茶多酚-姜黃素復配液對凍藏貽貝肉品質的影響

朱士臣,曾曦,龍官譽,呂飛,周緒霞,4,金友定,鄧尚貴,周小敏,劉書來,4*,丁玉庭,4

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)2(浙江省深藍漁業資源高效開發利用重點實驗室,浙江 杭州,310014)3(國家遠洋水產品加工技術研發分中心(杭州),浙江 杭州,310014)4(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心(大連工業大學),遼寧 大連,116034)5(嵊泗縣景晟貽貝產業發展有限公司,浙江 嵊泗,316000)6(浙江海洋大學 食品與藥學學院,浙江 舟山,316000)7(浙江興業集團有限公司,浙江 舟山,316000)

貽貝(Mytilusedulis),是我國近海區域貝類養殖的重要品種之一。根據2020年中國漁業統計年鑒,2019年國內貽貝產量為90.34萬t,占總貝類養殖的6.26%[1]。貽貝肉蛋白質含量高,干物質比例占60%以上,營養全面,富含多種生理活性物質。傳統的熱加工會造成貽貝肉的過度熟化,嚴重影響營養品質與風味,而適度熱處理的貽貝雖能保留其鮮嫩口感及風味,但由于仍含有較高水分含量,需在低溫下凍藏以保持其品質與安全性[2],此外,熱處理后的貽貝肉凍藏期間會發生脂質氧化、水分損失、感官品質下降及組織結構變差等不良變化。因此,如何進一步提高預熱處理貽貝肉的凍藏品質是亟需解決的問題。

為提高水產品的凍藏品質,研究人員分別從抑制冰晶生長和穩定食品組分方面做了大量研究。通過添加外源性物質以增強食品組分穩定性是主要的研究方向之一。例如,JU等[3]發現茶多酚對0和4 ℃貯藏18和12 d的沙蠶具有較好的保鮮效果,如抑制揮發物腐敗、降低揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid,TBA)、過氧化值和菌落總數,質地和感官可接受性也更高。XI等[4]將牡蠣肉浸泡在綠茶提取物溶液中,減少了副溶血性弧菌的數量,延長了其低溫常壓下的保質期。林以琳等[5]研究縊蟶保鮮技術,優化出最佳濃度的姜黃素溶液,結合光動力技術,達到減菌目的。WANG等[6]研究發現,姜黃素微膠囊對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌等具有很好的抗菌活性,抑制效果革蘭氏陽性菌高于革蘭氏陰性菌,真菌優于細菌。目前姜黃素在貝類中的應用研究表明,2.75 g/L為最有效的抑菌濃度[7]。茶多酚具有抗氧化作用,但抑菌作用范圍較小且抑菌效果有限[8],如果能將茶多酚與姜黃素結合使用,將能彌補這一缺陷。

為進一步改善貽貝肉的凍藏品質,本文以熱處理的貽貝肉為研究對象,采用不同比例的茶多酚-姜黃素復配液進行浸泡處理,研究-18 ℃凍藏期間貽貝肉的理化特性、感官品質、菌群組成以及微觀結構的變化,探究其中的調控規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活厚殼貽貝,杭州朝暉農貿市場,質量(50±5)g；白葡萄酒,中糧長城酒業有限公司；茶多酚(食品級),河南萬邦實業有限公司；姜黃素(食品級),揚州中信食化商貿有限公司；茶多酚標準品,南京道斯夫生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-6100S分光光度計,上海美譜達儀器有限公司；Waters 2695型高效液相色譜儀,美國Waters公司；Aqualab 4TE水分活度儀,美國METER公司；K9840全自動凱氏定氮儀,濟南海能儀器有限公司；TA.XT Plus物性測試儀,英國Stable Micro Systems公司；S-3400 N掃描電子顯微鏡,東京Hitachi高科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

