丹參酮ⅡA減輕棕櫚酸誘導的心肌細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

王亞丹， 艾景雪， 高瑞， 李運麗， 張海波

（河南大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)三科，河南開封475000）

肥胖可造成系統(tǒng)性代謝紊亂，是循環(huán)系統(tǒng)疾病的重要危險因素[1]。富含高脂肪食物的飲食，尤其是飽和脂肪，會加重肥胖和脂毒性心肌病的風險[2]，且脂質(zhì)積累程度與心臟功能障礙有關(guān)[3]。如何干預脂毒性心肌病對心血管疾病的預防具有重要的研究意義。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，味苦、性微寒，入心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰功效，是常用的改善心血管疾病的中藥[4-5]。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的天然活性成分。已有研究表明：丹參酮ⅡA對心肌組織的缺血-再灌注損傷具有顯著的修復作用[6-7]；丹參酮ⅡA預處理1周后的心肌缺血大鼠模型中，梗死面積明顯減小[8]；丹參酮ⅡA可防止缺氧誘導的H9c2心肌細胞線粒體功能障礙[9]，可通過上調(diào)microRNA-133和激活蛋白激酶B（Akt）保護H9c2細胞免受氧化應(yīng)激誘導的細胞死亡[10]，也可通過磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPKs）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）依賴的自噬途徑保護心肌梗死后心衰[11]；丹參酮ⅡA可以通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制心肌細胞的凋亡[12-13]。鑒于丹參酮ⅡA具有較為明確的心肌保護作用，本研究進一步探討丹參酮ⅡA對棕櫚酸誘導的H9c2心肌細胞脂毒性損傷模型的保護作用及機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞大鼠胚胎心肌細胞H9c2（CM-0089），購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物、試劑與儀器丹參酮ⅡA（CAS：568-72-9，分子量：294.33）購自上海源葉生物科技有限公司，批號：B20257。棕櫚酸購自上海源葉生物科技有限公司，批號：JS688093；細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）、胰蛋白酶、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒、10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）試劑、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG、電化學發(fā)光（ECL）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；10 mg/mL RNaseA（上海翊圣生物科技有限公司）；RNA純化系統(tǒng)（Qiagen公司）；SuperScript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Invitrogen公司）；隨機六聚體（美國Sigma-Aldrich公司）；SYBR Green Master Mix（美國Thermo Fisher公司）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、轉(zhuǎn) 錄 激 活因 子4（ATF4）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）、Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、磷酸化PERK（p-PERK）、真核生物翻譯起始因子2α（eIF2α）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（美國CST公司）。Multiskan Sky酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司；ABI Prism 7000 PCR系統(tǒng)購自Applied Biosystems公司；ChemiDoc XRS+高靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 CCK-8法測定細胞活力用胰酶消化對數(shù)期H9c2細胞后，收集并計數(shù)，重懸細胞并接種于96孔板，分6組。即：①對照組：不做任何處理；②棕櫚酸（400 μmol/L）組：H9c2細胞培養(yǎng)24 h后，用400 μmol/L棕櫚酸誘導細胞；③丹參酮ⅡA 20 μmol/L組：H9c2細胞培養(yǎng)24 h后，用20 μmol/L丹參酮ⅡA誘導細胞；④棕櫚酸（400 μmol/L）+丹參酮ⅡA（5、10、20 μmol/L）3個濃度組：H9c2細胞培養(yǎng)24 h后，用400 μmol/L棕櫚酸誘導細胞，24 h后，分別加入不同濃度（5、10、20 μmol/L）的丹參酮ⅡA處理細胞。按照CCK-8試劑盒的操作說明，在含對應(yīng)藥物的100 μL培養(yǎng)基中培養(yǎng)22 h，加入10 μL CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀檢測每個孔在450 nm波長處的吸光度，然后檢測各組的H9c2細胞存活率。每組設(shè)置3個復孔進行實驗。

