野慈姑(Sagittaria trifolia)人工授粉的有效性：授粉工具與花粉保存

解季明,丁新穎,張宇杰,汪正祥,3,戴 璨,3,*

1 湖北大學資源環境學院, 武漢 430062 2 湖北大學生命科學學院, 武漢 430062 3 區域開發與環境響應湖北省重點試驗室, 武漢 430062

人工授粉是一項能夠解決諸多農業生產問題以及促進科學研究的關鍵性技術。一方面,它能夠有效提高授粉成功率、座果率以及果實質量,避免不利的自然因素,保證農作物的經濟價值[1- 3]。例如藍莓[4]、可可[5]、椰棗[6]等作物均依賴人工授粉獲取較高的產量和經濟效益。另一方面,它也為研究人員探究植物繁育特征、交配系統以及傳粉互作等科學問題提供了一種行之有效的手段[7-14]。同時,人工授粉技術還有具有操作便捷的特點：將前期收集的新鮮花粉(花藥)置于存儲容器中,并通過毛刷、棉簽、鑷子或特制授粉工具將花粉多次輕柔緩慢地涂抹于柱頭之上便可完成授粉。因此,人工授粉技術一經推出,便迅速應用于諸多領域。

雖然人工授粉的方法一直被廣泛采用,但是一項綜述研究指出該方法背后的基礎問題很少被關注,試驗驗證更是鳳毛麟角[15]。其中之一即為花粉從活體植物取下后授粉前的保存問題,因為花粉的儲存環境對于人工授粉而言至關重要,不利的溫度以及較長的時間均可能會快速降低花粉活性,進而對試驗結果產生干擾。已有部分文獻報道了某些物種花粉的長期保存技術與條件,低溫保存似乎是一個良好的方式,能夠有效維持花粉活性處于較高水平,但具體的儲藏溫度取決于物種特性。比如,Abreu和Oliveira[16]將獼猴桃(Actinidiadeliciosa)花粉置于不同溫度下進行儲藏,發現-20℃條件下儲藏54周的花粉活性和萌發率均高于20℃、-80℃、-196℃處理。Maryam等[17]也指出-20℃是椰棗(Phoenixdactylifera)花粉的最佳儲藏溫度。但Bhat等[18]在三種梨屬(Pyrusspp.)栽培種的儲藏試驗中發現-196℃下萌發率最高。上述研究均顯示出溫度對于花粉的活性具有一定的影響。令人遺憾的是,雖然Stone等人的綜述已經發表了20余年,但近些年的人工授粉試驗似乎在離體花粉保存條件方面并沒有明顯的提及[19-21]。大多數研究僅模糊表述采用“新鮮”花粉,也沒有試驗驗證花粉的儲藏條件是否影響花粉的活性、可用性[22-24]。

為了達到定性或定量授粉的目的,人工授粉時常常借助毛刷等工具混合和涂抹花粉。相較于直接用雄花(花藥)接觸雌蕊授粉,毛刷授粉還具有授粉均勻、操作便利、標準統一等優勢,一直以來被普遍采用[25-30]?；蛟S是應用廣泛且效果良好(座果結籽得到了保證),幾乎所有的試驗都默認了工具授粉與其他授粉方法的等效性。然而,已經有不少研究發現使用毛刷進行人工授粉后的座果或結實下降的情況。比如,Matsumoto和Takakura[31]用混合花粉對日本本土蒲公英(Taraxacumjaponicum)進行了人工授粉,其種子數量顯著下降。Prokop和Neupauerová[32]報道了田旋花(Convolvulusarvensis)的人工授粉試驗組全部結實失敗,很可能因不當的授粉操作導致可能。上述試驗結果表明借助毛刷等工具的人工授粉在操作過程中可能存在諸多不可控因素對花粉或柱頭產生干擾,比如機械損傷、組織表面活性物質的變化、花粉粘稠度的破壞等[33-34]。此外,人工授粉也常常應用于花粉補充以探究植物的繁殖狀態[35],理論上補充后的座果結實應該不低于自然狀態,但是積累的證據表明補充授粉在一些物種中反而會降低繁殖表現[34,36- 38],從一個側面暗示了授粉方法本身的弊端。然而,甚少文獻直接關注人工授粉方法對繁殖的影響,如果工具授粉對植物產生了負面作用,相關結論的科學性則會大打折扣。

