口蹄疫A 型抗體檢測試劑盒的篩選

劉起濤 郭天準 杜季梅 郭占達

1.申聯生物醫藥（上海）股份有限公司 200241

2.河南農業大學動物疫病檢測中心 450002

口蹄疫（Foot and mouth disease，FMD）是一種高度傳染的病毒性動物疫病，具有重大的政治經濟影響力，該病可感染偶蹄動物，包括豬、牛、綿羊和70 多種野生動物，也能感染一些非偶蹄類動物，如老鼠和大象?？谔阋叩陌l病特點是發熱、厭食、口腔和蹄部出現水泡等癥狀，也可能出現長期無癥狀感染而散毒的情況。根據口蹄疫病毒結構蛋白抗原性的差異，將口蹄疫病毒分為7 個血清型，分別是：O 型、A型、C 型、南非1 型（SAT-1）、南非2 型（SAT-2）、南非3型（SAT-3）和亞洲1 型（Asia 1），每個血清型還有一系列的血清亞型，不同血清型的口蹄疫病毒引起的臨床癥狀幾乎相同。控制和根除口蹄疫成本高昂且操作困難，大多數國家采取疫苗免疫的控制策略。我國從2001 年開始口蹄疫疫苗的強制免疫，豬口蹄疫O 型疫苗已免疫接種近20 年，豬群中口蹄疫O 型抗體水平保持較好水平。農業農村部《2018年國家動物疫病強制免疫計劃》中規定“各省根據評估結果自行確定是否對豬 A 型口蹄疫實施免疫”的免疫計劃。鑒于此，一些省份從2018 年開始對豬進行A 型口蹄疫疫苗的免疫接種，豬免疫口蹄疫疫苗之后28d 采集血清樣品進行免疫效果評估，選用穩定可靠的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結構蛋白抗體檢測試劑盒是評價疫苗免疫效果的關鍵所在。

本項研究從某省免疫豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）的9 個規?；i場，每場采集10 份血樣，共采集90 份血清樣品。血清樣品分別用購買的3 種不同廠家生產的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結構蛋白抗體ELISA 檢測試劑盒（簡稱試劑盒A、試劑盒B、試劑盒C），檢測豬口蹄疫病毒A 型抗體。本研究旨在比較市面上銷售的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結構蛋白抗體ELISA 檢測試劑盒的檢測效果，篩選出能夠有效檢測免疫接種豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）后A 型抗體的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結構蛋白抗體的檢測試劑盒，進而為評估豬群口蹄疫A 型抗體水平提供較好的檢測試劑盒參考。

1 材料和方法

1.1 儀器1510-03051 型全波長酶標儀購自Thermo 公司，THZ-98A 型恒振蕩器購自上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 材料

1.2.1 試驗疫苗豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13），國內某口蹄疫疫苗生產企業生產，批號：20191204。

1.2.2 血清樣品從某省免疫接種豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）的9 個規?；i場，每場采集10 份血樣，共采集90 份血樣（樣品編號為1-10、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、81-90）。

1.2.3 檢測試劑豬口蹄疫病毒A 型VP1 結構蛋白抗體ELISA 檢測試劑盒，試劑盒A，某生物技術有限公司生產，批號：20 200801；試劑盒B，某生物科技有限公司生產，批號：614201110A；試劑盒C，某科技有限公司生產，批號：200401。

1.3 方法

1.3.1 疫苗免疫接種選取60 日齡育肥豬，耳根后深層肌肉注射豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13），每頭豬注射1mL。

1.3.2 血清樣品收集88 日齡時采用前腔靜脈采血方式采集血樣，采集的90 份血樣用低速冷凍離心機4℃、3000rpm離心5 分鐘，分離出血清，2～8℃冷藏保存。

1.3.3 抗體檢測使用3 種豬口蹄疫病毒A 型VP1 結構蛋白抗體ELISA 檢測試劑盒分別進行抗體檢測，檢測結果按照相應說明書標準進行判定。

2 結果與分析

2.1 試劑盒檢測結果比較

2.1.1 試劑盒檢測抗體合格率3 種試劑盒的檢測結果見圖1，試劑盒A 和B 檢測的豬口蹄疫A 型抗體合格率分別為93.33%（84/90）、87.78%（79/90），試劑盒A 和B 檢測的抗體合格率基本一致，二者的敏感性較高。試劑盒C 檢測的豬口蹄疫A 型抗體合格率僅為25.56%（23/90），抗體合格率低，明顯低于試劑盒A 和B 的檢測結果。試劑盒C 敏感性較低可能是抗原反應板中包被的抗原種類與疫苗抗原不同有關。

