微生物復合發酵沙蟹汁的制備工藝優化及其風味研究

邊昊，陳柏宇，李銳

1(安徽工商職業學院,安徽 合肥，230041) 2(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江，524088)3(嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江，524048)

沙蟹汁是廣西北海特有的傳統美食，具有風味獨特、口味鮮美等特點，常用來制作“沙蟹汁燜豆角”、“沙蟹汁蘸白切雞”等當地特色名菜，深受人們的喜愛[1-2]。傳統沙蟹汁是以海灘野生沙蟹為原料，清洗后去除內臟和污物，搗碎后混以一定比例的食鹽放入發酵罐中，經過1個月左右的自然發酵后制得[3]。目前沙蟹汁的生產以傳統方法為主，其產品存在腥異味重的問題，嚴重阻礙了產品的推廣。

微生物發酵法是食品工業中常用風味改良方法之一，可以通過微生物作用將小分子腥味物質轉變為無腥味的物質，同時還能產生特殊的發酵香味，從而達到“除臭增香”的目的[4]。目前食品行業多采用多種菌種復合發酵的方式，不僅可以彌補單一菌種發酵的缺陷，而且能縮短發酵時間[5-6]。解萬翠等[7]在蝦頭醬中添加3種菌株(植物乳桿菌、黑曲霉和季氏畢赤氏酵母)進行混合發酵，大大提高了發酵效率，并增加了蝦醬的風味。張晶等[8]采用復合菌和安琪酵母發酵野生獼猴桃果酒，顯著提高了產品的香氣品質，且口感更加醇厚。TURCHI等[9]使用2種混合菌株(植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌)對驢奶進行發酵，發現混合菌種的發酵產品整體品質要優于單一菌株。BERTUZZI等[10]采用協同發酵法(漢遜德巴利酵母、腐生葡萄球菌和干酪棒狀桿菌)制備奶酪，發現奶酪色澤和品質發生明顯改變。目前，采用復合發酵法制備沙蟹汁的研究尚未見報道。

植物乳桿菌是一種廣泛存在于發酵食品中的微生物，對肉類風味形成有積極的促進作用[11]。魯氏酵母菌是發酵食品行業中常用的增香型菌株，在發酵過程中會產生大量糖類物質，并伴隨產生呋喃酮、芳香醇、高級醇等化合物，能顯著提升產品的香氣[12]。本文以沙蟹為原料，在傳統工藝的基礎上添加魯氏酵母菌和植物乳桿菌進行發酵，以感官評分和氨基態氮含量為指標，采用單因素試驗結合響應面分析法優化復合發酵沙蟹汁的制備工藝，并比較復合發酵沙蟹汁與傳統沙蟹汁的風味成分，以期為沙蟹汁的風味改良提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙蟹，北海市回頭客食品有限公司；生姜、食鹽均為市售；IMP、GMP、ATP、ADP、AMP、HxR、Hx標準品(純度≥99.0%)，美國Sigma公司；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，菌種編號GIMI.191)和魯氏酵母菌(Saccharomycesrouxii，菌種編號AS2.180)，中國科學院菌種保藏中心；YPD液體培養基、MRS液體培養基，青島海博生物技術有限公司；ADP、HxR、Hx、GMP、AMP、ATP、IMP標準品，上海源葉生物科技有限公司；有機酸和氨基酸標準品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

MJ-160型恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；L-P1200型粉碎機，鄭州力威設備有限公司；L8900型氨基酸分析儀、LC-10AT型高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；LDZX-50KB型高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；FE28-Stan型酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司；MR-23i型冷凍離心機，法國Jouan 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙蟹汁的制備

傳統沙蟹汁：取處理好的沙蟹1 kg、生姜末200 g和食鹽300 g，攪拌均勻后加入500 g涼白開，然后使用均質機以8 000 r/min的條件均質3 min。均質好的混合溶液(pH 7.5～8.0)裝入干凈的發酵罐，晾曬發酵15 d(日曬夜露，25 ℃左右)，所得產品即為傳統沙蟹汁。發酵結束后將沙蟹汁混合均勻，并于4500 r/min條件下離心15 min，取上清液保存于-20 ℃備用。

