芪葛湯有效成分降脂的體外初篩實(shí)驗(yàn)

張偉嬌， 譚梅傲， 柯雪紅， 周遵明， 黃可兒

（1.深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東深圳518000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405；4.嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510405）

芪葛湯是由黃芪30 g、葛根10 g、陳皮5 g組成。方中：黃芪，甘，微溫，入脾、肺經(jīng)，具有健脾補(bǔ)中的功效；葛根，甘、辛，涼，歸脾、胃經(jīng)，具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉的功能；陳皮，苦，溫，歸脾、肺經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效。本課題組多年致力于芪葛湯的藥理研究，芪葛湯對(duì)大鼠酒精性肝損傷具有治療作用，芪葛湯預(yù)給藥不僅能降低酒精性肝損傷大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），通過代謝組學(xué)分析亦發(fā)現(xiàn)其還能改善酒精性肝損傷的甘油磷脂、色氨酸、花生四烯酸等脂質(zhì)產(chǎn)物的代謝[1]，表明芪葛湯可能具有降脂的藥理作用。

在前期實(shí)驗(yàn)中，本課題組共篩選了多個(gè)芪葛湯的入血移行成分[2]，包括川陳皮素、3’-羥基葛根素等，而黃芪甲苷、葛根素為黃芪、葛根的主要成分，因此，本研究共篩選黃芪甲苷（astragalosideⅣ，AS-Ⅳ）、葛根素（puerarin）、川陳皮素（nobiletin）、3’-羥基葛根素（3’-hydroxy puerarin）、毛 蕊 異 黃 酮（calycosin）、柚 皮 素（naringenin）、槲皮素（quercetin）等7個(gè)有效成分進(jìn)行體外的初篩實(shí)驗(yàn)。

由于體內(nèi)環(huán)境與體外環(huán)境的差異，本實(shí)驗(yàn)采用300 μmol/L油酸+150 μmol/L棕櫚酸+100 μmol/L亞油酸構(gòu)建大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的模型，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞的甘油三酯（TG）含量并應(yīng)用油紅O染色法觀察肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積情況，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 細(xì)胞大鼠BRL肝細(xì)胞系購自于國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)，培養(yǎng)條件：DMEM高糖培養(yǎng)基＋10%胎牛血清（FBS）＋1%青霉素-鏈霉素；凍存條件：DMEM高糖培養(yǎng)+8%二甲基亞砜（DMSO）+20%FBS。

1.2 藥品黃芪甲苷分析標(biāo)準(zhǔn)品[高效液相色譜（HPLC）≥99.89%]、川 陳 皮 素 分 析 標(biāo) 準(zhǔn) 品（HPLC≥98.5%）、毛蕊異黃酮分析標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98.5%）、柚皮分析標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥99.18%）（成都曼思特生物科技有限公司）；葛根素分析標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）（上海源葉公司）；3’-羥基葛根分析標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）[Cato research chemical（中國）公司]；槲皮素分析標(biāo)準(zhǔn)品（中科院藥檢所）。

1.3 試劑與儀器亞油酸（西安鯤創(chuàng)公司）；油酸鈉、棕櫚酸鈉（美國Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（0.25%）、青霉素-鏈霉素美國Gibco公司）；TG檢測(cè)試劑盒（九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；油紅O染色液（北京Solarbio公司）。CKS53倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；BS-220全自動(dòng)生化儀（美國邁瑞公司）；BIORAD550酶標(biāo)儀（日本Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 棕櫚酸與油酸的配制由于棕櫚酸與油酸均不溶于水，故采用牛血清蛋白（BSA）配制6 mmol/L棕櫚酸與12 mmol/L油酸。具體操作方法：使用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制3 mL 20% BSA與40%BSA。稱取21.92 mg油酸鈉與10.02 mg棕櫚酸鈉，分別加入3 mL PBS，75℃恒溫水浴箱加熱溶解油酸鈉與棕櫚酸鈉。將油酸鈉快速加入到20% BSA中，棕櫚酸鈉加入到40%BSA中。

2.2 大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積體外模型的構(gòu)建將BRL細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組。其中：正常對(duì)照組不處理，模型組加入300 μmol/L油酸+150 μmol/L棕櫚酸+100 μmol/L亞油酸誘導(dǎo)24 h構(gòu)建大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積體外模型。

2.3 有效成分的配制使用DMSO配制100 mmol/L黃芪甲苷、40 mmol/L川陳皮素、500 mmol/L 3’-羥基葛根素、500 mmol/L毛蕊異黃酮、500 mmol/L柚皮素、100 mmol/L槲皮素儲(chǔ)存液。葛根素臨用前DMEM配制5 mmol/L葛根素。