以3.5%乙醇含量的白葡萄酒為姜黃素的助溶劑,分別配制不同質量濃度的茶多酚(30、15、7.5 mg/mL)與姜黃素(2.75 mg/mL)復配液。鮮活貽貝經100 ℃熱水處理1 min,開殼至蛋白質變性程度為50%,去足絲,隨機分為4組,于茶多酚復配液中浸泡60 min(TC1、TC2、TC3),3.5%白葡萄酒溶液處理為對照組(CK),蒸餾水處理為空白組(C0),瀝干裝入自封袋中,于-18 ℃的冰箱中貯藏。貯藏過程中每周分別取樣進行指標測定。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取及測定

參考LI等[9]的方法并稍做修改。取5 g貝肉,加入75 mL的0.05 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-馬來酸溶液(pH 7.0),勻漿,10 000 r/min離心20 min,循環2次取沉淀；再加入75 mL的0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-馬來酸溶液(pH 7.0),勻漿,4 ℃抽提1.5 h。然后4 ℃、10 000 r/min離心20 min,取上清液,通過雙縮脲法測定肌原纖維蛋白含量。

1.3.3 持水力和水分活度測定

持水力測定參照QIAN等[10]的方法并做了修改。取5.00 g貽貝肉,70 ℃水浴處理20 min,5 000 r/min離心3 min,濾干稱質量,按公式(1)計算持水力：

持水力/%=

(1)

水分活度測定：取約 2.00 g貽貝肉切碎后,均勻平鋪于樣品盒中,放入水分活度測定儀感應器中[11]。

1.3.4 貽貝肉中茶多酚含量測定

稱取5.00 g試樣于250 mL具塞錐形瓶內,加入50 mL正己烷振蕩提取,用濾紙過濾至250 mL圓底燒瓶內,重復3次,合并濾液,于40 ℃水浴中旋轉蒸發至近干。加入少許甲醇,振搖溶解提取液,移入10 mL離心管中,用少量甲醇沖洗圓底燒瓶3次,洗滌液并入離心管中,定容至10 mL,混勻、渦旋、冷凍離心。上清液過0.45 μm微孔濾膜過濾,濾液進高效液相色譜測定[12]。

1.3.5 菌落總數測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》并做修改。分別在(30±1)℃、(20±1)℃下培養72 h,測得貝肉的菌落總數和嗜冷菌數[13],以 lg CFU/g 計數。

1.3.6 TBA測定

準確稱取10.00 g貝肉，參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》方法。

1.3.7 TVB-N檢測

準確稱取10.00 g貝肉,根據GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》方法。

1.3.8 質構測定

參考沈軍樑[14]的方法并略有改動。以貝肉中心為測試點,探頭為P36R,觸發力5 g,應變50%,測試前速率 2 mm/s；測試速率 1 mm/s；測試后速率2 mm/s。

1.3.9 微觀結構的測定

參考SYAMALADEVI等[15]的方法,將貽貝肉切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小,用2.5%戊二醛溶液固定,隨后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗3次,每次15 min,再分別用濃度梯度為50%、70%、80%、90%和100%的無水乙醇進行脫水處理,每次15 min,最后進行冷凍干燥。凍干樣品用不銹鋼刀片切成2～3 mm薄片,噴金,在掃描電鏡下進行觀察(×25 000)。

1.3.10 感官評價

建立貽貝肉產品的QIM(quality index method)評分表[16],如表1所示。由15名經過一定感官評定培訓的人員進行感官評價。

表1 貽貝肉的感官評價標準

1.3.11 數據分析與處理

每組處理至少重復3次,采用SPSS 26.0進行平均值和標準差的統計分析,采用Duncan多范圍檢驗進行單向方差分析(P<0.05),采用Origin 2018做圖。

