應用TLC-CMS 技術檢測核桃青皮中多酚類化合物

杜京旗，李雪芬，楊衛(wèi)民

（呂梁林果植物化學省市共建山西省重點實驗室培育基地，山西省特色植物功能成分工程研究中心，呂梁學院，山西呂梁 033001）

核桃（Juglans regin L.） 系胡桃科核桃屬植物[1]。核桃青皮富含胡桃醌、多酚、黃酮、色素、多糖等多種生物活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌、消炎等多種保健功能[2]。

水解類植物單寧結(jié)構(gòu)式見圖1，縮合類植物單寧結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖1 水解類植物單寧結(jié)構(gòu)式

圖2 縮合類植物單寧結(jié)構(gòu)式

植物多酚是一類廣泛存在于植物皮、木、根、葉及果實中的多羥基酚類化合物，是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個酚性羥基的植物成分的總稱，包括水解單寧（Hydrolytictannin，HT，酸酯類多酚） 和縮合單寧（Condensedtannin，CT，黃烷醇類多酚或原花色素），其酚羥基結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，消耗環(huán)境中的氧，同時對活性氧等自由基具有很強的捕捉能力，這使多酚具有較強的抗氧化性和清除自由基的能力[3-4]。大量研究表明，植物多酚具有抗菌、抗氧化、抗癌和抗心血管疾病等療效，目前在食品、藥品和化妝品等行業(yè)普遍應用[5-7]。近年來，核桃多酚對腫瘤細胞的抑制作用引起了人們極大的興趣，使其逐漸成為該領域的研究熱點，其機制可能涉及抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡及細胞因子的產(chǎn)生等，目前研究主要集中在核桃仁、核桃殼及核桃青皮多酚的抗腫瘤效應[8-10]。核桃仁和核桃葉多酚能有效降低血糖，在降血糖天然藥物成分的研發(fā)中具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)核桃仁乙醇提取物具有較好的α - 葡萄糖苷酶抑制活性，對糖尿病有一定的防治作用[8]。核桃青皮中含有豐富的 5 - 羥基-1,4- 萘醌、山奈酚、槲皮素等酚類物質(zhì)，其抗菌及抗腫瘤效果顯著。

目前植物多酚的提取方法有萃取法[11]、超臨界流體萃取（SCF） 法[12]、超聲波浸提法[13]、微波浸提法[14]等。分離純化的方法主要采用沉淀分離、超濾和層析分離法等[15]。植物多酚作為一類儲量十分豐富、具有較強生物活性的天然化合物，對人類的健康起著重要的作用。進行植物多酚提取分離及檢測方法的研究，開發(fā)安全、高效的天然抗氧化劑，以及能防治腫瘤、心腦血管等疾病的多酚保健食品，可以創(chuàng)造出較高的經(jīng)濟效益。試驗以75%的甲醇為提取劑，多級萃取法結(jié)合微波超聲波組合萃取儀輔助處理后從核桃青皮中獲得多酚類化合物提取物，用TLC-CMS 等技術對其進行檢測和表征。應用Plate ExpressTM 技術可直接從TLC 薄層板上獲取質(zhì)譜圖，其優(yōu)點是不經(jīng)過樣品前處理，可快速從復雜混合物中獲得目標物分子質(zhì)量信息，并對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及主要儀器

材料：核桃青皮、葉、枝條，采集于呂梁當?shù)亍?/p>

試劑：甲醇、石油醚、氯仿、苯、甲苯、丙酮、甲酸、冰乙酸、乙酸乙酯、鹽酸、山奈酚、環(huán)己烷。

主要儀器：ALB-224 型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)品；XH-300B 型微波-超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；KH-3000Plus 型薄層色譜儀，上海科哲生化科技有限公司產(chǎn)品；Expressions 質(zhì)譜儀和Plate ExpressTLC-質(zhì)譜接口，美國Advion 公司產(chǎn)品；Tensor-11 型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司產(chǎn)品。