2.4 應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)篩選各有效成分無毒性的濃度

2.4.1 MTT實(shí)驗(yàn)分組①黃芪甲苷：設(shè)置空白對(duì)照組，DMEM組，DMSO溶劑組，100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μmol/L黃芪甲苷溶液組。②葛根素：由于葛根素在水溶液中溶解度相對(duì)較高，可不利用DMSO助溶，故設(shè)置空白對(duì)照組，DMEM組，5 000、2 500、1 000、500、250、100、50、25 μmol/L葛根素組。③川陳皮素：設(shè)置空白對(duì)照組，DMEM組，DMSO溶劑組，40、20、10 μmol/L川陳皮素組。④3’-羥基葛根素：設(shè)置空白對(duì)照組，DMEM組，DMSO溶劑組，500、250、125、75、37.5、18.75、9.375 μmol/L 3’-羥基葛根素組。⑤毛蕊異黃酮：設(shè)置空白對(duì)照組，DMEM組，DMSO溶劑組，500、250、125、75、37.5、18.75、9.375 μmol/L毛蕊異黃酮組。⑥柚皮素：設(shè)置空白對(duì) 照 組，DMEM組，DMSO溶 劑組，500、250、125、75、37.5、18.75、9.375 μmol/L柚皮素組。⑦槲皮素：設(shè)置空白對(duì)照組，DMEM組，DMSO溶 劑 組，100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 μmol/L槲皮素組。①~⑦除空白對(duì)照組無肝細(xì)胞，僅加入PBS，其他組別均含肝細(xì)胞。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

2.4.2 MTT實(shí)驗(yàn)操作步驟胰酶消化細(xì)胞，重懸計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞鋪板在96孔板中，每孔加入2×103個(gè)細(xì)胞（鋪板數(shù)量取決于細(xì)胞增殖速度）。1 d后，待細(xì)胞鋪板后，每孔加入相應(yīng)的藥物干預(yù)。待藥物干預(yù)24、48 h后，小心的吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTT溶解。37℃孵育4 h左右，吸掉液體，每孔加入150 μL DMSO溶液。振搖10 min后，應(yīng)用酶標(biāo)儀于490 nm波長處讀取吸光度值。

2.5 有效成分干預(yù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞鋪板于6孔板中，根據(jù)MTT結(jié)果，選擇適宜劑量干預(yù)。中藥單體干預(yù)24 h后，小心吸取培養(yǎng)基，棄掉。重新加入相同濃度的單體干預(yù)，同時(shí)以300 μmol/L油酸+150 μmol/L棕櫚酸+100 μmol/L亞油酸誘導(dǎo)構(gòu)建肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積模型，24 h后，抽提細(xì)胞TG、固定行油紅O染色。

2.5.1 細(xì)胞TG的抽提與檢測(cè)①氯仿與甲醇提取：為提取脂質(zhì)被廣泛采用的方法。具體操作方法：胰酶消化細(xì)胞后，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入抽提液（氯仿∶甲醇=2∶1）1 mL，并重懸細(xì)胞。超聲裂解細(xì)胞10 min。超聲工作效率99%，工作頻率25 kHz。放入4℃抽提24 h。以12 000 r/min（離心半徑5 cm）離心30 min。吸取上清，加入1/5的純水洗滌，并渦旋15 s。以2 000 r/min（離心半徑5 cm）離心10 min，棄上清。低速流量氮吹樣本，以免脂質(zhì)殘留到管壁。加入200 μL無水乙醇復(fù)溶，必要時(shí)90℃水浴鍋中復(fù)溶。全自動(dòng)生化儀上機(jī)檢測(cè)樣本。②異丙醇提取：在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，氯仿與甲醇的提取需要經(jīng)過多個(gè)不同的步驟，步驟過程中對(duì)脂質(zhì)耗損較多，故本實(shí)驗(yàn)直接采用異丙醇提取脂質(zhì)。具體操作方法：胰酶消化細(xì)胞后，將細(xì)胞收集到5 mL的離心管中，加入300 μL異丙醇，并重懸細(xì)胞。在常溫或者冰水浴中超聲裂解細(xì)胞10 min。超聲工作效率99%，工作頻率25 kHz，在鏡下可見細(xì)胞破碎。放入4℃抽提24 h。以12 000 r/min（離心半徑5 cm）離心30 min，取上清250 μL。全自動(dòng)生化儀上機(jī)檢測(cè)樣本。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