本文以多年生挺水植物野慈姑(Sagittariatrifolia)作為試驗材料,通過兩年的人工授粉試驗,比較了授粉方式、花粉處置以及花粉離體時間對于植物繁殖的影響,試圖解決如下問題：(1)借助毛刷工具的人工授粉是否影響野慈姑的結實？(2)花粉的處置溫度和離體時間如何影響野慈姑的結實？

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗于湖北省武漢市的中國科學院武漢植物園(114°25′18″E, 30°32′36″N)內進行。在園內選取了一塊高約1m的露天臺地作為同質園區,周圍無高大建筑物遮擋。野慈姑植株是2013年在湖北省22個自然種群采集的球莖克隆后代[39-40],共計58個基因型,258盆植株。

1.2 試驗材料

野慈姑 (SagittariatrifoliaL.) 隸屬于澤瀉科慈姑屬,是一種生長在池塘、沼澤、溝渠、水田等淺水處的多年生草本植物[41]。其繁育系統為雌雄異花同株,總狀花序,每輪一般三朵花,自下而上順次開放。花序基部為雌花,開放持續1—2d,頂部為雄花,開放持續4—10d,但單花花期均為1d。雌雄花部結構基本相同,都有三瓣白色花瓣,具花蜜。雌花中央的綠色球狀物為心皮,其多心皮離生,在頭狀花托上緊密分布,每個心皮具一個細小的花柱。雌花在授粉后20d左右發育為成熟的球形聚合瘦果。野慈姑依賴蟲媒傳粉,食蚜蠅、小型蜂類等多種昆蟲可為其傳粉[39]。植物花期從6月開始,大約持續至10月結束(湖北地區的盛花期為7—8月)。野慈姑自交親和、兼有有性繁殖(開花結實)和無性繁殖(地下球莖)。

1.3 試驗設計

1.3.12018年試驗

為了比較授粉方式是否影響野慈姑結實的數量與質量,試驗設計了硬毛刷授粉與接觸授粉兩種授粉方式。人工授粉方面,采用小排筆(美術用)給雌花授粉,花粉來源于整個同質園當日開放的所有雄花,每個植株至多取2朵雄花,將花藥放入塑料杯中混合均勻,用毛刷蘸取混合花粉,動作柔緩地涂抹在雌花的球形心皮上,直至均勻飽和。接觸授粉方面,由于直接用雄花的花藥與心皮接觸,不易控制授粉量,往往一兩朵雄花接觸后即達到飽和狀態。故授粉時選取與雌花植株種群來源相同或相近的兩個基因型的2朵雄花進行授粉(模擬自然異交狀態)[42]。為了避免昆蟲造成傳粉污染,嚴格在授粉前后對雌花進行套袋處理,并于人工授粉第二日將套袋摘除(雌花已不具備可授性),以免影響果實發育。

該試驗于2018年8月進行,共計完成硬毛刷授粉38朵花,接觸授粉52朵花。為防止果實成熟后散落,于授粉處理10d后對已發育的果實進行套袋。待果實成熟后(顏色變為褐色、緊致變為疏松狀態),采摘并置于牛皮袋中,每個袋中僅存放一個果實。

