一株產蛋白酶粘質沙雷氏菌的分子鑒定與發酵條件優化

張 利，盧利平，，丁功濤，楊舜銓，蔡新東，丁海娥

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730030；2.西北民族大學生物醫學研究中心中國-馬來西亞聯合實驗室，甘肅蘭州 730030）

蛋白酶是一類催化蛋白質水解的酶類[1]，其作用是將肽鏈間的肽鍵水解，從而達到降解蛋白質的目的。根據蛋白酶降解蛋白質這一特性，使得蛋白酶制品在飼料、食品、藥品、洗滌劑、皮革、化妝品等領域有較廣泛應用，蛋白酶占工業酶市場將近60%[2-3]。在飼料方面，蛋白酶能夠降解飼料的抗營養分子，維持腸道的微生態平衡，提高蛋白質消化利用率，提高動物腸道的消化能力[4-5]，促進腸道健康[6]。于書坤[7]研究發現，偏堿性蛋白酶不僅能提高飼料中蛋白質的利用率，也能提高飼料中淀粉、脂肪、纖維等結構碳水化合物的利用率，同時偏堿性蛋白酶能與內源蛋白酶和其他飼料酶發生互補作用促進動物腸道的吸收。在食品方面，木瓜蛋白酶可作為肉類潤滑劑、啤酒品質改良劑、餅干松化劑、調味品、保健品等[8]。在藥品方面，蛋白酶具有抗腫瘤和抗血栓、促進傷口愈合、外科消毒劑等作用[9]。由此可見，篩選產蛋白酶的菌株具有重要的意義。

近年來，在產蛋白酶菌株及其發酵條件等方面做出了很多方面的研究。王永紅等人[10]利用牛奶、豆漿作為選擇性培養基，從土壤、水體等自然環境及家禽內臟中篩選出2 株具有高效水解菜粕蛋白產氨基酸的短小芽胞桿菌。劉靜等人[11]從垃圾場淤泥、食堂排污水溝含蛋白量較高的土壤中篩選分離得到的菌株發酵產生的酶活為2.03 U/mL。陳蘢等人[12]從南昌大學食堂污水中篩選出一株高產蛋白酶解淀粉芽孢桿菌。目前，關于粘質沙雷氏菌進行發酵產酶的研究報道很少，大多數對粘質沙雷氏菌的研究都在其他方面。李鑫等人[13]利用天然存在的粘質沙雷氏菌Hal 為研究害蟲防治的試驗材料，發現顆粒劑噴灌法能有效防除雜草。駱縱縱等人[14]從土壤中篩選出一株對重金屬具有耐性的粘質沙雷氏菌，采用控制變量法對該菌去除鎘進行了研究，發現當Cd 質量濃度為3 mg/L，加菌量為4%，pH 值為9.4，菌齡為 4.5 h及處理時間為96 h 時，粘質沙雷氏菌對Cd 的去除效果最高可達到91.00%。王俊峰[15]在研究沙雷氏菌降解氟苯蟲酰胺過程中，發現粘質沙雷氏菌對氟苯蟲酰胺具有最高降解能力，48 h 降解率達到 52.6%。張平等人[16]在研究粘質沙雷氏菌對榛實象甲中腸細菌多樣性的影響，發現粘質沙雷氏菌能夠改變榛實象甲成蟲中腸細菌群落結構。對粘質沙雷氏菌產酶方面的研究報道較少，梅建鳳等人[17]從家蠶蛹的腸道中分離出一株產舍肽酶的粘質沙雷氏菌LL-413 菌株，發酵產酶活力達到1 126 U/mL。耿芳等人[18]從海南土壤中篩選出一株高產蛋白酶的粘質沙雷氏菌，蛋白酶活力可達到126 U/mL，經過優化發酵酶活力可達到1 932.3 U/mL。

為篩選出一株產蛋白酶的菌株，試驗以甘肅省蘭州市榆中縣崖灣奶牛場的牛糞便為篩選樣品，采用酪素培養基篩選出一株產蛋白酶菌株2021-9，通過革蘭氏染色、生理生化試驗、16S rDNA 序列測定予以鑒定，并對其生長條件和發酵條件進行研究，以期為該菌株產蛋白酶的產酶條件研究及應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

