伴礦景天耐鎘內生菌的篩選

郭 峰，周毅吉，徐遠芳，李文革，彭 玲，張 勇，鄧 超，張祺玲

（湖南省核農學與航天育種研究所，湖南 長沙 410125）

隨著城市化、工業化、農業集約化的快速發展，環境污染問題日漸突出[1]。2014 年 4 月我國環境保護部和國土資源部公布的《全國土壤污染調查公報》顯示，我國土壤主要遭受以重金屬為代表的無機物污染，其中鎘是主要的重金屬污染物之一，存在于各種土地類型中，含量分布呈現從西北到東南、從東北到西南方向逐漸升高的態勢，點位超標率達到7%[2]。研究高效便捷的鎘污染修復技術刻不容緩。

目前，大部分物理化學修復方法不僅成本高昂，而且會對土壤生態系統造成一定破壞[3]。這使得重金屬鎘污染土壤生態修復技術研究成為多個科技研究領域的熱點和難點。雖然已發現一些超累積植物能吸收高濃度的重金屬鎘[4-5]，但是這些植物大多數生物量極低且生長緩慢，同時對重金屬存在偏好，從而制約了其在土壤重金屬污染中的修復效率[6]。因此，制定適宜的植物修復強化策略對修復重金屬鎘污染的土壤具有重要意義。為了提高植物修復效率，許多學者研究了植物-微生物-重金屬之間的相互作用，發現某些微生物具有減輕重金屬誘導的植物毒性和增加生物量的作用[7-9]。從此，增強植物修復體系中微生物的功能成為生物修復技術研究的一個重要方向。

植物和內生菌通過長期協同進化形成互惠互利的關系，彼此構成了穩定的生態關系，維持著自然系統生態平衡[10]。研究表明，內生菌產生的代謝物，或能刺激植物的生長發育，提高宿主植物對生物脅迫或非生物脅迫的抵抗能力，在污染土壤植物修復技術領域展現出巨大的應用潛力[11]。該研究從鎘污染區域生長的超富集植物伴礦景天植株中分離篩選獲得2 株具有耐鎘特性的細菌菌株，通過形態觀察、生理生化特性及16S rDNA 序列和系統發育樹將其鑒定為無色桿菌和伯克霍爾德氏菌，同時對菌株的耐鎘能力進行了評估，為耐鎘內生菌株的開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植株伴礦景天（Sedum plumbizincicola）采集自湖南省長沙市長沙縣高橋鎮鎘污染區域，取樣后于48 h 內用其根莖葉健康組織進行植物內生菌的富集和分離。用于細菌培養的LB 培養基配方為：胰蛋白胨10 g、酵母提取物 5g、NaCl 10 g、固體培養基另加瓊脂粉15～20 g，加水至1 000 mL，pH 值7.2，121℃滅菌30 min。耐鎘細菌篩選培養基，即在LB 培養基中加入 CdCl2溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 耐鎘內生菌株的分離 將伴礦景天植株根莖葉用清水洗凈，75%乙醇浸泡1 min，5%NaClO 浸泡1 min，無菌水沖洗4 次，經試驗驗證消毒效果后在無菌條件下研磨植株組織，置于Cd2+濃度為100 mg/L的LB 培養基中，30℃下150 r/min 振蕩培養3 d，采用稀釋涂布法分離耐鎘內生菌，再分別進行劃線純化。

1.2.2 耐鎘內生菌株的篩選 取分離純化菌株一環置于LB 培養基中，30℃下150 r/min 振蕩培養24 h，分別取0.2 mL 培養液涂布于Cd2+濃度分別為200～1 000 mg/L 的LB 固體培養基，將培養基置于30℃的恒溫培養箱中培養48 h，觀察菌株生長情況，篩選出耐受能力較高的菌株，斜面保存。

1.2.3 耐鎘菌株的生理生化特性分析 挑取耐鎘菌株的單菌落接種于LB 培養基中，30℃下150 r/min 振蕩培養24 h，參照《微生物學實驗技術》[12]進行革蘭氏染色；參照《常見細菌系統鑒定手冊》[13]及《伯杰細菌鑒定手冊》[14]進行細菌常規的生理生化鑒定試驗。

1.2.4 耐鎘菌株16S rRNA 序列分析及系統發育樹構建 采用DNA 提取試劑盒提取細菌DNA，采用細菌通 用 引 物27F（5-′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）進行16S rRNA 擴增。PCR 反應體系（50 μL）為：PCR Mix 25 μL，27F（10 μM）2 μL，1492R（10 μM）2 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR 反應條件為：98℃2 min； 98℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s，35 個循環；72℃5 min 終止。PCR 產物經凝膠電泳檢測，采用凝膠回收試劑盒切膠回收后，交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果在NCBI 數據庫進行Blast同源比對分析，利用MEGA 軟件構建16S rRNA 基因系統發育樹。