1.2 核桃青皮中多酚類化合物提取

按料液比1∶30 進行浸提（加75%甲醇），用超聲波微波萃取儀分3 個階段提取，每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，設置溫度為45，50，55 ℃；超聲功率為800，850，900 W；微波功率為100，200，300 MHz；超聲頻率為50 kHz，模式15∶10，電機轉(zhuǎn)速900 r/min。

提取液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，3 次，合并上清液，在65 ℃下濃縮至1/4 體積時為止。2%鹽酸調(diào)pH 值至2~3，用等量的石油醚除雜，3 次，再用等量的氯仿萃取3 次，濃縮后用色譜醇定容至10 mL。

1.3 薄層色譜分離純化

用內(nèi)徑<1 mm 的管口平整的毛細管在活化硅膠板上進行點樣，展開劑濕潤展開缸20 min 左右，將已點樣的薄層板放入展開缸中，當展開劑上升到薄層板的前沿（離前端5~10 mm） 時取出，將薄層板平放晾干后于薄層成像系統(tǒng)中觀察[16]。并計算Rf 值。

1.4 紅外光譜檢測

將儀器和軟件打開使其處于工作狀態(tài)，測量單通道背景光譜，然后將樣品用毛細管點樣至光學臺的金剛石上，再進行單通道樣品光譜的測量。然后將檢測出來的光譜轉(zhuǎn)換成倒峰，選擇單峰檢索標出每一個特征峰，分析并保存圖譜[17]。每一個樣品測量后，都需要進行譜圖處理，如進行氣氛補償，可消除 CO2、H2O 的干擾。

1.5 質(zhì)譜分析

1.5.1 標準品的質(zhì)譜檢測

用色譜甲醇和超純水作為流動相。將儀器和軟件打開使其處于工作狀態(tài)，用微量進樣器吸取10 μL的山奈酚標準品溶液插入到進樣口處，打到load 檔開始進樣，進完樣后打回到inject 檔。點開界面對譜圖進行分析，并保存。

1.5.2 待測液的質(zhì)譜檢測

流動相與待測標準品的流動相相同。將儀器和軟件處于工作狀態(tài)，把待測品薄層板置于TLC-質(zhì)譜接口上，使激光對準圈出的山奈酚標準品斑點中心處。用軟件操作進行取樣，30 s 后獲得質(zhì)譜圖，通過界面對譜圖進行分析，并保存。

1.6 熔點、旋光度分析

物質(zhì)的熔點（melting point），即在一定壓力下，純物質(zhì)的固態(tài)和液態(tài)呈平衡時的溫度。用熔點儀對提取的物質(zhì)熔點進行檢測。使用熔點儀時，首先將提取的樣液放入蒸發(fā)皿中，在電熱板上蒸發(fā)結(jié)晶成為固體，然后將固體放入一端封口的毛細管中，插入熔點儀中，按照下圖調(diào)節(jié)適當?shù)碾妷簛砩郎兀敼腆w變?yōu)楣桃浩胶獾臓顟B(tài)時溫度計顯示的溫度即為該物質(zhì)的熔點。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮提取率

核桃青皮多酚類和醌類的總提取率見表1。

表1 核桃青皮多酚類和醌類的總提取率

2.2 薄層色譜分離純化

核桃青皮氯仿相TLC 成像圖見圖3，核桃青皮、嫩葉、陳葉和嫩枝氯仿相TLC 成像圖見圖4，核桃不同部位氯仿相與標準品的TLC 成像圖見圖5。

圖3 核桃青皮氯仿相TLC 成像圖

圖4 核桃青皮、嫩葉、陳葉和嫩枝氯仿相TLC 成像圖

圖5 核桃不同部位氯仿相與標準品的TLC 成像圖

由圖4 可以看出，在甲醇，氯仿，苯，石油醚（1∶10∶1∶3，V/V） 下，核桃青皮氯仿相展開效果良好，色譜斑點圖像清晰，斑點之間距離適中，無拖尾現(xiàn)象發(fā)生。查閱文獻分析可知，核桃青皮氯仿相中有酚類物質(zhì)和醌類物質(zhì)。