糞便樣品來自榆中縣崖灣奶牛場，糞便樣品中篩選得到一株產酶量較高的粘質沙雷氏菌。

1.1.2 培養基

①牛肉湯培養基：0.5%牛肉膏，1%可溶性淀粉，0.5%NaCI，pH 值 7.2~7.4，121 ℃下滅菌 20 min。②酪素培養基：0.4%干酪素，0.107%Na2HPO4·7H2O，0.036%KH2PO4，1.8%瓊脂，121 ℃下滅菌 20 min。③基礎培養基：0.3%葡萄糖，2%胰蛋白胨，0.5%NaCl。④基礎發酵培養基：5%豆粕，4%蔗糖，3.2%麩皮，0.03%KH2PO4，0.4%Na2HPO4·12H2O，121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 試劑

生化試劑盒，杭州微生物試劑有限公司提供；牛肉膏、可溶性淀粉、NaCI、干酪素、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、瓊脂、L - 酪氨酸、蔗糖、玉米粉、葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉，索萊寶生物科技有限公司提供；豆粕、麩皮、黃豆粉，北京鴻潤寶順科技有限公司提供。

1.1.4 儀器及設備

YXQ-LS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司產品；DHG-9146A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；AR224CN 型電子天平，奧豪斯儀器常州有限公司產品；Pico17 型高速離心機，熱電發光二級管有限公司產品；GENESYS 10S 型紫外可見分光光度計，美國Thermo 公司產品；L9 型可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產品；SW-CJ-1CU 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；SG2-FK 型便攜式pH 計；HH-S4A 型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離純化

稱取2.5 g 牛糞樣品，進行剪碎處理后接種至100 mL 牛肉湯培養基中，于37 ℃，180 r/min 條件下富集培養24 h。用生理鹽水梯度稀釋至1×10-4，1×10-5，1×10-6，在酪素培養基上進行平板涂布，將涂布好的平板置于37 ℃恒溫培養箱中培養2 d，篩選出具有透明水解圈的菌落，記錄菌落的形態、顏色、大小及水解圈大小等。將出現水解圈的菌落在酪素培養基上進行3~4 次平板劃線，確定為單一菌落后于25%的甘油，-80 ℃下保存。將篩選的菌株于酪素培養基進行復篩，測量透明圈直徑（H） 和菌落直徑（C），比較各個菌株H/C 值大小，將H/C值較大的、形態顏色較特殊的菌株作為目標菌株。

1.2.2 菌種鑒定

選擇上述步驟純化后水解圈大的、形態顏色較特殊的編號為2021-9 的菌株作為目標菌株。根據目標菌株的形態觀察、生理生化特征、16S rDNA 序列測序進行菌種鑒定。將初篩得到的菌株在酪素培養基上劃線得到單一菌落，記錄菌落的大小、顏色、形狀、質地等。挑取單一菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察染色結果。根據生理生化試劑盒說明書將處于對數生長期的菌液分別接入生化試劑管，37 ℃下培養24 h，記錄菌株的生理生化特征。將菌液委托北京六合華大基因科技股份有限公司利用通用測序引物 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 對 菌 株進行16S rDNA 序列進行擴增和測定。將序列結果在NCBI-BLAST 中進行比對，利用MEGA 7.0 軟件構建進化樹，確定該菌株種類。

1.2.3 菌株的生長曲線繪制

將已處于對數生長期的菌液接種至新的牛肉湯培養基中，在37 ℃，180 r/min 條件下進行搖床培養，每隔2 h 進行吸光度測定，利用Origin 9.0 軟件進行生長曲線的繪制。

1.2.4 菌株生長條件的研究

將保存在-80 ℃的菌株迅速解凍，接種在牛肉湯培養基中，于轉速180 r/min，溫度37 ℃的條件下培養 24 h，每隔2 h 測定A600，用吸光度值表示菌株生長情況。

（1） 不同碳源對菌株生長的影響。在2%胰蛋白胨，0.5%NaCl 中分別加入0.3%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉作為碳源，接種量0.1%，以不加菌株的培養基作為空白對照，于溫度37 ℃，轉速180 r/min 條件下培養12 h 后測定A600。

（2） 不同氮源對菌株生長的影響。在0.3%蔗糖，0.5%NaCl 中分別加入2%的胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、豆粕、干酪素作為氮源，接種量0.1%，以不加菌株的培養基作為空白對照，于溫度37 ℃，轉速180 r/min 條件下培養12 h 后測定A600。

（3） 不同溫度對菌株生長的影響。選擇0.3%蔗糖、2%酵母粉分別作為碳源、氮源，接種量0.1%，以不加菌株的培養基作為空白對照，于溫度33，35，37，39，41 ℃，轉速180 r/min 的條件下培養12 h后測定A600。

（4） 不同pH 值對菌株生長的影響。選擇0.3%蔗糖、2%酵母粉分別作為碳源、氮源，以培養基自然pH 值為基礎，調節pH 值分別為4.7，5.7，6.7，7.7，8.7，接種量0.1%，以不加菌株的培養基作為空白對照，于溫度39 ℃，轉速180 r/min 的條件下培養 12 h 后測定 A600。