復合發酵沙蟹汁：按上述相同方法均質,均質好的混合溶液調節pH值，加入一定量的復合發酵劑，混合均勻后置于恒溫培養箱靜置發酵，所得產品為復合發酵沙蟹汁。發酵結束后將沙蟹汁混合均勻，于4 500 r/min條件下離心15 min，取上清液保存于-20 ℃備用。

1.2.2 菌懸液的制備

參考李銳等[12]的方法，稍作改動。將植物乳桿菌和魯氏酵母菌分別接種到MRS液體培養基和YPD液體培養基中。植物乳桿菌于37 ℃恒溫培養箱振蕩培養22 h，連續傳代2～3次至活力恢復。魯氏酵母菌于30 ℃恒溫培養箱振蕩培養40 h，連續傳代2～3次至活力恢復。培養結束后，菌懸液離心(4 ℃，4 000 r/min，時間15 min)，收集菌體沉淀并溶于滅菌生理鹽水(0.85 %)，最終調整菌懸液菌落個數為108CFU/g。

1.2.3 復合發酵法改良沙蟹汁的單因素試驗

微生物復合發酵法改良沙蟹汁的固定條件為：植物乳桿菌和魯氏酵母菌混合比例3∶2，發酵時間17 d，發酵溫度26 ℃，復合發酵劑接種量5%(以混合溶液總質量為計)，發酵初始pH 7.5。固定其他條件不變，改變其中某個因素條件分別分析對復合發酵沙蟹汁感官評價及氨基態氮含量的影響。設置各因素的梯度分別為：植物乳桿菌和魯氏酵母菌混合比例 0∶3、1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1、3∶0，發酵時間13、15、17、19、21、23、25 d，發酵溫度20、22、24、26、28、30、32 ℃，復合發酵劑接種量1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，發酵初始pH值6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。發酵結束后滅菌，冷卻后樣品備用。

1.2.4 響應面分析法優化復合發酵法改良沙蟹汁的最佳工藝

根據單因素實驗確定發酵溫度、發酵時間和發酵劑接種量3個因素為自變量，以感官評分為響應值，采用響應面分析法優化復合發酵法改良沙蟹汁的最佳工藝條件。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面因素與水平設計

1.2.5 感官評價

參考邊昊等[13]的方法，通過感官描述法對沙蟹汁的感官屬性進行分析。挑選10名感官評價員(6名女性和4名男性，年齡19～30歲)，所有的評價人員均在食品感官分析領域有著豐富的經驗，并熟悉各種感官描述詞匯。感官評價前，將樣品置于50 ℃水浴鍋中恒溫加熱10 min,并分別裝入5個同樣的容器，評價時隨機取樣。根據感官評定標準(表2)，評價人員對沙蟹汁的色澤、香氣、滋味和形態進行打分，最后取10位評價人員的平均值作為最終評分。

表2 感官評定標準表

1.2.6 其他理化指標的測定

氨基態氮含量的測定參考王雪鋒等[14]的方法；揮發性鹽基氮(total volatile basic nitragen,TVB-N)的測定參考吳燕燕等[15]的方法。

游離氨基酸含量的測定參考宓月光等[16]的方法，稍有改動。取沙蟹汁1.0 g，加入3 mL 質量濃度為50 g/L磺基水楊酸溶液，混合均勻后靜置1 h，于9 000 r/min條件下離心15 min，取上清液并使用水系微孔濾膜過濾(0.22 μm)，然后用L8900型氨基酸分析儀進行測定。

有機酸含量測定依據段珍珍等[17]的方法，稍有改動。取沙蟹汁5.0 g，加25 mL超純水混合均勻，然后使用均質機以10 000 r/min的條件均質10 min，于7 000 r/min條件下離心10 min，取上清液用超純水準確定容至50 mL。樣品液使用水系微孔濾膜過濾(0.22 μm)，用高效液相色譜儀進行分析。