從圖5 可以看出，在甲醇、氯仿、苯、石油醚（1∶10∶1∶3，V/V） 下，核桃不同部位氯仿相全部展開。通過對比可知，核桃青皮和新葉中酚類和醌類物質(zhì)比較豐富，舊葉和嫩枝中成分較少。

核桃陳葉和嫩葉氯仿相顯色前TLC 成像圖見圖6，核桃陳葉和嫩葉氯仿相顯色后TLC 成像圖見圖7。

圖6 核桃陳葉和嫩葉氯仿相顯色前TLC 成像圖

圖7 核桃陳葉和嫩葉氯仿相顯色后TLC 成像圖

從圖6 可以看出，以甲苯∶丙酮（5∶1，V/V）為展開劑，核桃不同部位氯仿相完全展開，效果各異，但色譜斑點較為清晰。可初步確定核桃嫩枝、青皮、嫩葉、氯仿相中含有與山奈酚、橘皮素和柚皮素極性大致相同的物質(zhì)。

從圖7 和圖8 可以看出，核桃陳葉、嫩葉和熊果酸在甲苯∶丙酮（5∶1，V/V） 下完全展開、色譜斑點較為清晰，但顯色前未見熊果酸的色譜斑點，用10%硫酸乙醇顯色后各部分色譜斑點清晰。樣液與熊果酸相同的位置有條帶，可初步斷定核桃葉中含有與熊果酸極性大致相同的物質(zhì)。

從圖6、圖7 和圖8 可以看出，核桃不同部位含有與山萘酚、橘皮素、柚皮素和熊果酸極性相近的物質(zhì)，但要獲得準確結(jié)果需要通過對其質(zhì)譜圖和紅外光譜圖進行分析。

下面以山萘酚對照品為例進行分析。

2.3 核桃青皮中多酚類物質(zhì)的質(zhì)譜檢測與分析

將所提取的樣品與標準品對照看是否有相同的碎片，若有相同碎片，即可初步斷定所提取的物質(zhì)為多酚類物質(zhì)。

山奈酚標準品質(zhì)譜圖見圖8。

圖8 山奈酚標準品質(zhì)譜圖

從圖8 可以看出，山奈酚標準品的荷質(zhì)比為229，有55，129，143，這幾個碎片。與相關文獻山奈酚的質(zhì)譜圖有相同的碎片峰，不同的是山奈酚的相對分子質(zhì)量為286。原因可能是，質(zhì)譜分析中會出現(xiàn)碎片丟失現(xiàn)象，標準品用甲醇溶解，含有羥基較多，打碎片的過程中很有可能出現(xiàn)羥基丟失。而多酚類化合物也含有羥基，羥基丟失造成相對分子質(zhì)量減少。

核桃青皮色譜斑點A 的質(zhì)譜圖見圖9。

摳取圖5 中色譜斑點A，進行質(zhì)譜檢測。從圖9可以看出，色譜斑點A 質(zhì)荷比為229，與山奈酚標準品都有55，129，143 碎片峰，基本可以斷定斑點A 是山奈酚。

圖9 核桃青皮色譜斑點A 的質(zhì)譜圖

核桃青皮色譜斑點B 的質(zhì)譜圖見圖10。

摳取圖5 中色譜斑點B，進行質(zhì)譜檢測。從圖10 可以看出，色譜斑點B 質(zhì)荷比為333，與山奈酚標準品均出現(xiàn)129，143，229 的碎片峰，與山奈酚標準品的質(zhì)荷比229 相差4，可以基本得出斑點B 也為多酚類物質(zhì)。

