HPLC-MS/MS快速測定飼料中25種喹諾酮類藥物

嚴 明， 嚴 寒，唐 建， 吳 濤， 覃曉明， 潘芳菲， 蘭 玉

（廣西壯族自治區飼料監測所，廣西南寧530001）

目前，喹諾酮類藥物（QNs）已經生產4代藥物，其中NAL為第一代QNs的代表，包括OXO、PRA等品種；第二代QNs以PPA、CIN為代表；第三代QNs以CIP、NOR、OFX等為典型代表；第四代QNs包括MOX、BAL、GAT等。這幾代化合物結構中的萘啶環被進行了修飾，具有抗菌譜逐漸擴大、吸收快和生物利用度高等優點（Karl Drlica等，2009；郭少忠等，2008），因此在養殖業被廣泛應用。然而QNs隨食物鏈進入人體代謝蓄積，造成毒副作用（汪皓琦等，2017；高瑋岐等，2017），并對生態環境造成破壞（Gullberg等，2011；Kümmerer等，2009）。近年來，QNs抗生素的耐藥性問題也開始被重視。為此，自2005起，美國食品和藥物管理局（FDA）禁止ENR使用（FDA，2005）；2015年農業部在規定停止經營和使用NOR、LOM、OFX、PFN 4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑（中華人民共和國農業部公告 第2292號，2017）；2019年農業農村部發布194號公告，規定自2020年7月1日起，停止所有促生長類藥物飼料添加劑的生產，QNs正式在飼料中禁用（中華人民共和國農業部公告第194號，2020）。為了監控飼料中QNs的非法使用，需要建立飼料中抗生素的檢測方法。

目前，國內外關于QNs檢測方法有酶聯免疫法（陳浩等，2020；李新朋等，2014；Scortichini等，2009）、高效液相色譜法（譚美英等，2012；Gbylik等，2012；惠蕓華等，2010；Galarini等，2009；施杏芬等，2008）、高效液相色譜質譜法等（賈濤等，2019；柯慶青等，2019；候美玲等，2018；Samanidou等，2008；Rubies等，2007）。酶聯免疫法僅使用于單類QNS的檢測，需要較好的凈化手段。液相色譜法對樣品基質要求較高，檢測限較高，無法滿足痕量檢測要求；近年應用LC-MS/MS進行QNs精確定量和確證方法研究日趨增多，然而大多數檢測方法僅檢測飼料中1～16種藥物，缺乏對4代QNs藥物的同步檢測方法。為此，本實驗旨在建立利用LC-MS/MS測定飼料中25種（表1），涵蓋4代QNS藥物的方法。

表1 25種QNs名稱及化合物信息

1 材料與方法

1.1 儀器與材料Acquity UPLC-Xevo TQS（Waters，美國）：配有電噴霧離子源（ESI）；超聲清洗器（西班牙，Fungilab）；自動渦旋混合器（QL-901Vortex，其林貝爾儀器制造有限公司，海門市）；臺式離心機（德國，Sigma）；尼龍有機濾膜（0.22 μm，安譜實驗科技股份有限公司，上海）；超純水器（MILLIPORE，美國）；N-Evap nitrogen evaporator氮吹儀（Organomation Associates，美國）；各型號移液槍（Eppendorf，德國）；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）（Waters，美國）；甲酸（色譜純級，Sigma）；乙腈和甲醇（色譜純級，Fisher ChenAlert Guide）；其他試劑為分析純；實驗 用 水：Mili-Q純 化 超 純 水 （＞18 MΩ）；Oasis HLB，MCX SPE柱（3 mL，60 mg，Waters，美國）；Estela prime HLB SPE柱（3 mL，60 mg，大連沈源檢驗檢測咨詢有限公司）。NAL等23種QNs標準溶液（濃度1000 mg/L）；BAL標準品、TRO標準品（純度≥98%，DR.E有限公司，德國），各取適量，精密稱重后，分別溶解在甲醇中，置同一容量瓶中制成BAL、TRO質量濃度為500 mg/L的標準儲備液，密封后-20℃儲存，工作有效期6個月。

吸取適量各標準儲備液制備成500 ng/mL的25種QNs混合標準儲備工作溶液，現用現配。

1.2 樣品前處理 稱取5 g飼料樣品（精確到0.01 g），在50 mL聚丙烯離心管中，加入一定量的混合內標備用工作液，旋轉混勻10 s。加入20 mL 1%甲酸乙腈溶液，渦旋混合1 min，超聲提取30 min；，離心3 min（轉速9000 r/min）。取5 mL上清液，注入Oasis PRiME HLB固相萃取柱，接收于10 mL離心管中，用氮氣吹掃至近干（40℃）。加1 mL的0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）復溶液，渦旋30 s使其重新溶解。用0.22 μm尼龍濾膜過濾，然后用UPLC-MS/MS測定，對照組樣品處理方法同上。

1.3 色譜與質譜條件

1.3.1 液相色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B-有機相，為0.1%甲酸乙腈；遵循梯度洗脫程序（表2）；樣品進樣量為10 μL；柱溫為25℃。

表2 液相梯度洗脫程序

1.3.2 質譜條件 質譜離子源為電噴霧源，正離子（ESI+）電離模式；毛細管電壓：3.5KV；離子源溫度（TEM）：150℃；多反應監測（MRM）掃描；氣體霧化溫度：380℃；輔助氣：50 psi；氣簾氣：50 psi；錐孔氣、脫溶劑氣：氮氣；采集前調試各參數，達到最佳靈敏度。25種QNs保留時間、質譜參數見表3。數據采集和處理使用MassLynx 4.1軟件完成。