呈味核苷酸含量的測定參考YANG等[18]的方法，稍有改動。取沙蟹汁5.0 g，加入30 mL質量濃度為0.05 g/mL的高氯酸溶液，使用均質機以10 000 r/min的條件均質10 min，于7 000 r/min條件下離心10 min。取沉淀加入10 mL質量濃度為0.05 g/mL的高氯酸溶液再次提取，重復操作2次，合并兩次離心后的上清液，使用濃度為5 mol/L的KOH溶液調節pH為6.75，用超純水準確定容至50 mL。樣品液用水系微孔濾膜過濾(0.22 μm)，使用高效液相色譜儀進行分析。

1.3 數據處理

每個數據設置3個重復，結果用平均值±標準偏差表示，使用Design-Expert 8.0.6、IBM SPSS 22.0和Origin 8.0軟件進行作圖和數據分析。

2 結果與討論

2.1 復合發酵改良沙蟹汁的單因素試驗

以感官評分和氨基態氮含量為指標，植物乳桿菌和魯氏酵母菌混合比例、發酵時間、接種量、發酵溫度和發酵初始pH值5個單因素試驗結果如圖1所示。

a-菌種混合比例;b-發酵時間;c-發酵劑接種量;d-發酵溫度;e-發酵初始pH

由圖1-a可知，不同混合比例對沙蟹汁的感官評分和氨基態氮含量有較大影響。在所有混合比例中，菌種混合比例3∶2時沙蟹汁的感官評分最高，為6.94；菌種混合比例1∶3時沙蟹汁的氨基態氮含量最高，為(5.31±0.07) mg/mL，其次為菌種混合比例3∶2，氨基態氮含量為(5.25±0.13) mg/mL，兩者之間沒有顯著性差異(p<0.05)。綜合考慮，選擇植物乳桿菌和魯氏酵母菌混合比例為3∶2。由圖1-b可知，隨著發酵時間的延長，沙蟹汁的感官評分逐漸增加，于發酵17 d時感官評分達到最大值7.85，此時氨基態氮含量為(5.33±0.07) mg/mL，說明此時沙蟹汁發酵風味已趨于成熟。發酵17 d后沙蟹汁的感官評分和氨基態氮含量緩慢下降，這可能是由于在發酵后期，菌種產生有機酸、乙醇等次級代謝產物，使得沙蟹汁風味劣化[13]。因此，選擇發酵17 d較為合適。由圖1-c可知，隨著接種量的增加，沙蟹汁的感官評分呈先上升后下降的趨勢，并于接種量為5%時感官評分達到最大值7.44，此時氨基態氮含量為(5.33±0.07) mg/mL。繼續增加接種量，沙蟹汁的感官評分開始下降。有研究表明，發酵液中酵母菌過多會產生酵母味、酸味和酒精味，導致香氣品質下降[19]。因此，選擇接種量5%較為合適。發酵溫度是影響發酵產品質量的重要因素之一。由圖1-d可知，發酵溫度低于26 ℃時，沙蟹汁感官評分較低，此階段菌株代謝活動緩慢，風味變化不明顯；當高于26 ℃時，發酵液中微生物的代謝活動被抑制，導致風味物質濃度降低，氨基態氮含量也有所下降，因此選擇發酵溫度26 ℃較為合適，此時氨基態氮含量為(5.98±0.05) mg/mL。由圖1-e可知，隨著發酵初始pH值的增加，沙蟹汁的感官評分和氨基態氮含量呈先上升后下降的趨勢，在pH值為7.5時，感官評分最高，為7.03，此時氨基態氮含量為(5.41±0.04) mg/mL。微生物在最適pH值時代謝速率最高，高于或低于這個值，均會降低菌株的代謝速率。因此，選擇最佳發酵初始pH值為7.5。

2.2 響應面優化復合發酵法改良沙蟹汁的制備工藝

2.2.1 響應面分析試驗設計

由單因素試驗結果可知，發酵溫度、發酵時間和發酵劑接種量3個因素對沙蟹汁感官評價的影響較大。在此基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以感官評分為響應值，發酵時間(A)、發酵溫度(B)和發酵劑接種量(C)為自變量，采用響應面優化沙蟹汁發酵最佳工藝條件。響應面因素與水平見表2。