圖10 核桃青皮色譜斑點B 的質(zhì)譜圖

核桃青皮色譜斑點A 和B 均具有多酚類物質(zhì)的分子離子峰，且碎片峰也基本一致。

2.4 核桃青皮中多酚類物質(zhì)的紅外光譜檢測與分析

經(jīng)查閱文獻可知，“酚醇羥基易締合，3 300 cm-1處有強峰”。苯環(huán)在1 500~1 800 cm-1處有強吸收峰，羥基（O-H） 在3 000~3 800 cm-1處有強吸收峰，羰基(-C=O-)在1 000~1 600 cm-1處會出現(xiàn)峰。因此，多酚類化合物的紅外出峰的位置在3 000~3 600 cm-1，1 000~1 800 cm-1之間會出峰。

山奈酚標準品紅外光譜圖（固態(tài)） 見圖11。

圖11 山奈酚標準品紅外光譜圖（固態(tài)）

從圖11 可以看出，山奈酚對照品固體紅外光譜檢測發(fā)現(xiàn)，在3 127 cm-1和1 175 cm-1兩處出現(xiàn)了強峰，這之間還出現(xiàn)了一些小峰，與文獻查閱結(jié)果一致。

山奈酚標準品紅外光譜圖（液態(tài)） 見圖12。

圖12 山奈酚標準品紅外光譜圖（液態(tài)）

從圖12 可以看出，山奈酚標準品（1 mg/mL）紅外檢測發(fā)現(xiàn)，在3 301，2 326，2 326，1 636，1 604 cm-1處出現(xiàn)強峰，在查閱文獻的范圍內(nèi)，由于標準品的溶劑是色譜醇。因此，羥基峰更為明顯一些。

核桃青皮斑點A 紅外光譜圖見圖13。

圖13 核桃青皮斑點A 紅外光譜圖

將從薄層板上刮下斑點A 用色譜醇溶解、過濾、定容到3 mL。

從圖13 可以看出，與山奈酚標準品比對，斑點A 的光譜圖幾乎相同的位置出現(xiàn)強峰，說明與山奈酚標準品所含官能團一致，初步斷定該物質(zhì)是山奈酚。

核桃青皮斑點B 紅外光譜圖見圖14。

圖14 核桃青皮斑點B 紅外光譜圖

將從薄層板上刮下斑點B 用色譜醇溶解、過濾、定容到3 mL。

從圖14 可以看出，斑點B 與山奈酚標準品出現(xiàn)強峰的位置基本相同，說明與山奈酚標準品所含官能團基本一致，可初步斷定斑點B 是與山奈酚結(jié)構(gòu)相似的多酚類化合物。

綜上所述，核桃青皮氯仿相中含有苯環(huán)、羥基、羰基等多酚類化合物含有的官能團，結(jié)合質(zhì)譜檢測結(jié)果，可以確定提取的物質(zhì)為多酚類化合物。

2.5 核桃青皮中多酚類物質(zhì)含量測定

山奈酚標準品光譜掃描圖見圖15。

圖15 山奈酚標準品光譜掃描圖

從圖15 可以看出，在0.02 mg/mL 下對山奈酚標準品進行光譜掃描，于波長360 nm 處出現(xiàn)了最大吸收峰。

配制0.01 mg/mL 山奈酚標準品標準溶液，稀釋為質(zhì)量濃度梯度為 0.02，0.025，0.03，0.035，0.04 mg/mL，根據(jù)其吸光度繪制標準曲線。

山奈酚標準品標準曲線及含量見圖16。

圖16 山奈酚標準品標準曲線及含量

圖16 為山奈酚標準品的標準曲線圖，即Abs=113.12c+0.019 （R=0.999 4）。

將核桃青皮色譜斑點A 和B 溶解、過濾，用色譜醇定容到3 mL 后進行濃度的測量，結(jié)果顯示，從7.2 g 核桃青皮中提取該物質(zhì)0.06 mg。

核桃青皮中山奈酚含量見表2。

表2 核桃青皮中山奈酚含量

2.6 熔點、旋光度結(jié)果分析

經(jīng)薄層分析后，確定出多酚類物質(zhì)的熒光斑點，用色譜醇溶解后成為樣液，將樣液進入全自動旋光儀中進行旋光度和比旋光度的測定。將樣液蒸發(fā)結(jié)晶，再進入熔點儀測熔點。