1.4 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡情況分組同“1.3”項。用體積分數(shù)70%乙醇4℃過夜固定H9c2細胞，然后加入RNaseA和PI 4℃染色過夜，再按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法操作，最后應(yīng)用流式細胞儀測定細胞凋亡率。AnnexinV-FITC（-）/PI（-）（左下）為正常細胞，AnnexinV-FITC（+）/PI（-）細胞（右下）為早期凋亡細胞，AnnexinV-FITC（+）/PI（+）（右上）為晚期凋亡細胞，AnnexinV（-）/PI（+）（左上）為壞死細胞。實驗重復3次。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法檢測心肌細胞GRP78、ATF4、CHOP mRNA表達分組同“1.3”項。用RNA純化系統(tǒng)提取總RNA。用SuperScript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機六聚體合成cDNA。在ABI Prism 7000系統(tǒng)中，使用SYBR Green Master Mix反應(yīng)體系和引物在優(yōu)化濃度下進行PCR反應(yīng)。GRP78、ATF4、CHOP和管家基因GAPDH的序列如下：GRP78正向引物序列為5’-GAAACTGCCGAGGCGTAT-3’，反向引物序列為5’-ATGTTCTTCTCTCCCTCTCTCTTA-3’；ATF4正向引物序列為5’-TCCGAATGGCTGGCTGTGG-3’，反向引物序列為5’-AGTGTAGTCTGGCTTCCTATC TCC-3’；CHOP正向引物序列為5’-GGAAACAGA GTGGTCATTCCC-3’，反向引物序列為5’-CTGCT TGAGCCGTTCATTCTC-3’；GAPDH正向引物序列為5’-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3’，反向引物序列為5’-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3’。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，重復40個循環(huán)。每個基因均生成標準曲線，擴增效率為90%~100%。通過閾值比較，確定基因表達的相對定量。結(jié)果以2ΔΔCt法計算。所有結(jié)果均以GAPDH為內(nèi)參進行歸一化。

1.6 蛋白免疫印跡（Western Blotting）法檢測心肌細胞GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α蛋白表達分組同“1.3”項。收集細胞，與細胞裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑、去磷酸化酶抑制劑在冰上混合20 min，收集裂解液，以4℃以13 000×g離心5 min，取上清。使用BCA蛋白定量試劑盒測量蛋白質(zhì)的濃度。取30 μg蛋白，加熱變性，經(jīng)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。使用體積分數(shù)2%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1 h。加入GRP78抗體4℃孵育過夜。加入羊抗兔IgG-HRP孵育1 h。最后，采用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒顯色，用高靈敏化學發(fā)光檢測儀觀察電泳 條 帶。ATF4、CHOP、Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、GAPDH檢測方法同上。

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有計量資料均以均數(shù)±標準差（±s）表示，以單因素方差分析（One-way ANOVA）方法進行多組比較，兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA逆轉(zhuǎn)了棕櫚酸誘導的H9c2細胞存活率的降低圖1結(jié)果顯示：與對照組比較，丹參酮ⅡA 20 μmol/L組的細胞存活率無顯著性差異（P>0.05），而棕櫚酸（400 μmol/L）組的細胞存活率顯著降低（P<0.01）；與棕櫚酸（400 μmol/L）組比較，不同濃度丹參酮ⅡA（5、10、20 μmol/L）與棕櫚酸共處理組的細胞存活率以劑量依賴性方式回升，且棕櫚酸+丹參酮ⅡA 10 μmol/L組（P<0.05）和棕櫚酸+丹參酮ⅡA 20 μmol/L組（P<0.01）細胞存活率回升有統(tǒng)計學意義。

圖1 丹參酮ⅡA對棕櫚酸誘導的H9c2細胞存活率的影響Figure 1 Effects of tanshinoneⅡA on survival rate ofpalmitic acid-induced H9c2 cells

2.2 丹參酮ⅡA緩解了棕櫚酸誘導的H9c2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激圖2-A結(jié)果顯示：與對照組比較，丹參酮ⅡA 20 μmol/L組細胞的GRP78、ATF4和CHOP的mRNA水平無顯著性差異（P>0.05），而棕櫚酸（400 μmol/L）組細胞的GRP78、ATF4和CHOP的mRNA水平顯著升高（P<0.01）；與棕櫚酸（400 μmol/L）組比較，不同濃度丹參酮ⅡA（5、10、20 μmol/L）與棕櫚酸共處理組細胞的GRP78、ATF4和CHOP的mRNA水平以劑量依賴性方式回降，且棕櫚酸+丹參酮ⅡA 10 μmol/L組（P<0.05）和棕櫚酸+丹參酮ⅡA 20 μmol/L組（P<0.01）細胞的GRP78、ATF4和CHOP的mRNA水平回降顯著。