2.5.2 油紅O染色法油紅O是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，油紅O染色能使脂質(zhì)染成橘黃至紅色。具體操作方法：100 mL異丙醇加入0.5 g油紅O固體，配制油紅O儲(chǔ)存液，避光保存，使用前儲(chǔ)存液∶ddH2O=3∶2配制，并經(jīng)微孔濾過膜過濾，使用前現(xiàn)配現(xiàn)用。移除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗去多余的培養(yǎng)基，加多聚甲醛固定液固定30 min。棄去固定液，水洗2次。60%異丙醇浸洗5 min。棄去異丙醇，加入新配制好的油紅O染液，浸染15 min，水洗2~5次。加入Mayer蘇木素染色液，復(fù)染核1 min，棄去并水洗2~5次。加入分化液1 min，鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；如不滿足正態(tài)分布，則用M（P25～P75）表示。同時(shí)滿足正態(tài)性和方差齊性的2組獨(dú)立計(jì)量資料可用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積體外模型的構(gòu)建肝細(xì)胞與300 μmol/L油酸+150 μmol/L棕櫚酸+100 μmol/L亞油酸共培養(yǎng)24 h后，經(jīng)油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)可見明顯的紅色脂質(zhì)，經(jīng)氯仿＋甲醇抽提細(xì)胞脂質(zhì)后，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)細(xì)胞TG含量，結(jié)果顯示，TG含量明顯升高（P<0.05），證明脂肪酸可成功誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積模型。見圖1。

圖1 肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積體外模型的構(gòu)建Figure 1 Construction of lipid accumulation model of live cells in vitro

3.2 芪葛湯有效成分的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選芪葛湯有效降脂成分，首先需要了解芪葛湯有效成分對(duì)肝細(xì)胞的毒性劑量。故采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察各有效成分對(duì)肝細(xì)胞增殖情況的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各濃度黃芪甲苷、葛根素、川陳皮素24、48 h均對(duì)肝細(xì)胞無明顯增殖及毒性作用。見圖2。

圖2 黃芪甲苷、葛根素、川陳皮素的MTT實(shí)驗(yàn)Figure 2 MTT assay results of astragalosideⅣ，puerarin and nobiletin

500、250、125 μmol/L 3’-羥基葛根素24 h對(duì)細(xì)胞有增殖作用，48 h則無明顯毒性及增殖作用。500、250、125 μmol/L毛蕊異黃酮24、48 h均對(duì)細(xì)胞有毒性作用。各濃度柚皮素24 h對(duì)細(xì)胞無毒性作用，500、250、125 μmol/L柚皮素48 h對(duì)細(xì)胞有毒性作用。見圖3。

圖3 3’-羥基葛根素、毛蕊異黃酮、柚皮素的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 3 MTT assay results of 3’-hydroxypuerarin，calycosin and naringenin

100 μmol/L槲皮素24 h對(duì)細(xì)胞有毒性作用。100、50、25 μmol/L槲皮素48 h均對(duì)細(xì)胞有毒性作用。見圖4。

圖4 槲皮素的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 4 MTT assay results of quercetin

3.3 TG含量的測(cè)定結(jié)果（氯仿與甲醇抽提）經(jīng)有效成分干預(yù)后，根據(jù)MTT結(jié)果，選擇各有效成分無毒性的濃度進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。以100 μmol/L黃芪甲苷、1 mmol/L葛根素、40 μmol/L川陳皮 素、500 μmol/L 3’-羥基葛根素、100 μmol/L毛蕊異黃酮、100 μmol/L柚皮素、20 μmol/L槲皮素干預(yù)細(xì)胞，并采用氯仿與甲醇抽提細(xì)胞脂質(zhì)，具體結(jié)果見表1。

表1 芪葛湯有效成分干預(yù)對(duì)模型細(xì)胞TG含量的影響（氯仿與甲醇抽提脂質(zhì)）Table 1 Effects of intervention of effective components of Qige Decoction on TG content（chloroform and methanol extracting lipid）

經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，各組數(shù)值均符合正態(tài)分布，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)的P值分別為0.318、0.152、0.561、0.430、0.526、0.669、0.740、0.109、0.059，均P>0.05。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，各組之間比較均符合方差齊性。2組之間可進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