2.2.2 響應面結果及方差分析

響應面試驗設計方案及結果見表3。利用Design Expert 8.0.5軟件對試驗結果進行回歸擬合，并對數據進行方差分析，去除不顯著項得到回歸方程為：y=7.28+0.24A+0.24B-0.2AC- 0.83A2-0.77B2-0.27C2。

為了檢驗方程的有效性，對模型方程進行方差分析，結果如表4。

表4 回歸模型方差分析

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)

2.2.3 復合發酵法改良沙蟹汁最優工藝與驗證試驗

利用Design Expert 8.0.5軟件得到最佳發酵條件為：發酵時間17.3 d，發酵溫度26.33 ℃，發酵劑接種量5.13 %，得到沙蟹汁感官評分理論最大值為7.32。為了檢驗結果與實際情況是否一致，對這個結果進行驗證，考慮到實際操作條件，確定最佳工藝參數為：發酵時間17 d，發酵溫度26 ℃，發酵劑接種量5%，發酵初始pH值7.5，植物乳桿菌和魯氏酵母菌混合比例3∶2。經過3次平行試驗，得到感官評分為7.38±0.39，與理論預測值的相對誤差為2.77%，這說明該模型能較好預測微生物復合發酵法改良沙蟹汁的生產工藝。

2.3 傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁風味比較

2.3.1 游離氨基酸含量

游離氨基酸是沙蟹汁鮮美滋味的主要來源，也是判斷產品質量的重要標準之一。傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁中游離氨基酸含量如表5所示。傳統沙蟹汁中游離氨基酸總量為2 244.12 mg/100 g，鮮甜味氨基酸含量為640.26 mg/100 g，占總量的19.08%。復合發酵沙蟹汁中游離氨基酸總量和鮮甜味氨基酸含量分別為2 605.77和783.68 mg/100 g，相比傳統沙蟹汁，分別增加了16.12%和22.40%；在所有氨基酸中，精氨酸、天冬氨酸、組氨酸和賴氨酸含量較高，為1 503.11 mg/100 g，此4種氨基酸占游離氨基酸總量的57.69%，對復合發酵沙蟹汁的滋味形成有重要貢獻。徐高丹等[20]報道發酵醬油中添加酵母菌，氨基酸的種類和含量會更加豐富，產品的感官評分和風味更好。李銳等[12]報道了克氏原螯蝦頭醬中添加復合發酵劑(木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和魯氏酵母菌)后，游離氨基酸含量明顯增加，產品風味更加醇厚。綜上，復合發酵沙蟹汁中鮮甜味氨基酸含量和游離氨基酸總量有顯著高于傳統沙蟹汁，產品滋味有較大的改善。

表5 傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁中游離氨基酸的含量 單位：mg/100 g

2.3.2 有機酸含量

傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁中有機酸含量的變化如表6所示。傳統沙蟹汁中有機酸含量最高為乙酸(246.28 mg/100 g)，其次為乳酸(173.22 mg/100 g)、琥珀酸(112.05 mg/100 g)，含量最低為蘋果酸(21.13 mg/100 g)。相比傳統沙蟹汁，復合發酵沙蟹汁中有機酸總量為665.19 mg/100 g(增加了13.54%)，其中蘋果酸、檸檬酸和乙酸含量分別降低了26.69%、14.28%和9.15%，而乳酸和琥珀酸含量顯著增加，為221.27 mg/100 g(增加了27.74%)和176.24 mg/100 g(增加了57.28%)。琥珀酸和乳酸是水產品中對呈味有重要貢獻的2種有機酸，特別是琥珀酸及其鈉鹽。琥珀酸具有清爽的酸味和鮮味，與鮮味氨基酸有協同作用，賦予產品可口的味覺和醇厚感[21]。有研究指出，丙酮酸脫水還原可形成琥珀酸，另外部分氨基酸在微生物作用下脫去氨基也可形成琥珀酸；部分乳酸可能來自于水產品本身，大多數則來自于發酵過程[22]。綜上，與傳統沙蟹汁相比，復合發酵沙蟹汁中乳酸和琥珀酸含量大幅度增加，對改善產品風味有重要貢獻，它們共同賦予復合發酵沙蟹汁酸味、鮮味和發酵香味。

