<0.01,見圖3E)。

圖3 miR-129-5p與TNRC6C-AS1通過直接結合而相互作用Figure 3 miR-129-5p interacts with TNRC6C-AS1 through direct binding

2.3 miR-129-5p下調促進TC細胞增殖、遷移和侵襲

在FTC-133細胞中,與空載體組相比,模擬物組中miR-129-5p的相對表達量顯著升高(P<0.01);抑制劑組中miR-129-5p的相對表達量顯著降低(P<0.01);sh-AS1+抑制劑組中miR-129-5p的相對表達量無顯著變化(P>0.05,見圖4)。與空載體組相比,模擬物組細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著下降(P<0.01);抑制劑組細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著升高(P<0.01);sh-AS1+抑制劑組的細胞增殖、遷移和侵襲能力無顯著變化(P>0.05,見圖4,5)。

2.4 miR-129-5p靶向調控Unc5B基因

根據生物信息學分析,預測Unc5b為miR-129-5p的靶基因(見圖6A)。在Unc5b-wt中,與空載體組相比,模擬物組中共轉染FTC-133細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01);在Unc5b-mut中,模擬物組與空載體組相比差異無統計學意義(P>0.05,見圖6B)。

與甲狀腺癌旁正常組織相比,Unc5b在TC組織中的表達顯著升高(P<0.01,見圖7)。與正常甲狀腺上皮細胞HTori3相比,TC細胞系NPA87、KAT-5和FTC-133的Unc5b的相對表達量顯著升高(P<0.05,見圖7)。Western blotting結果顯示,與空載體組相比,模擬物組中Unc5b的相對表達量顯著降低(P<0.01),抑制劑組中Unc5b的相對表達量顯著升高(P<0.01),sh-AS1組中Unc5b的相對表達量顯著降低(P<0.01),sh-AS1+抑制劑組中Unc5b的相對表達量差異無統計學意義(P>0.05,見圖7)。與空載體組相比,sh-Unc5b組FTC-133細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01,見圖8)。

與空載體組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖4 下調miR-129-5p可促進FTC-133細胞的增殖Figure 4 Downregulation of miR-129-5p promotes the proliferation of FTC-133 cells

與空載體組比較,***P<0.001圖5 下調miR-129-5p可促進FTC-133細胞的遷移和侵襲 (bar=100 μm)Figure 5 Downregulation of miR-129-5p promotes the migration and invasion of FTC-133 cells (bar=100 μm)

A.生物信息學分析預測miR-129-5p與Unc5b的結合位點與空載體組比較,***P<0.001B.雙熒光素酶報告基因檢測miR-129-5p與Unc5b的關系圖6 miR-129-5p與Unc5b的關系Figure 6 Relationship between miR-129-5p and Unc5b

與正常組織比較,***P<0.001;與HTori3比較,#P<0.05,###P<0.001;與空載體組比較,△△△P<0.001圖7 Unc5b在甲狀腺腫瘤組織和TC細胞系中表達情況Figure 7 The expression of TNRC6C-AS1 in thyroid tumor tissues and TC cell lines

圖8 miR-129-5p對FTC-133細胞增殖、遷移和侵襲影響Figure 8 Effects of miR-129-5p on the proliferation, migration and invasion of FTC-133 cells

3 討論

研究表明,lncRNA對細胞周期等多個階段的調控起重要作用,如在細胞分化、增殖、遷移、侵襲和凋亡等[6]。與mRNA相比,lncRNA通常在細胞核中,具有組織特異性,在不同物種之間并不高度保守,并且以較低的豐度存在[5]。而lncRNAs在TC中具有與TNRC6C-AS1相似的功能;例如MALAT1在甲狀腺乳頭狀癌和濾泡性甲狀腺癌中上調[13-15],其具有致癌作用,并通過調節IQGAP1的表達促進甲狀腺癌細胞的增殖和侵襲[16]。同時,MALAT1在介導TC進展中具有潛在作用,MALAT1在低分化和間變性甲狀腺癌中顯著下調,其過表達與miR-21結合可能調節甲狀腺髓樣癌的進展[17,18]。TUG1可能通過作為ceRNA競爭性與miR-145起作用而有助于TC細胞的發展,而lncRNA TUG1與TC細胞的腫瘤進展有關[19]。與這些lncRNAs類似,TnRC6C-AS1在TC中也具有腫瘤促進劑的作用。這提示TNRC6C-AS1可作為TC的一種新的生物標志物。

miRNAs是組織特異性基因表達的有效調節因子,其已被證明是反應癌癥的一個標志物[20]。大量的miRNAs被發現于TC中[21]。文獻報道,miR-129-5p可導致組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導的TC細胞死亡[22]。miR-129-5p/RET可抑制髓樣TC細胞的生長、凋亡和遷移[23]。miR-335-5p在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平明顯低于其他類型的腫瘤,同時ICAM-1可以促進TC細胞的增殖,而miR-335-5p可以抑制TC細胞的增殖,這可能說明miR-335-5p可以靶向ICAM-1并抑制其表達[24]。miR-146b-5p在正常大鼠卵泡PCCL3細胞中的過度表達降低了SMAD4水平,并對TGF-β介導的細胞周期阻滯產生抵抗,而甲狀腺癌基因RET/PTC3和BRAF的激活上調了miR-146b-5p的表達[25]。然而,miR-129-5p在乳頭狀甲狀腺癌的microRNA分析中卻表現出無作用[26]。因此,miR-129-5p的功能及其與mRNA、lncRNA等其他因子的相互作用還有待進一步研究。

本研究結果表明,miR-129-5p與TNRC6C-AS1結合并下調其在TC中的表達。這在其他類型的癌癥中也有類似的現象,例如在甲狀腺癌中,miR-129-5p受到PTCSC3表達的負調控,從而調節腫瘤進展[27]。miR-129-5p還通過TLR9信號通路促進人肺癌細胞在體內和體外的定植,表明其與人肺癌的發生發展密切相關[28]。

另外,Unc5b(miR-129-5p的靶基因)在多種癌癥表明具有促癌作用;如在膀胱癌中,Unc5b的過表達抑制了細胞的增殖和遷移,并誘導了G2/M期的細胞周期停滯[29]。另一項研究還表明,與正常膀胱細胞系相比,Unc5b在膀胱癌中的表達被下調,并與膀胱癌復發相關[30]。Unc5b在成人的現有脈管系統中被下調,但在血管生成和腫瘤發生過程中被重新表達,這表明Unc5b是潛在的抗血管生成治療靶標[31]。在有遠處轉移的乳腺癌患者中觀察到netrin-1和Unc5b的表達上調[32]。在前列腺癌組織和細胞系中Unc5b-AS1的表達均顯著增加,這與前列腺癌患者的病理分期和遠處轉移的發生率顯著相關;此外,Unc5b-AS1能夠通過調節caspase-9表達來加速前列腺癌的惡性進展[33]。這些結果表明Unc5b可能是這些癌癥中的一種抗癌基因。

本研究結果表明,lncRNA TNRC6C-AS1和Unc5b在TC組織和細胞中過表達,而miR-129-5p卻低表達。TNRC6C-AS1和Unc5b增強了TC細胞活性,而miR-129-5p抑制TC細胞活性。TNRC6CAS1和Unc5b均能與miR-129-5p直接結合。TNRC6C-AS1表達降低并上調miR-129-5p的表達,進而下調了Unc5b的表達。這些結果表明,TNRC6C-AS1在TC中作為miR-129-5p的CeRNA,在TC的發生發展中起重要作用,提示TNRC6C-AS1和Unc5b可能是TC治療的潛在靶點。