1.3.22019年試驗

為了細致比較毛刷授粉的副作用,授粉方式相較于2018年試驗增加至3種,即直接接觸授粉、軟毛刷授粉、硬毛刷授粉。其中硬毛刷授粉與2018年相同,采用小排筆,而軟毛刷授粉選用軟質眼影刷。二者刷毛質地的區別在于當前者接觸心皮授粉時,刷毛不會彎曲,而后者授粉時刷毛彎曲。接觸授粉方法與2018年相同,只是在雄花來源上為了盡量與毛刷授粉保持一致,隨機從整個同質園的植株中摘取。毛刷授粉方面,在2018年的基礎上,也限定了每杯混合花粉授粉雌花的上限,使得平均每朵雌花對應的雄花數量與接觸授粉相當。這些授粉細節的改進是為了更嚴格的控制花粉來源與授粉量,保證直接接觸和毛刷介質是幾種授粉方式的唯一區別。

本試驗還設計了第二個方面的控制,即授粉前的花粉處置。處理分為對照、低溫保存、高溫保存3個水平。低溫方面,將收集的雄花或混合花藥放入裝有冰盒的保溫冷藏箱內,儲存期間箱內溫度維持在5℃。冰盒沿冷藏箱邊緣放置,中間預留足量空間,以避免花粉與冰盒直接接觸。高溫方面,將收集的雄花或混合花藥塑料杯直接置于野外陽光直射處,儲存溫度隨每日天氣略有浮動,為(43.0±2.9)℃?；ǚ塾诘蜏鼗蚋邷乇４?0min后取出,采用直接接觸、軟毛刷或硬毛刷授粉。對照是將雄花或花藥從活體植物上摘下(混合)后,立即完成相應的授粉。

授粉方法與花粉處置兩個因素組合成了階乘設計,共計3×3=9種不同的處理。此外,為了進一步探究花粉活性的持續時間,還添加了一種低溫處置90min后軟毛刷授粉的處理。以上共計十種處理,每種處理重復約50個樣本(基因型)。為了控制母體效應,所有處理盡量在同一花序的不同雌花上完成且位置隨機。該試驗于2019年8月進行,花朵的套袋、果實的采集與處理方法與2018年相同。

1.3.3繁殖指標

采用座果概率、單果種子數量、種子大小、萌發率、幼苗芽長5個指標衡量野慈姑在不同授粉處理下的繁殖水平。其中,雌花若座果成功記為1,失敗記為0。果實采集回試驗室后,用解剖針與鑷子將果實內的所有種子平鋪于白色紙板上,保證種子之間不重疊。固定相機(尼康D7000)位置與焦距,垂直拍攝白色紙板,將圖片導入電腦,并使用軟件Image J統計單果種子數量與種子大小[37]。

在種子計數完成后,隨機從每個果實中選取100粒種子置于裝有自來水的塑料杯中,放入人工氣候箱(MGC- 350HP- 2,一恒,上海)中進行萌發培養。設定氣候箱內的溫度為30℃、相對濕度20%、光照時間18h、光照強度設定為最大值(20000lm)。待培養10d后,統計萌發率(出芽個數%)并測量最長的幼苗芽長(cm)。因2018年的分析顯示授粉方式對種子的萌發率、幼苗芽長均無影響(見結果),故2019年未進行萌發試驗。

1.4 數據處理

2018年的試驗采用單因素的方差分析,分別對座果概率、單果種子數量、種子大小,萌發率和幼苗芽長進行統計,其中座果概率采用二元分布的廣義線性模型(proc glimmix,dist=binary),其他變量為混合線性模型(proc mixed),所有模型中的固定因素為授粉方式,隨機因素為試驗日期,萌發率和幼苗芽長添加了萌發溫箱為隨機因素。

2019年的試驗采用二因素的方差分析,固定因素為授粉方式與花粉處置,兩者的交互作用所有模型均不顯著,故刪去。響應變量有座果概率、單果種子數與種子大小,其中座果概率采用二元分布的廣義線性模型(proc glimmix,dist=binary),其他變量為混合線性模型(proc mixed),所有模型中的隨機因素包括試驗日期和花朵輪次。此外,對低溫保存90min處理的結果,由于其采用軟毛刷授粉,將所有軟毛刷的處理集合,保證單一的授粉方式,單獨分析了花粉處置對座果結實的影響,模型同上。