圖2 -B結(jié)果顯示：與對照組比較，丹參酮ⅡA 20 μmol/L組細胞的GRP78、ATF4和CHOP的蛋白水平無顯著性差異（P>0.05），而棕櫚酸（400 μmol/L）組細胞的GRP78、ATF4和CHOP的蛋白水平升高顯著（P<0.01）；與棕櫚酸（400 μmol/L）組比較，不同濃度丹參酮ⅡA（5、10、20 μmol/L）與棕櫚酸共處理組細胞的GRP78、ATF4和CHOP的蛋白水平以劑量依賴性方式回降，且棕櫚酸+丹參酮ⅡA 10 μmol/L組（P<0.05）和棕櫚酸+丹參酮ⅡA 20 μmol/L組（P<0.01）細胞的GRP78、ATF4和CHOP的蛋白水平回降顯著。

圖2 丹參酮ⅡA對棕櫚酸誘導的H9c2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響Figure 2 Effects of tanshinoneⅡA on endoplasmic reticulum stress in palmitic acid-induced H9c2 cells

2.3 丹參酮ⅡA抑制了棕櫚酸誘導的心肌細胞的凋亡圖3-A結(jié)果顯示：與對照組比較，丹參酮ⅡA 20 μmol/L組細胞的凋亡率無顯著性差異（P>0.05），而棕櫚酸（400 μmol/L）組細胞凋亡率顯著升高（P<0.01）；與棕櫚酸（400 μmol/L）組比較，不同濃度丹參酮ⅡA（5、10、20 μmol/L）與棕櫚酸共處理組細胞的凋亡率以劑量依賴性方式回降，且棕櫚酸+丹參酮ⅡA 10 μmol/L組（P<0.05）和棕櫚酸+丹參酮ⅡA 20 μmol/L組（P<0.01）細胞的凋亡率回降顯著。

圖3 -B結(jié)果顯示：與對照組比較，丹參酮ⅡA 20 μmol/L組 細 胞 的Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12的蛋白表達水平無顯著性差異（P>0.05），而棕櫚酸（400 μmol/L）組的這3種蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；與棕櫚酸（400 μmol/L）組比較，不同濃度丹參酮ⅡA（5、10、20 μmol/L）與棕櫚酸共處理組細胞的Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12蛋白表達水平以劑量依賴性方式回降，且棕櫚酸+丹參酮ⅡA 10 μmol/L組（P<0.05）和棕櫚酸+丹參酮ⅡA 20 μmol/L組（P<0.01）細胞的凋亡率回降顯著。

圖3 丹參酮ⅡA對棕櫚酸誘導的H9c2細胞凋亡的影響Figure 3 Effects of tanshinoneⅡA on apoptosis of palmitic acid-induced H9c2 cells

2.4 丹參酮ⅡA阻礙了棕櫚酸誘導的H9c2細胞PERK信號通路的磷酸化圖4結(jié)果顯示：與對照組比較，丹參酮ⅡA 20 μmol/L組細胞的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例無顯著性變化（P>0.05），而棕櫚酸（400 μmol/L）組細胞p-PERK/PERK和peIF2α/eIF2α比例顯著增大（P<0.01）；與棕櫚酸（400 μmol/L）比較，不同濃度丹參酮ⅡA（5、10、20 μmol/L）與棕櫚酸共處理組細胞p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2αs比例以劑量依賴性方式回降，且棕櫚酸+丹參酮ⅡA 10 μmol/L組（P<0.05）和棕櫚酸+丹參酮ⅡA 20 μmol/L組（P<0.01）細胞p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例回降顯著。

圖4 丹參酮ⅡA對棕櫚酸誘導的H9c2細胞PERK信號通路磷酸化的影響Figure 4 Effects of tanshinoneⅡA on phosphorylation of PERK signaling pathway in palmitic acid-induced H9c2 cells

2.5 丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)PERK信號通路緩解棕櫚酸誘導的心肌細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為了進一步驗證丹參酮ⅡA對PERK信號通路的影響，本研究引入PERK通路激活劑CCT020312進行實驗，增加棕櫚酸（400 μmol/L）+CCT020312（3 μmol/L）組與棕櫚酸（400 μmol/L）+CCT020312（3 μmol/L）+丹參酮ⅡA（20 μmol/L）組。圖5-A結(jié)果顯示：與對照組比較，棕櫚酸組細胞的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例顯著增大（P<0.01）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+丹參酮ⅡA 20 μmol/L組細胞的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比 例 顯 著 減 小（P<0.01），而棕櫚酸+CCT020312組細胞的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比 例 顯 著 回 升（P<0.05）；與棕櫚酸+CCT020312組和棕櫚酸+丹參酮ⅡA組比較，棕櫚酸+CCT020312+丹參酮ⅡA組的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例顯著回降（P<0.05）。同樣，我們也考察了細胞凋亡率（圖5-B）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的GRP78、ATF4和CHOP的mRNA表達水平（圖5-C），得到了與上述信號通路結(jié)果相一致的結(jié)果。這些實驗進一步證實了丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)PERK信號通路緩解棕櫚酸誘導的心肌細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