1.2.5 不同培養基對菌株產酶能力的影響

將處于對數生長期的菌液按5%的接種量接種到發酵培養基中，37 ℃下培養48 h，利用福林酚法測定其酶活。試驗根據培養基對產蛋白酶活的影響，設定6 組培養基，培養基組成及編號。

不同培養基編號及其成分見表1。

表1 不同培養基編號及其成分

1.2.6 不同發酵培養基產酶活力測定

（1） 酪氨酸標準曲線的繪制。參照國標GB/T-23527-2009 蛋白酶制劑[19]繪制酪氨酸標準曲線，利用Excel 2010 軟件進行數據統計及處理，利用Origin 9.0 繪圖。

（2） 酶活測定。將發酵液置于4 ℃條件下，以轉速5 000 r/min 離心10 min 獲得粗酶液，利用福林酚法進行酶活力測定。

1.3 數據處理

測定結果使用Excel 2010 軟件進行數據統計，采用SPSS 22.0 軟件對試驗數據進行處理，Origin 9.0作圖，數據結果以平均值X±SD 表示。

2 結果與分析

2.1 產蛋白酶菌株的篩選

試驗得到9 株能在酪素培養基上產生透明水解圈的菌株，挑選了其中1 株H/C 值大的作為試驗的目標菌株（圖1），H/C 值為5.45，在酪素培養基上菌落呈現淡紅色、較大、呈圓形，光滑濕潤。菌株編號為2021-9，以做進一步研究。

菌株2021-9 透明圈見圖1。

圖1 菌株2021-9 透明圈

2.2 菌種鑒定

利用透明圈法從牛糞樣品中篩選出產蛋白酶的菌株2021-9。革蘭氏染色后發現為革蘭氏陰性菌，菌株為桿狀（圖2）。對菌株進行吲哚試驗、糖類發酵試驗、枸鹽酸試驗等生理生化特性測定。根據該菌株的形態和生理特征，確定該菌株屬于Serratia 屬。

菌株 2021-9 革蘭氏染色結果見圖 2，菌株2021-9 的主要生理生化特性見表2。

表2 菌株2021-9 的主要生理生化特性

圖2 菌株2021-9 革蘭氏染色結果

利用通用引物27F 和1492R 擴增菌株2021-9 的16S rDNA 序列用于測序分析，結果顯示該菌株的16S rDNA 核酸序列長度為1 500 bp，將此序列與NCBI 的數據庫中序列進行Blast 分析比對，顯示與Serratia marcescens 親緣關系最近，同源性為100%，因此可確定該菌株為粘質沙雷氏菌。利用Mega 7.0軟件構建16S rDNA 基因全序列為基礎的Neighbor-Joining 系統進化樹。

基于16S rDNA 基因序列建立的菌株2021-9 系統進化樹見圖3。

圖3 基于16S rDNA 基因序列建立的菌株2021-9 系統進化樹

2.3 菌株生長曲線

菌株2021-9 生長曲線見圖4。

由圖4 可知，該菌株的對數生長期為14 h 左右，在4~14 h 期間，菌株生長迅速；14~18 h 時，菌株生長較為緩慢；在14 h 以后，菌株生長呈平緩衰退趨勢生長，因此菌株數量最多的時期為14 h。

2.4 不同生長條件對菌株生長的影響

2.4.1 不同碳源對菌株生長的影響

探究碳源對菌株生長的影響，設定的碳源有葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉，圖5 為根據原液測得的吸光度稀釋5 倍后的結果。以蔗糖作為碳源時，菌株生長情況達到最佳，同時也發現以葡萄糖、麥芽糖、乳糖為碳源時，菌株的生長情況較為良好，可以明顯看出淀粉不宜作為該培養菌株生長的碳源。因為葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖都是單糖或者二糖，淀粉是多聚糖，相比多聚糖，菌株可能更容易直接利用單糖或者二糖，所以淀粉明顯不是適宜該菌株生長所需要的碳源。

碳源對菌株2021-9 生長的影響見圖5。

圖5 碳源對菌株2021-9 生長的影響

2.4.2 不同氮源對菌株生長的影響

在對該菌株進行最適碳源研究后，在以蔗糖作為碳源的基礎上，探究氮源對菌株生長的影響，設定的氮源有胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、豆粕、干酪素。圖6 為根據原液測得的吸光度值稀釋5 倍后的結果。以酵母粉作為氮源時，該菌液的吸光度值最高，菌株生長情況最佳，而以干酪素作為該菌株生長的氮源時吸光度值最低，因此酵母粉是該菌株最適宜生長所需的氮源。干酪素的主要成分是酪蛋白[20]，相比于以上幾種作為氮源時，酪蛋白含量相對較多，可能是由于該菌株對酪蛋白的利用率低，因此干酪素是不適宜菌株2021-9 生長。