2 結果與分析

2.1 持水力和水分活度的變化

圖2為凍藏期間貽貝肉持水力與水分活度的變化情況。由圖1-a可知,在凍藏前期(0～6周),各處理組貽貝肉的持水力均呈顯著下降趨勢(P<0.05),之后逐漸趨于穩定。茶多酚復配液處理組的持水力顯著優于C0組和CK組(P<0.05),其中TC1>TC2>TC3,凍藏末期表現得更明顯,而C0組和CK組間無明顯差異。不同樣品組間的水分活度也表現了相似結果(圖1-b),即茶多酚濃度越高,水分活度也較高?？赡苁怯捎谠趦霾仄陂g,貽貝的肌肉組織在冰晶機械作用下受到不同程度的破壞,造成貝肉持水力下降。細菌的生長繁殖也破壞了肌肉的組織結構[17]。

a-持水力;b-水分活度

經茶多酚-姜黃素復配液處理后,茶多酚通過氫鍵和疏水鍵方式與肌原纖維蛋白結合,增大了貝肉表面的收斂性,減少了水分喪失[18],且多酚可抑制微生物繁殖,一定程度保持了貽貝肌肉組織結構,減少了汁液流失。

2.2 TVB-N變化

TVB-N是衡量海產品新鮮度和質量的最廣泛使用的評價指標之一,該值與腐敗菌的活性有關。腐敗菌的生長加快蛋白質、氨基酸類物質分解成揮發性含氮物質,該值越低,說明貽貝肉鮮度品質越高。本文主要參考國家標準中規定預制動物性水產制品中TVB-N的限量不得超過不得超過30 mg/100 g(GB 10136—2015《食品安全國家標準 物性水產制品》)。凍藏過程中貽貝肉的TVB-N隨凍藏時間的變化情況見圖2-a,-18 ℃凍藏下,C0和CK組貽貝肉在第10周已超過30 mg/100 g的限量標準值,而復配液處理的貽貝肉貯藏期都有所延長,茶多酚濃度越大,TVB-N值上升越慢,說明茶多酚和姜黃素對延長貯藏期具有顯著的效果。茶多酚具有很強的還原性,能將作用于肌肉上的氧自由基還原成相對穩定的化合物,使蛋白質結構不易被降解[19]；同時姜黃素可作用于細菌的膜系統和生物酶系統,達到干擾其能量代謝和選擇透過性,也賦予了較強的抗菌效果[20]。

2.3 TBA變化

貽貝肉中脂肪占干重的8%～9%,僅次于碳水化合物,脂質中多為不飽和脂肪酸,易發生氧化。凍藏過程中貽貝肉TBA的變化情況見圖2-b,在-18 ℃凍藏12周貽貝肉的TBA值分別是(4.59±0.05)、(4.50±0.10)、(2.83±0.08)、(3.30±0.19)、(3.80±0.10) mg MDA/kg。復配液處理組的TBA值顯著低于C0、CK組(P<0.05),其中TC1復配液作用效果顯著優于其他4組(P<0.05)。研究表明,迷迭香和D-抗壞血酸鈉能明顯延緩青魚干腐敗變質,在貯藏后期的作用效果更明顯[21]。ZHOU等[22]發現紫貽貝肉4 ℃冷藏第4天時,TBA值由0.89 mg MDA/kg上升至4.06 mg MDA/kg,在貯藏后期上升幅度越大。目前雖然國際上沒有明確規定TBA對應的品質上限值,但有研究表明,當TBA>2 mg MDA/kg時,會產生令人不快的氣味或味道[23],這與TVB-N結果是相對應的。