核桃青皮中山奈酚的熔點見表3，核桃青皮中山奈酚的旋光度見表4。

表3 核桃青皮中山奈酚的熔點 ℃

表4 核桃青皮中山奈酚的旋光度

3 結(jié)論

以75%甲醇作提取劑，料液比1∶30，用超聲波微波萃取儀分3 個階段提取，每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，設置溫度為45，50，55 ℃；超聲功率為800，850，900 W；微波功率為100，200，300 MHz；超聲波頻率為50 kHz，模式15∶10，電機轉(zhuǎn)速900 r/min。多級萃取后獲得氯仿相，多酚類和醌類總提取率為6.48%。

在甲醇∶氯仿∶苯∶石油醚 （1∶10∶1∶3，V/V)下，核桃青皮、嫩葉、陳葉和嫩枝展開效果良好，色譜斑點圖像清晰，無拖尾現(xiàn)象發(fā)生。與標準品比對發(fā)現(xiàn)，核桃不同部位中含有與山萘酚、橘皮素、柚皮素和熊果酸極性相近的物質(zhì)。

質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)，核桃青皮色譜斑點A 和B 的質(zhì)譜圖與山奈酚標準品的圖形幾乎一致，分子離子峰基本相同，且出現(xiàn)的離子碎片峰很接近；斑點A 和B 的紅外光譜圖與山奈酚標準品幾乎在相同的位置出現(xiàn)強峰，說明核桃青皮氯仿相中含有苯環(huán)、羥基、羰基等多酚類化合物的官能團；斑點A 和B 的熔點（282 ℃；296 ℃） 在山奈酚標準品的276~278 ℃范圍內(nèi)或附近，旋光度和比旋度分別為-0.53 和-59；-41.59 和 -59.00 范圍內(nèi)。

經(jīng)多次嘗試，確定核桃葉和枝最合適的展開劑為：乙酸乙酯∶甲苯∶甲酸=10∶8∶1（0.5 mL 冰乙酸可在一定程度上防止拖尾）。

TLC 對不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強的適應性，為從復雜的天然產(chǎn)物粗制品中提取不同特性（如不同極性） 的有效成分提供了有利條件。TLC 在核桃青皮生物活性物質(zhì)分離純化中具有操作簡便、容易掌握、回收率高、重現(xiàn)性好、分離效率高、分離量較大等特點，且能夠獲得較高的提取率[18-19]。因此，TLC 有望在標準品的制備、天然產(chǎn)物化學成分研究及新藥研發(fā)等領域得到更廣泛的應用。

TLC 從核桃青皮中制備多酚類物質(zhì)需要做進一步的表征分析。傅里葉紅外光譜儀可以準確分析有機物中的官能團，多酚類物質(zhì)的酚羥基在3 000~3 500 cm-1處有強吸收峰，提取物含有酚羥基，是多酚類化合物。質(zhì)譜儀可以直接檢測其相對分子質(zhì)量，與標準品的質(zhì)譜圖進行比對，可確定提取物為多酚類化合物。試驗過程中，紅外檢測出現(xiàn)的問題比較多。例如，樣品中出現(xiàn)了和甲醇相似的特征峰，分析其原因可能是由于定容時甲醇的量過大；樣品中所提物質(zhì)的含量較少等原因。

如果不是純的物質(zhì)，熔點差異就會比較大。核桃青皮中含有豐富的多酚類化合物，所以與單一標準品的熔點差異比較大；同類物質(zhì)雖然含有相同的官能團，但是由于結(jié)構(gòu)有較大的差異，其旋光度也會有所不同。

Plate ExpressTM 技術可直接從TLC 薄層板上獲取質(zhì)譜圖，其優(yōu)點是不經(jīng)過樣品前處理，可快速從復雜混合物中獲得目標物分子質(zhì)量信息，并對其進行鑒定。