圖1 三種試劑盒檢測的豬口蹄疫A 型抗體合格率

2.1.2 試劑盒檢測符合率90 份血清樣品用3 種試劑盒檢測，試劑盒A 與B 檢測均為陽性的血清有79 份、均為陰性的血清有6 份，試劑盒A 檢測為陽性而試劑盒B 檢測為陰性的血清有5 份，即試劑盒A 與B 檢測結果相同的血清有85 份、檢測結果不同的血清有5份，二者的符合率為94.44%（85/90）；試劑盒A 與C 檢測均為陽性的血清有23 份、均為陰性的血清有6 份，試劑盒A 檢測為陽性而試劑盒C 檢測為陰性的血清有61 份，即試劑盒A 與C 檢測結果相同的血清有29 份、檢測結果不同的血清有61 份，二者的符合率為32.22%（29/90）；試劑盒B 與C 檢測均為陽性的血清有23 份、均為陰性的血清有11 份，試劑盒B 檢測為陽性而試劑盒C 檢測為陰性的血清有56 份，即試劑盒A 與C 檢測結果相同的血清有34 份、檢測結果不同的血清有56 份，二者的符合率為37.78%（34/90）。試劑盒A 與B 的檢測符合率較高，試劑盒A、B 與試劑盒C 的檢測符合率較低。

2.2 豬群中口蹄疫A 型抗體情況9 個規?；i場（場1～場9）的采樣豬群抗體合格率見表1。根據試劑盒A 與B 的檢測結果可以看出，場1、3、5、6、7、8、9 免疫后28d 抗體合格率均達到100%（10/10），豬群抗體水平高、疫苗免疫效果較好；場2 的A 型抗體合格率未達到國家標準（70%以上）要求，需采取補免措施提高豬群抗體水平；場4 的A 型抗體合格率較好，個別豬只抗體不合格，需定期監測豬群口蹄疫A 型抗體水平，發現口蹄疫抗體合格低時及時做好豬群口蹄疫疫苗的加強免疫。

表1 豬場口蹄疫A 型抗體合格率

3 結論與討論

口蹄疫是一種嚴重危害畜牧業健康發展的高度傳染性的動物疫病，我國從2001 年開始對豬進行口蹄疫O 型疫苗的強制免疫，檢測口蹄疫病毒O 型抗體的試劑盒種類和方法已經成熟。2018 年開始，一些省份開始對豬進行口蹄疫A 型疫苗的強制免疫，疫苗免疫后與之配套的豬口蹄疫A 型抗體檢測試劑盒尚處于開發研究階段。

本研究分析比較3 種檢測試劑盒的檢測效果。試劑盒A 與B 檢測的A 型抗體合格率分別為93.33%、87.78%，與李偉等檢測的首免豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗后30d；楊虹等檢測的免疫接種豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗后28dA 型抗體合格率一致。試劑盒A 與B 檢測結果的符合率較高，表明這兩種試劑盒可用于豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗免疫效果評估。試劑盒C 檢測的A 型抗體合格率僅為25.56%，與試劑盒A 和B 的檢測符合率較低，不適用于豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗免疫效果評價，這可能與抗原反應板包被的VP1 結構蛋白特異性抗原有關。豬口蹄疫O 型、A 型二價合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）含有2 個O 型抗原、1 個A 型抗原，免疫接種后O 型抗原對豬只產生的免疫反應比A 型抗原更強烈。因此，7 個豬場豬群中A 型抗體合格率較高，也意味著豬群O 型抗體合格率較好。9 個規模豬場中場1、3、5、6、7、8、9 免疫后28d 抗體合格率達到100%，表明這7 個豬場豬群口蹄疫疫苗免疫效果較好，豬群的抗體整齊度較高，能為育肥豬生長周期內提供抗口蹄疫感染的良好保護。場2 檢測的A型抗體合格率低于國家標準，一方面的原因可能與疫苗注射時操作不當導致進入豬體頸部深層肌肉的疫苗量不夠；另一方面的原因可能是存在母源抗體干擾，導致免疫后一部分疫苗抗原被豬體內的母源抗體中和，兩種原因導致刺激豬只產生的免疫反應需要的抗原量不足，豬體產生的抗體水平較低。

本研究通過3 種不同的豬口蹄疫病毒A 型VP1 結構蛋白抗體的檢測試劑盒對免疫28d 后的血清樣品進行豬口蹄疫病毒A 型抗體的檢測，篩選出2 種能夠用于評估豬口蹄疫O型、A 型二價合成肽疫苗（多肽2700+2800+MM13）免疫效果的試劑盒，對豬場進行口蹄疫病毒A 型抗體的免疫效果評價提供了檢測試劑盒的參考。