2.4 菌落總數與嗜冷菌的變化

凍藏貽貝肉的品質變化主要由嗜冷菌的繁殖引起,嗜冷菌含量是反映其食用安全的一項重要指標[24]。綜合嗜冷菌和菌落總數可全面反映不同處理條件下凍藏過程中貽貝肉微生物的生長繁殖情況。在-18 ℃凍藏條件下貽貝肉微生物變化見圖3。由于前期預處理殺滅了大部分細菌,因此貯藏初期(0 d)所有樣品組的菌落總數和嗜冷菌均保持較低水平(0.5 lg CFU/g)。根據國際食品微生物規范委員會(International Commission on Microbiological Specifications for Foods,ICMSF)的規定,菌落總數和嗜冷菌的上限為6 lg CFU/g,在此限值以下,甲殼類水產品都能保持較好的鮮度[25]。按此標準,菌落總數(圖3-a)分別在第10周、第10周、第12周、第12 周和第10周超過標準限量值,而嗜冷菌(圖3-b)分別在第10周、第10周、第12周、第10周和第10周超過標準限量值。凍藏過程中TC1、TC3和TC3組的菌落總數和嗜冷菌數明顯要低于C0和CK組,TC1組的2種菌數量最少。茶多酚和姜黃素為酚類、萜類物質,已被證實能在菌體細胞膜上聚集,改變細胞膜的通透性,從而抑制微生物的生長[26]。

a-菌落總數;b-嗜冷菌

2.5 肌原纖維蛋白變化

貽貝肉中蛋白變性越嚴重,其鹽溶性蛋白也就越低,本文以其肌原纖維蛋白的含量變化作為衡量標準,觀察復配液的保鮮效果。研究發現,凍藏下的貽貝肉肌原纖維蛋白含量從最初的260 mg/g干物質降至凍藏期結束時的130 mg/g干物質(圖4)。

圖4 貽貝肉肌原纖維蛋白含量隨凍藏時間的變化情況

凍藏2周時,各組間無明顯差異,從第2周開始至凍藏期結束,添加了茶多酚-姜黃素復配液的3組處理組,肌原纖維蛋白的含量明顯高于同期的C0、CK組(P<0.05),TC1組效果最好,凍藏第12周時,肌原纖維蛋白含量還能保持在148 mg/g干物質。-18 ℃凍藏過程中,貽貝肉蛋白質中結合水在細胞外產生大冰晶,細胞內肌原纖維被擠壓成束狀,導致蛋白質結合形成各種不溶性交聯而變性；另外,蛋白質氧化變性導致肌球蛋白間的交聯作用減弱,凝膠特性下降[27]。茶多酚和姜黃素作為抗氧化劑,能有效抑制蛋白質氧化的發生,減緩凝膠彈性和持水能力的下降[28]。

2.6 質構變化

凍藏過程中冰晶生成會造成肌肉組織結構的破壞,從而導致貽貝肉硬度、彈性和咀嚼性的下降,肌肉組織口感變差[29]。由表2可知,隨凍藏期延長,貽貝肉的硬度、彈性和咀嚼性均呈下降趨勢(P<0.05),但凍藏8周后都趨于穩定；貽貝肉經茶多酚-姜黃素處理后咀嚼性和彈性顯著高于C0、CK組(P<0.05),而C0組和CK組間無明顯差異；與TC2、TC3相比,凍藏期間TC1處理組的貽貝肉質構更穩定,凍藏結束時,其硬度、彈性和咀嚼性表現也較好。貽貝肉的質構與水分、蛋白質和脂肪密切相關,凍藏期間水分的流失、冰晶的形成、蛋白質和脂肪的氧化均是引起質構變化的關鍵因素[30]。研究表明,天然植物中的抗氧化成分能有效抑制肌肉中蛋白質和脂肪的氧化,從而改善肉制品的質構[31]。茶多酚和姜黃素具有較強的抗氧化性和抑菌性,能夠抑制貽貝肉中脂肪和蛋白質的氧化腐敗,從而一定程度上減緩凍藏期間質構的降低,這與本論文結果相類似。