表3 25種QNs保留時間和質譜參數

2 結果與討論

2.1 色譜條件選擇QNs分子結構中都含有哌嗪氮基以及羧基，此類化合物在酸性溶液中呈陽離子模式。在質譜選擇正離子模式下，容易形成[M+H]-離子。因此采用ESI+電離源，根據喹諾酮類藥物的酸堿兩性化學性質，其解離狀態根據pH的變化而呈現不同，流動相的pH對喹諾酮類藥物在色譜柱中的分離和保留有很大影響。在流動相中添加適量的甲酸溶液可有效提高ESI+的電離效率，有效改善峰形。最終選擇ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱對25種QNs進行分離，將0.1%甲酸的水溶液和0.1%甲酸的乙腈用作流動相。由于需要檢測QNs數量較多，等梯度洗脫無法有效分離這些藥物，因此，通過梯度洗脫來實現各分析物有效分離，各分析物的分析時間范圍為3.82 min（吡哌酸）～8.99 min（萘啶酸）。色譜圖如圖1所示。在10 min內可以完成25種QNs有效分離。

2.2 提取溶劑選擇 根據已有的QNs殘留監測研究，針對不同的基質，采用不同溶液來提取目標成分。主要可以歸納為有機溶劑提取和混合溶液提?。≒ena等，2010；Rodriguez等，2008）。目前從飼料中提取喹諾酮的研究僅有少數報道，根據其他基于飼料分析報告，本研究選擇不同的提取溶劑研究飼料中QNs的提取效率，其中NAL、PPA、ENR和MOX分別作為不同代開發藥物的QNs代表。比較了HCL溶液（0.1 mol/L）、，磷酸緩沖液（1 mol/L）、乙腈（色譜純）、蛋白酶溶液（10 g/L）、0.1%TFA-甲醇溶液和1%甲酸乙腈對四代QNs的提取回收率。各化合物不同提取方法的回收效率如圖2所示。結果表明1%甲酸乙腈對四代QNs的提取回收率有較好的提取效果。

圖2 不同提取液對各代QNs的提取效率

2.3 凈化條件選擇 實驗考察了MCX、HLB和PRiME HLB固相萃取小柱進行凈化富集效果的比較。結果表明，1%甲酸乙腈提取后化合物在MCX柱中部分保留，但均難以洗脫，回收率偏低。HLB柱可耐受pH范圍較廣，有較好的適用性，但HLB萃取柱需要1%甲酸乙腈濃縮成水相溶液，后續同時完成25種QNs復溶定容定量操作誤差較大，回收率不能全部達到較理想區間。Oasis PRiME HLB是一種新型開發應用的反相固相萃取吸附劑，無需活化和平衡步驟，去除蛋白、鹽、磷脂等95%以上的基質干擾物，樣品更潔凈，基質效應更小，方法更加穩定可靠且操作方便，儀器維護更輕松，使得溶液流速更順暢更快速，節省時間和溶液。因此最終選用Oasis PRiME HLB作為1%甲酸乙腈溶液的凈化富集柱。

2.4 基質效應考察 按照既定方法稱量空白飼料樣品并進行處理，然后使用空白飼料樣品提取液制備一系列濃度不同的基質匹配標準溶液測定；同時將QNs混合標準工作液使用0.1%甲酸-乙腈（9：1，V/V）溶液稀釋成一系列濃度曲線測定；檢查溶劑標準曲線和基質匹配曲線的斜率之比，以評估基質效果。結果表明，飼料提取后基質抑制效果，為準確起見，采用基質曲線作為線性驗證計算。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性及定量計算 用提取凈化后的空白樣品提取液將標準工作液逐級稀釋，配制為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL系列濃度工作液，在已設定條件下用UPLC-MS/MS分析測定，通過將基質標準工作溶液濃度作為水平坐標（x）和定量離子峰面積響應值作為垂直坐標（y）進行線性回歸來計算結果，并繪制標準曲線。表4中顯示了典型的線性回歸方程式和相關系數。

表4 25種QNs的線性、LOQ和LOD

2.5.2 檢出限與定量限 稱取10份不同類型的空白樣品，按照以上方法處理后測定，通過Mass-Lynx 4.1計算軟件信號強度（S）背景噪音強度（N）比值，QNs的檢測限濃度（LOD）為信噪比3倍（S/N＞3）時確定，QNs的定量限濃度（LOQ）為信噪比10倍（S/N＞10）時確定。25種QNs的LOQ與LOD見表4。

2.5.3 回收率與精密度 稱取空白配合飼料、濃縮飼料樣品，按照低、中、高三個濃度添加標準溶液，按照以上建立的方法提取處理后儀器測定。每個濃度進行6次重復，并不同日間3批次重復測定。相對回收率用于檢驗方法的準確性，相對標準偏差用于評價方法的精度。結果如表5所示。在10、100、200 ng/g添加水平，方法回收率為74.0%～98.6%，相對標準偏差均小于15%。

表5 飼料中25種QNs的回收率和精密度

3 結論

本文建立了應用超高效液相色譜－串聯質譜法測定飼料中25種QNs的快速確認方法。樣品中QNs用0.1%甲酸乙腈提取，經PRiME HLB固相萃取柱凈化后，上HPLC-MS/MS分析，用0.1%甲酸水與乙腈做流動相，梯度洗脫。此方法靈敏度高、操作簡單、定量準確、測定濃度范圍寬，適用于各種飼料25種QNs的檢測。