氮源對菌株2021-9 生長的影響見圖6。

圖6 氮源對菌株2021-9 生長的影響

2.4.3 不同溫度對菌株生長的影響

在探究該菌株最適生長的碳源、氮源分別為蔗糖、酵母粉的基礎上，設定5 個溫度梯度探究溫度對菌株生長的影響。圖7 為根據原液測得的吸光度值稀釋6 倍后的結果。該菌株最適生長的溫度條件為39 ℃，最不適宜該菌株生長的溫度條件為41 ℃。菌株2021-9 在低于41 ℃的情況下生長都較為良好，而在以41 ℃為培養條件時，菌液的吸光度值明顯低于以其他溫度培養的菌液，說明該菌株可能適宜較低溫度環境下生長。

溫度對菌株2021-9 生長的影響見圖7。

圖7 溫度對菌株2021-9 生長的影響

2.4.4 不同pH 值對菌株生長的影響

在探究該菌株最適生長的碳源、氮源、溫度分別為蔗糖、酵母粉、39 ℃的基礎上，根據原培養基自然pH 值設定5 個pH 值梯度。圖8 為根據原液測得的吸光度值稀釋5 倍后的結果。該菌株最適生長的pH 值是8.7，同時pH 值為4.7~7.7 時也適合該菌株的生長，說明適宜菌株2021-9 生長的pH 值范圍比較廣。

pH 值對菌株2021-9 生長的影響見圖8。

圖8 pH值對菌株2021-9 生長的影響

2.5 培養基對該菌株產酶的影響

2.5.1 酪氨酸標準曲線

酪氨酸標準曲線見圖9。

圖9 酪氨酸標準曲線

2.5.2 不同培養基對菌株發酵產酶的影響

以基礎發酵培養基為基礎，設定了其他發酵培養基，培養基編號分別為A，B，C，D，E，F。由圖10 可知，F 號培養基產酶活力達到最大，最大酶活為29.834 U/mL，培養基A，B，E 發酵也有較大酶活。因此，最適宜該菌株發酵的培養基組成為3.2%麩皮，3%黃豆粉，4%玉米粉，0.4%Na2HPO4，0.03%KH2PO4。

不同培養基對2021-9 菌株發酵產酶的影響見圖10。

圖10 不同培養基對2021-9 菌株發酵產酶的影響

3 結論

從甘肅省蘭州市榆中縣崖灣奶牛場的牛糞中篩選出一株能夠產蛋白酶的菌株，編號為2021-9，經革蘭氏染色、生理生化鑒定、16S rDNA 鑒定為粘質沙雷氏菌。粘質沙雷氏菌又稱為靈桿菌，廣泛存在于水、空氣、土壤、食品中，產生一種紅色的非擴散性色素——靈菌紅素[21-22]，靈菌紅素是微生物的次級代謝產物，是一種天然紅色素，具有抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、免疫制劑等重要活性，在醫藥、環境、染料等方面具有重要應用[23-24]。在靈菌紅素方面有多種研究，如李穎等人[25]從土壤中篩選出一株產靈菌紅素的粘質沙雷氏菌PG12，確定菌株發酵合成靈菌紅素的條件26 ℃，pH 值7.5，發酵14 h后靈菌紅素量可達到最大值1 212.7 mg/L。Nguyen Van Bon 等人[26]以粘質沙雷氏菌TNU02 為發酵菌體，脫礦蟹殼粉為原料低成本生產靈菌紅素。試驗以牛肉湯為培養基，180 r/min，37 ℃的條件對2021-9 菌株進行培養，發現在培養6 h 后該菌株達到最大生長濃度，即為對數生長期。在以基礎培養基培養該菌株的前提下，探究碳源、氮源、溫度、pH 值對該菌株生長的影響，發現最適該菌株生長的培養基組成及條件為0.3%蔗糖，2%酵母粉，0.5% NaCl，pH 值8.7，溫度37 ℃。設定6 種培養基對其進行發酵培養，得到最優培養基為3.2%麩皮，3%黃豆粉，4%玉米粉，0.4%Na2HPO4，0.03%KH2PO4，最大酶活可達29.834 U/mL。因此，后續工作可針對發酵培養基成分和發酵條件進行優化，為進一步提高酶活提供一定的研究基礎。