表2 不同復配液處理的貽貝肉質構的變化

2.7 感官評價分析

凍藏期間貽貝肉感官變化情況如圖5所示,C0和CK組4指標的評分值始終低于處理組,C0凍藏第12周時氣味和質地甚至已經低于60分,且貽貝肉開始腐敗,表面黏液增加,產生異味,發生色變,肉質結構軟爛；而處理組貽貝肉的外觀、色澤和氣味都有所改善,尤其是氣味方面。這是因為茶多酚和姜黃素的抗氧化和抗菌性能有效抑制微生物的生長,降低TVB-N的含量,延緩脂肪的氧化程度,從而減少胺類等小分子物質的產生[32]。另外,作為溶劑的白葡萄酒本身帶有香味,能在一定程度上能掩蓋、中和一部分不愉快的氣味,從而使得復配液處理組具有較高的感官得分。

a-外觀；b-色澤；c-氣味；d-質地

2.8 微觀結構分析

掃描電鏡結果表明,經過TC1組茶多酚復配液處理后凍藏貽貝肉的套膜、外展肌和生殖腺組織結構并非一致(圖6)。凍藏第0周的貽貝肉套膜、外展肌和生殖腺(A1～A3、C1～C3)肌肉組織分布較均勻,條狀或顆粒狀纖維結構仍存在；而凍藏12周后貽貝肉則出現顯著變化,3個部位都顯現出結締組織和肌纖維的嚴重變形,彼此間發生黏連、輪廓不清晰,尤其是生殖腺呈現扭曲狀態,顯微結構消失(B1～B3、D1～D3)。但與空白組相比,實驗組的貝肉形變程度相對較小。ANGANE等[33]在研究冷凍對貽貝肉不同部位顯微結構的影響時發現,新鮮熱脫殼貽貝的性腺、套膜和足部組織結構完整,肌纖維分布均勻,而凍存90 d的樣品中,性腺出現扭曲,具有大量的細胞內和細胞外空間,套膜由于冰晶的形成而顯示出巨大的孔隙。

1-套膜；2-外展肌；3-生殖腺；A-空白組0周；B-空白組12周；C-實驗組0周；D-實驗組12周

2.9 茶多酚含量分析

圖7為凍藏期間貽貝肉中茶多酚含量的變化情況,第0周時貝肉中茶多酚含量為266.79 mg/kg,符合國家規定的限量標準(≤0.3 g/kg，GB 2760—2014 《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》),凍藏至第8周,貝肉中茶多酚降至145.03 mg/kg,前4周茶多酚含量的變化具有顯著性差異(P<0.05),從第8周至凍藏期結束,茶多酚含量保持穩定。

圖7 貽貝中的茶多酚含量隨凍藏時間的變化趨勢

這可能由于茶多酚通過清除自由基和活性氧、抑制氧化酶及促進抗氧化酶活性的途徑來實現抗氧化的目的,這一過程將茶多酚中的有效成分轉化成了其他物質,造成茶多酚的損失[34]。另外,貽貝肉汁液的損失也將溶出一部分茶多酚物質,故而凍藏后期貝肉的氧化程度加深,TBA值顯著提高,但此時茶多酚清除自由基的作用暫時達到平衡,不需要再消耗茶多酚進行清除工作,故茶多酚含量暫時保持平穩。

3 結論

結果表明,茶多酚-姜黃復配液能有效抑制貽貝肉的脂質氧化、延緩菌落總數的增加和嗜冷菌的生長,同時茶多酚-姜黃處理組在持水力、水分活度、TVB-N、質構和感官表現上也明顯優于空白組和對照組,其中30 mg/mL茶多酚+2.75 mg/mL姜黃素復配液處理組效果最好,其處理貽貝肉的肌肉纖維狀態較空白組和對照組有序,且茶多酚含量逐漸趨向穩定。研究證明,茶多酚和姜黃能一定程度提高貽貝肉凍藏期間的抗氧化性和抑菌性,30 mg/mL茶多酚+2.75 mg/mL姜黃素復配液可使貝肉在微生物限值的時間延長1～2周。因此,茶多酚-姜黃復配液可改善貽貝肉的凍藏品質,延長凍藏期。