與正常對(duì)照組比較，模型組TG含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組、葛根素組、陳皮素組、柚皮素組、槲皮素組TG含量降低（P<0.05或P<0.01），3’-羥基葛根素組、毛蕊異黃酮組TG含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3.4 TG含量的測(cè)定結(jié)果（異丙醇抽提）由于氯仿與甲醇抽提抽提步驟較多，組間方差較大，為了減少抽提的過程的誤差，采用單純異丙醇抽提細(xì)胞中的脂質(zhì)，具體結(jié)果見表2。

表2 芪葛湯有效成分干預(yù)對(duì)細(xì)胞模型TG含量的影響（異丙醇抽提）Table 2 Effects of intervention of effective components of Qige Decoction on TG content（isopropanol extracting lipid）

經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，各組數(shù)值均符合正態(tài)分布，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)的P值分別為0.846 537、0.695 079、0.141 112、0.183 242、0.557 428、0.137 352、0.322 330、0.083 276、0.062 296，均P>0.05。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，各組之間比較均符合方差齊性，2組之間可進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

與正常對(duì)照組比較，模型組TG含量顯著升高（P<0.001）；與模型組比較，黃芪甲苷組、川陳皮素組、柚皮素組、槲皮素組TG含量下降（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，葛根素組、3’-羥基葛根素組、毛蕊異黃酮組TG含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3.5 油紅O染色結(jié)果有效成分干預(yù)細(xì)胞后，經(jīng)固定后的油紅O染色，結(jié)果提示，模型組細(xì)胞大量脂質(zhì)堆積，而黃芪甲苷組、川陳皮素組、柚皮素組的脂質(zhì)堆積較模型組稍有減少，其他組則較模型組改善不明顯。見圖5。

圖5 芪葛湯有效成分干預(yù)后對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響（油紅O染色，×200）Figure 5 Effects of intervention of effective components of Qige Decoction on lipid accumulation of liver cells（by oil red O staining，×200）

4 討論

芪葛湯組方源于黃芪葛根湯（黃芪20 g、葛根10 g）。黃芪葛根湯是常用經(jīng)方，出自《證治匯補(bǔ)》，能解酒郁，能使酒濕內(nèi)從氣化而消，外從元府而泄，為虛人傷酒惡寒之專方。本課題組前期通過比較黃芪-葛根藥對(duì)的不同配比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）干預(yù)乙醇所致胃黏膜損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同配比的黃芪-葛根均能保護(hù)胃黏膜損傷，其可能的機(jī)制是通過抑制Bcl-2/Bax/Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中，以黃芪∶葛根=3∶1為保護(hù)胃黏膜的最佳配比[2]。在對(duì)黃芪有效成分的研究中，我們發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷及黃芪甲苷能改善大黃灌胃所誘導(dǎo)的胃黏膜損傷[3]，黃芪甲苷在體內(nèi)、體外均能保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷，其可能的機(jī)制是通過抑制炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）的表達(dá)，促進(jìn)IL-10的釋放，同時(shí)還能降低胃組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)[4-5]。

本課題組基于黃芪-葛根藥對(duì)能保護(hù)胃黏膜的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了芪葛湯對(duì)酒精性肝損傷的防治作用，發(fā)現(xiàn)芪葛湯預(yù)給藥能改善酒精性肝損傷大鼠的甘油磷脂、色氨酸、花生四烯酸等脂質(zhì)產(chǎn)物代謝[1]。在對(duì)陳皮的研究中，我們發(fā)現(xiàn)：用廣陳皮水提液干預(yù)高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠模型，結(jié)果顯示廣陳皮能顯著降低高脂血癥大鼠的膽固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），以及升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。對(duì)高脂血癥大鼠的血清與尿液的代謝組學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，陳皮干預(yù)能顯著回調(diào)高脂血癥大鼠1-磷酸鞘氨醇、LysoPC（18∶0）、9-癸酰肉堿、乙酰肉堿，順式-4-辛二酸、2-辛酸和醛酸等多個(gè)代謝物水平，這些代謝物涉及甘油脂代謝、脂肪酸合成等多條代謝通路[6-7]。上述前期研究結(jié)果提示，芪葛湯可能具有調(diào)脂的作用，但是，我們對(duì)芪葛湯中的哪些成分具有降脂作用仍不十分明確，因此，本研究進(jìn)一步篩選了芪葛湯的多個(gè)有效成分并進(jìn)行體外的初篩實(shí)驗(yàn)。