本試驗的統計使用SAS 9.2軟件,在方差分析之前檢測了所有連續變量的正態性。其中,2018年的單果種子數與萌發率正態性較差,對單果種子數進行了開方轉換,萌發率進行了開方后反正弦轉換,其他變量直接使用原始數據。轉換后,所有連續變量的方差同質性均滿足。結果和圖表中均使用算術平均數±標準誤差。

2 結果與分析

2.1 授粉方式對野慈姑繁殖的影響

兩年的試驗均顯示出授粉方式對野慈姑的座果概率和單果種子數量產生了顯著影響(圖1、圖2)。與毛刷授粉相比,用雄花直接接觸的授粉方式達到了更高的座果(2018年：F1,80=6.22,P=0.015；2019年：F2,436=10.34,P<0.0001)和種子數(2018年：F1,59=41.07,P<0.0001；2019年：F2,342=8.78,P=0.0002)。不過,軟硬兩種毛刷質地對座果和種子數的不利影響并沒有顯著差異。由圖2和表1可知,授粉方式之間的種子大小(2018年表1；2019年：F2,342=1.14,P=0.32)、萌發率以及幼苗芽長均無顯著差異,這說明毛刷授粉對野慈姑的種子質量影響不大。

表1 2018年野慈姑在兩種授粉方式下的種子大小與萌發情況

圖1 2018年野慈姑在兩種授粉方式下的結實情況Fig.1 Fruiting status of Sagittaria trifolia under two methods of pollination in 2018圖條上方*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.0001

2.2 花粉處置對野慈姑繁殖的影響

花粉的處置方法對座果概率產生了顯著影響(F2,436= 4.59,P=0.011),其中,經過高溫保存的座果概率顯著高于對照組(圖2)。不過,處置水平之間的單果種子數量(F2,342=0.86,P=0.42；圖2)和種子大小無顯著差異(F2,342=0.48,P=0.62；圖2)。此外,低溫保存90min的花粉授粉后座果概率為(71±7)%,單果種子數為111.77±11.90,種子大小為(6.43±0.19)mm2。3個指標均與其他花粉處置條件差異不顯著(座果概率：F3,182=1.63,P=0.18；單果種子數：F3,126=1.24,P=0.30；種子大?。篎3,126=0.68,P=0.56),暗示90min的低溫存放不會影響野慈姑的花粉活性。

圖 2 2019年野慈姑在不同授粉方式和花粉處置下的繁殖情況Fig.2 Reproductive performance of Sagittaria trifolia under different methods of pollination and pollen handling in 2019圖條上方不同字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)

3 討論

根據兩年的試驗結果,授粉方式均顯著影響野慈姑的座果概率和單果種子數量(圖1、圖2),毛刷授粉操作對野慈姑的繁殖產生了負面影響。這一結果雖看似略顯意外,特別是考慮到毛刷授粉的廣泛采用、對繁殖的負面影響應該很小,但連續兩年的獨立試驗結果非常一致,都指出毛刷作為一種授粉工具確實降低了野慈姑的繁殖水平。相較于接觸授粉,硬毛刷授粉使得2018年的座果概率和單果種子數量分別下降了30%和67%,2019年的座果概率和單果種子數分別下降了17%和13%。可能的一個原因是：相較于花藥與柱頭的接觸,毛刷授粉也許對植株的花粉或柱頭造成了物理損傷[34,37]。考慮到自然狀態下,野慈姑的花粉附著在蜜蜂、食蚜蠅等昆蟲的腹部或腿部剛毛處,接觸可能更加柔和。不過,第二年的試驗增加了軟毛刷的處理,其結果顯示座果概率和單果種子數分別下降了19%和25%,這表明無論毛刷質地如何,毛刷授粉這一操作均對野慈姑的座果結實存在消極影響。軟硬兩種毛刷質地之間的繁殖表現并無明顯差異,這可能與野慈姑特殊的心皮結構有關,其多心皮離生,在頭狀花托上緊密分布,每個心皮都會伸出一個花柱,其柱頭細小脆弱,排列于心皮頂端[43-44]。相較于其他物種結實有力的大型花柱,如此敏感短小的花柱更容易因物理摩擦而受到損傷,不論毛刷的軟硬程度。當然,由于這種心皮結構的存在,每個小柱頭上不均勻的花粉落置也可能導致有些柱頭被飽和授粉而有些柱頭的花粉缺失,造成了局部的花粉限制進而導致座果結實的下降[44]。以上提到的方面在今后的試驗中可以通過授粉后立即鏡檢的方式進一步研究。此外,毛刷也可能對花粉的授精能力造成了一定的影響,如花粉從明顯黏合在一起的絮狀變為打散的顆粒狀,花粉表面的活性物質被毛刷吸附等等。結果還顯示,野慈姑經歷不同授粉方式后結實的種子大小、萌發率、幼苗芽長均保持穩定,表明種子質量不受毛刷的影響。多則研究表明野慈姑的種子大小在不同物理和授粉環境下較為穩定[39,45],說明其種子質量不同于數量,可能更多受到固有發育機制的調控。