1.2.5 鎘離子對菌株生長的影響 耐鎘菌株分別接種于LB 培養基中，30℃下150 r/min 振蕩培養24 h，以2%的接種量分別接種于Cd2+濃度為0、50、100、200 和400 mg/L 的200 mL LB 培養基中振蕩培養，每24 h取樣1 次，用紫外可見分光光度計測定不同培養時間的培養液在600 nm 處的OD 值，研究Cd2+濃度對菌株生長特性的影響。

1.2.6 耐鎘菌株對不同抗生素耐性研究 采用K-B 藥敏紙片擴散法對耐鎘菌株進行藥物敏感性試驗。吸取濃度為108CFU/mL 耐鎘菌液0.1 mL 涂布于LB 固體培養基上，待培養基上菌液稍干，用無菌鑷子夾取藥敏片平放在培養基上，每個培養基均勻放置3 片藥敏片，30℃下培養48 h，測量菌抑菌圈大小，參照美國臨床和實驗室標準協會 （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的紙片擴散法標準進行判定?？股厮幟羝ǎ郝让顾?、四環素、環丙沙星、卡那霉素、諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、氨芐西林、青霉素和慶大霉素。

1.2.7 耐鎘菌株能譜分析 將耐鎘菌株分別接種于LB 培養基中，30℃下150 r/min 振蕩培養24 h，以2%的接種量分別接種于Cd2+濃度為0、100 和500 mg/L的LB 培養基中，30℃下振蕩培養24 h，細菌菌體經去離子水洗滌3 次，真空干燥后應用能譜儀對菌體元素分布進行定性定量分析。

1.2.8 耐鎘菌株紅外光譜分析 耐鎘菌株分別接種于LB 培養基中，30℃下150 r/min 振蕩培養24 h，以2%的接種量分別接種于Cd2+濃度為0、100 和500 mg/L的LB 培養基中，30℃下振蕩培養24 h，細菌菌體經去離子水洗滌 3 次后，真空干燥，取1 mg 干燥樣品與100 mg KBr（光譜純）磨細混勻，在10 t/cm2下壓成薄片，用 FTIR 光譜儀測定并記錄紅外光譜[15-17]。

2 結果與分析

2.1 耐鎘內生細菌菌株的分離篩選

經Cd2+濃度為100 mg/L 的LB 固體培養基上多次分離純化，共分離出8 種菌落形態不同的耐鎘內生菌株，8 種菌株經Cd2+濃度梯度篩選培養，最高耐受濃度見圖1。從圖1 可以看出，8 株細菌均能在Cd2+濃度為400 mg/L 的固體培養基上生長，其中菌株JGY61 和JGG81 的最高耐受濃度分別達800 和850 mg/L，因此選擇菌株JGY61和JGG81進行下一步研究。

圖1 耐鎘內生細菌菌株最高耐受濃度

2.2 耐鎘菌株生理生化特性及16S rRNA 序列分析

2.2.1 耐鎘菌株的生理生化特性 菌株JGY61 在光學顯微鏡下菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陰性；菌株JGG81 在光學顯微鏡下菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽性。2 個菌株部分生理生化特征見表1。

表1 耐鎘內生細菌菌株生理生化試驗結果

2.2.2 耐鎘菌株的16S rRNA 序列分析 2 個菌株DNA 經過PCR 擴增出來的產物大小約為1 500 bp，其中菌株JGY61 的16S rDNA 序列擴增長度為1 461 bp，菌株JGG81 的16S rDNA 序列擴增長度為1 465bp。測序序列通過Blast 同源比對分析后利用MEGA軟件構建16S rRNA 基因系統發育樹如圖2 所示，菌株JGY61 與無色桿菌屬的細菌菌株親緣關系最近，菌株JGG81 與伯克霍爾德氏菌屬的細菌菌株親緣關系最近。綜合菌株生理生化特性、16S rRNA 序列及系統發育樹可知，分離到的耐鎘內生菌株JGY61 和JGG81 分別為無色桿菌和伯克霍爾德氏菌。

圖2 耐鎘內生細菌菌株的16S rDNA 序列系統發育樹

2.3 Cd2+濃度對耐鎘內生菌株生長的影響

由圖3 可知，隨著Cd2+濃度的增加，菌株的生長期逐漸延長，但當Cd2+濃度達400 mg/L 時，菌株穩定期OD 值均未受明顯影響，說明菌株可能通過某些方式對Cd2+濃度進行適應性調整，減弱Cd2+對菌株的影響，使菌株具有較強的耐鎘能力，從而不影響菌株的生物量。

圖3 不同Cd2+濃度處理下菌株的生長曲線

2.4 耐鎘菌株對不同抗生素的耐性

由表2 可知，菌株JGY61 對四環素類抗生素四環素敏感，對糖肽類抗生素卡那霉素、β-內酰胺類抗生素氨芐西林、四環素類抗生素氯霉素和喹諾酮類抗生素環丙沙星耐性中介，對其余抗生素耐性較強；菌株JGG81 對四環素類抗生素氯霉素和四環素敏感，對糖肽類抗生素卡那霉素和喹諾酮類抗生素環丙沙星耐性中介，對其余抗生素耐性較強。