圖5 丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)PERK信號通路對棕櫚酸誘導的H9c2細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響Figure 5 Effects of tanshinoneⅡA on apoptosis and endoplasmic reticulum stress in palmitic acid-induced H9c2 cells by modulating the PERK signaling pathway

3 討論

肥胖是包括代謝綜合征和心肌病等在內(nèi)一系列疾病的危險因素，其脂毒性是一個重要方面[14]。肥胖和脂質(zhì)積累會加快心血管系統(tǒng)的非脂肪細胞中過多脂質(zhì)的積累，導致細胞功能障礙和細胞死亡，造成脂毒性心肌病[14]。棕櫚酸是最常見的飽和長鏈脂肪酸，在包括心肌細胞在內(nèi)的許多細胞類型中都能觸發(fā)細胞凋亡[15]。故本研究選擇棕櫚酸400 μmol/L刺激H9c2心肌細胞構(gòu)建心肌細胞脂毒性損傷模型。在此細胞模型上，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，棕櫚酸400 μmol/L組心肌細胞存活率、凋亡率明顯升高（P<0.01），說明在體外環(huán)境中棕櫚酸可通過誘導心肌細胞凋亡而發(fā)揮脂毒性作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是脂代謝密切相關(guān)的細胞器[16]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的破壞使大量錯誤或者未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，激活相應(yīng)的信號通路，引起一系列的細胞反應(yīng)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)合成或修飾關(guān)鍵酶的表達水平來影響脂質(zhì)代謝；另一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導的細胞凋亡或細胞膜組件的異常合成可介導心肌細胞脂毒性損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，以棕櫚酸為代表的心肌脂毒性誘導過程中，發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活了葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、真核生物翻譯起始 因 子2α（eIF2α）、蛋 白 激 酶R樣 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 激酶（PERK）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）和Caspase蛋白等相關(guān)凋亡通路[2]。由此推測，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的激活及其相關(guān)蛋白的表達調(diào)控可能是心肌細胞脂毒性損傷的機制之一，減輕心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有望延緩脂毒性心肌病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，棕櫚酸組細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例也顯著增大（P<0.01），凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。不同濃度丹參酮ⅡA作用后，H9c2細胞的存活率升高，H9c2細胞的凋亡率降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)蛋白的表達水平降低（均P<0.01）。加 入PERK通 路激 活劑CCT020312作 用后，與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+CCT020312組的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例，細胞凋亡率，GRP78、ATF4、CHOP的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）；再經(jīng)過丹參酮ⅡA處理，與棕櫚酸+CCT020312組比較，棕櫚酸+CCT020312+丹參酮ⅡA組的p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比例，細胞凋亡率，GRP78、ATF4、CHOP的mRNA和蛋白表達水平均顯著回降（P<0.05）。提示丹參酮ⅡA通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白PERK和eIF2α的磷酸化下調(diào)了棕櫚酸誘導的H9c2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CRP78、ATF4和CHOP的表達，起到抑制棕櫚酸誘導的H9c2細胞凋亡的作用。結(jié)果表明，丹參酮ⅡA可修復棕櫚酸刺激的心肌細胞損傷，其作用機制與減輕棕櫚酸引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡有關(guān)。

綜上所述，本課題體外研究結(jié)果證明了棕櫚酸能啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活PERK信號通路，誘導心肌細胞凋亡，引起心肌細胞脂毒性損傷，而丹參酮ⅡA可阻斷該通路，抑制心肌細胞脂毒性損傷。本研究初步通過體外實驗探討了丹參酮ⅡA抗心肌細胞脂毒性作用，為今后在體內(nèi)和動物實驗環(huán)境中研究丹參酮ⅡA對脂毒性心肌病的干預機制提供了可靠的實驗依據(jù)。