在芪葛湯的體外篩選實(shí)驗(yàn)中，綜合甲醇+氯仿與異丙醇的抽提方法，黃芪甲苷、川陳皮素、柚皮素能降低大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積。黃芪甲苷是黃芪的主要成分，無論是以黃芪為君藥的方劑還是單藥黃芪都已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證明具有降低血脂的療效。有研究表明，黃芪能通過調(diào)節(jié)mTORC1-過氧化物酶體增殖劑激活受體γ信號(hào)通路，降低TG水平[8]，黃芪的水提物能減少載脂蛋白E（ApoE）基因敲除大鼠動(dòng)脈硬化斑塊[9]。而黃芪甲苷則被證明能夠濃度依賴性地增強(qiáng)AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）、乙酰輔酶A羧化酶和膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）的磷酸化，抑制成熟SREBP-1的積累和核易位。黃芪甲苷治療還可以濃度依賴性地減輕游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78、C/EBP同源蛋白和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶的表達(dá)。用AMPK抑制劑化合物C（20 μmol/L）預(yù)處理的細(xì)胞則大大減少了這些有益作用，說明黃芪甲苷可能通過調(diào)控AMPK影響肝臟脂質(zhì)代謝[10-11]。川陳皮素可以有效地抑制高脂膳食大鼠的體質(zhì)量增長，降低Lee’s指數(shù)、食物利用率和脂肪系數(shù)，降低血清中TC、TG和LDL-C水平，同時(shí)，還可降低肝臟指數(shù)、血清中ALT、AST水平，改善肝臟脂肪變性情況[12-13]。柚皮素可降低高脂飼養(yǎng)大鼠的TG水平，還可降低ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[14]。

而在甲醇+氯仿抽提TG的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)葛根素也能降低TG水平。亦有其他研究結(jié)果表明，葛根最主要的成分葛根素能降低高脂血癥大鼠TC、TG、LDL-C水平及全血低、高切黏度，并增加HDL-C的水平[15-16]。葛根素通過AMPKPPARγ-肝X受體α（liver X receptors α，LXR-α）通路顯著促進(jìn)了ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ABCA1）mRNA和蛋白的表達(dá)，降低了人類THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中的細(xì)胞脂質(zhì)蓄積；而向巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-7，可降低葛根素處理的巨噬細(xì)胞AMPK的磷酸化，下調(diào)PPARγ-LXR-α-ABCA1的表達(dá)，表明了葛根素可通過涉及miR-7和AMPKPPARγ-LXR-α-ABCA1級(jí)聯(lián)的途徑，促進(jìn)ABCA1介導(dǎo)的脂質(zhì)外流，并降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平[16]。在異丙醇抽提實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素也具有降脂的療效。槲皮素已被大量實(shí)驗(yàn)證明具有降脂作用。槲皮素屬黃酮醇類化合物。在臨床試驗(yàn)中，年齡在30~60歲的2型糖尿病患者口服槲皮素（250 mg/d）8周可顯著降低血清LDL水平[17]。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素能增加肝臟低密度脂蛋白受體的表達(dá)[18]。75 μmol/L槲皮素處理HepG2細(xì)胞24 h后，SREBP2蛋白水平升高[19]。但是，由于本研究在甲醇＋氯仿、異丙醇的抽提實(shí)驗(yàn)中未同時(shí)發(fā)現(xiàn)葛根素與槲皮素的具體降脂作用，故暫不能明確葛根素與槲皮素是否具有降脂的作用。此外，本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)3’-羥基葛根素、毛蕊異黃酮具有降脂的作用，故推測(cè)3’-羥基葛根素、毛蕊異黃酮可能不是芪葛湯降脂的有效成分。

無論是黃芪甲苷還是葛根素、槲皮素均存在溶解度差、口服利用率低、代謝率高等問題，這些問題均限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。目前，對(duì)于槲皮素，研究人員已經(jīng)通過化學(xué)修飾和納米技術(shù)改進(jìn)提高了槲皮素的生物利用度。研究人員合成了槲皮素醚類衍生物、槲皮素酯類衍生物和槲皮素胺類衍生物，以提高槲皮素的水溶性。如：Kim等[20]將氨基酸與疏水側(cè)鏈如丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸結(jié)合到槲皮素上，提高槲皮素的水溶性；Sun等[21]構(gòu)建的槲皮素納米脂質(zhì)載體使槲皮素的水溶性提高了1 000倍。因此，積極地通過各種技術(shù)手段增加單體的口服利用度對(duì)進(jìn)一步研究單體在體內(nèi)的藥理機(jī)制是必要的。

本課題組在篩選出芪葛湯有效成分之后，下一步也將分別在體內(nèi)、體外研究其降脂的藥理機(jī)制。