表2 耐鎘內生菌株對 10 種抗生素的敏感性結果

2.5 耐鎘內生菌株菌體能譜分析

由圖4 可以看出，菌株JGY61 和JGG81 在有Cd2+條件下菌體細胞壁均能檢測出鎘元素存在，在Cd2+濃度為100、500 mg/L 條件下培養后，菌株JGY61 菌體表面鎘元素分別占總元素的0.6%、40.2%（原子百分比），菌株JGG81 菌體表面鎘元素分別占總元素的1.5%、2.8%（原子百分比），表明菌株可能對鎘離子存在不同程度的表面吸附作用。

圖4 耐鎘菌株的菌體能譜分析圖譜

2.6 耐鎘內生菌株菌體紅外分析

從圖5 可以看出，Cd2+處理后耐鎘細菌細胞壁表面化學基團發生變化的主要有：3 300 cm-1左右來自蛋白質C—H 鍵、N—H 鍵的伸縮以及碳水化合物中結合水O—H 的伸展振動；2 927 cm-1左右飽和C—H 鍵；1 650 cm-1左右酰胺（O=CN—N）Ⅰ帶C=O 的伸縮振動；1 540 cm-1左右蛋白質酰胺II 帶N—H 的彎曲振動與C—N 伸展振動的疊加；1 395 cm-1左右—CH2、CH3、COO—等 基 團；1 240 cm-1左 右P=O 和C—S 的伸縮振動以及C—O 與O—H 的疊加吸收峰；1 080 cm-1左右—PO43-、胺基中的C—N 的伸縮振動和糖環的振動吸收帶；550 cm-1左右M—O 和O—M—O （M—金屬離子） 振動吸收峰。低濃度Cd2+處理下菌體細胞壁表面化學集團主要發生輕微位移，高濃度Cd2+處理下1 080 cm-1左右—PO43-、胺基中的C—N的伸縮振動和糖環的振動吸收帶以及550 cm-1左右—M—O 和O—M—O（ M—金屬離子）振動吸收峰變得強而寬，1 540 cm-1左右蛋白質酰胺Ⅱ帶N—H 的彎曲振動與C—N 伸展振動的疊加吸收峰變弱，說明參與積累重金屬的化學官能團主要有—PO43-、—M—O（O—M—O）、胺基中的C—N 和酰胺基（—CO—NH—）基團。

圖5 耐鎘菌株的菌體紅外光譜圖

3 結論與討論

研究以鎘污染區域生長的伴礦景天為材料，從中分離到8 種菌落形態不同的耐鎘內生菌株，經Cd2+濃度梯度篩選得到2 株耐鎘能力較強的菌株，最高耐受濃度分別達800 和850 mg/L，經形態觀察、生理生化特性研究以及16S rDNA 序列和系統發育樹分析，將2 株菌株分別鑒定為無色桿菌和伯克霍爾德氏菌。耐鎘菌株在不同鎘濃度培養基中的生長曲線測定結果表明，菌株隨著Cd2+濃度的增加生長期逐漸延長，說明在Cd2+影響下菌株生長存在適應性調整過程；但經適應性調整后在培養基中Cd2+濃度達400 mg/L 時2 株菌株的生物量均未受明顯影響，該調整機理有待進一步研究。綜上所述，篩選獲得的2 株伴礦景天內生細菌有較好的耐鎘能力，為鎘污染土壤植物-微生物聯合修復提供了寶貴的微生物資源。

對2 株耐鎘內生菌進行了抗生素耐性測定，結果顯示，菌株JGY61（無色桿菌）對四環素敏感，對卡那霉素、氨芐西林、氯霉素和環丙沙星耐性中介，對青霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、諾氟沙星耐性較強；菌株JGG81（伯克霍爾德氏菌）對氯霉素和四環素敏感，對卡那霉素和環丙沙星耐性中介，對青霉素、氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、諾氟沙星耐性較強。

相關研究表明，微生物與重金屬鎘的相互作用方式主要有4 種：表面吸附、胞外絡合、胞外沉淀和微生物積累[18]。對該研究分離獲得的耐鎘內生菌株進行能譜分析，發現菌株在Cd2+存在條件下菌體細胞壁均能檢測出鎘元素存在，表明菌株可能對鎘離子存在不同程度的表面吸附作用。紅外分析結果表明，—PO43、—M—O（O—M—O）、胺基中的C—N 和酰胺基（—CO—NH—）基團是參與菌株表面吸附的主要官能團。由此初步證實，菌體細胞壁及其官能團在吸附鎘中的作用，其耐性與解毒機理有待進一步加以揭示。