不同花粉處置條件下,野慈姑的座果概率出現了顯著差異。高溫保存的花粉造成的座果率較高,這可能與高溫促進了花粉活性有關。雖然已有部分研究報道了高溫對花粉活性以及后續繁殖表現具有一定的負面影響[46-50],但Bajaj等[51]指出經歷高溫處理的煙草花粉后代表現優于未經歷高溫處理的,這與本試驗結果基本吻合。極端的試驗高溫確實會降低花粉活性,甚至導致花粉的死亡。但本試驗的高溫處理是在環境高溫下增加了花粉在野外的離體時間,并沒有將花粉置于非自然的極端高溫。由于野慈姑依賴蟲媒傳粉,當花粉附著于昆蟲體表時,便可以認為花粉處于離體狀態?？紤]到昆蟲在花間的飛行很不規律,短則幾分鐘之內便可完成授粉,長則甚至幾小時。若花粉活性短時間內快速失活,那么蟲媒傳粉的進化意義將大打折扣。因此,本試驗半小時的高溫處理證明了野外常規高溫并不會對離體的野慈姑花粉活性造成影響。相反,這樣的處置還提高了花粉表現,這可能因為試驗中花粉采摘的時間較早,溫度在一定時間的積累使得野慈姑花粉的酶活性達到一個較高水平[19,52]。同時,柱頭的可授性也可能因為溫度的積累而升高。90min的低溫保存結果暗示野慈姑的花粉活性短時間內不易損失,這可能與其蟲媒傳粉的特性有關。本試驗結果指出,野慈姑的人工授粉試驗可以在野外溫度下常規進行,其花粉離體后半小時內不需要特殊的處置就能保持甚而促進較高的活性。

4 結論

綜上所述,在進行人工授粉的操作中,授粉方式和花粉處置均會對野慈姑的繁殖產生影響,在試驗中采下花粉后可直接置于環境溫度短時間保存,授粉時盡量避免使用工具、采用雄花(花藥)與柱頭直接接觸的方法。

雖然人工授粉在諸多領域展現出高度的靈活和可控性,但研究人員應警惕授粉工具對授粉效果的影響。在控制對比試驗前,應當注意對授粉方式的驗證,以確保工具與其他授粉方式的等效性。尤其對于野慈姑這類柱頭細小脆弱的物種,更應注意授粉工具對繁殖造成的影響,以保障后續結論的科學有效。同時,還可根據不同類群植物的花藥或柱頭特性設計開發特定的授粉工具,以更好地完善人工授粉技術。不過,工具授粉也不一定在所有植物中都存在弊端。本試驗雖然差異顯著,但毛刷授粉的座果概率維持在70%上下,單果種子數在80—100波動,基本保證了中等偏上的繁殖產出。因此,在農業園藝等方面的具體實踐中,由于工具授粉的便利高效性十分突出,建議權衡利弊之后采用。