表6 傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁中有機酸的含量 單位：mg/100 g

2.3.3 呈味核苷酸含量

呈味核苷酸是沙蟹汁中重要的呈鮮物質，影響產品的口感和風味。這些核苷酸化合物中，肌苷酸(IMP)、鳥苷酸(GMP)、腺苷酸(AMP)因其閾值低且鮮味突出，是重要的呈鮮物質。IMP和GMP具有清爽的鮮味，在食品工業中有著廣泛的應用[23-24]。AMP具有柔和的鮮味和甜味，能協調食物的整體滋味，壓抑苦澀味并增強鮮味的醇厚感[25]。

傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁中呈味核苷酸的含量如表7所示。傳統沙蟹汁中呈味核苷酸總量為213.28 mg/100 g，其中Hx含量最高，為56.86 mg/100 g，呈鮮味的5種核苷酸(IMP、GMP、AMP、ATP和ADP)含量為113.28 mg/100 g，占總量的52.89%。添加了復合發酵劑后，沙蟹汁中呈味核苷酸總量小幅度增加，為261.03 mg/100 g，呈鮮味的核苷酸中GMP、AMP和ATP含量無顯著變化，IMP和ADP含量略有增加，而呈苦味的Hx含量增加了21.92%。

表7 傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁中呈味核苷酸的含量 單位：mg/100 g

從整體來看，呈味核苷酸對復合發酵沙蟹汁風味提升的貢獻較小。

2.3.4 感官評分及氨基態氮和揮發性鹽基氮的含量

據報道，傳統沙蟹汁具有強烈的鮮味特點，其特征風味成分包括游離氨基酸、呈味核苷酸、有機酸、小分子肽等[1,3]。傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁的感官評分以及氨基態氮和TVB-N含量如圖2所示。傳統沙蟹汁的感官評分為6.29，其氨基態氮和TVB-N含量分別為(4.47±0.35)和(1.22±0.06) mg/mL。與傳統沙蟹汁相比，復合發酵沙蟹汁整體色澤明亮、香氣純正，不僅能保留了原有的鮮美滋味，同時腥異味顯著降低，其感官評分和氨基態氮含量分別增加17.31%和22.62%，揮發性鹽基氮含量降低了28.69%。氨基態氮濃度與游離氨基酸、小分子肽等滋味成分的含量密切相關。據報道，植物乳桿菌和魯氏酵母菌在發酵過程中可以將大分子蛋白轉化為氨基酸、小分子肽等物質[26-28]，使得復合發酵沙蟹汁中鮮味物質含量增高，使得產品風味更佳醇厚怡人。TVB-N是反映產品的腐敗程度和腥異味的重要指標，而酸性物質能一定程度上抑制腐敗微生物生長從而降低TVB-N的生成[22]。根據有機酸的結果，復合發酵沙蟹汁中有機酸含量增加，可能對揮發性鹽基態氮生成有抑制作用。

圖2 傳統沙蟹汁和復合發酵沙蟹汁的感官評分以及氨基態氮和揮發性鹽基氮含量 (mg/100 g)

3 結論

本研究首次采用微生物復合發酵法改良傳統沙蟹汁的制備工藝，在傳統工藝的基礎上添加魯氏酵母菌和植物乳桿菌進行發酵，植物乳桿菌和魯氏酵母菌的最佳混合濃度比例為3∶2，通過單因素試驗結合響應面法確定了最佳工藝條件：發酵初始pH值7.5，發酵時間17 d，發酵溫度26 ℃，發酵劑接種量5%，在此條件下沙蟹汁感官評分為7.38。相比于傳統沙蟹汁，復合發酵沙蟹汁的腥異味明顯降低，產品色澤清亮、香氣純正、滋味醇厚，其感官評分、氨基態氮含量、游離氨基酸總量、鮮甜味氨基酸含量和有機酸總量有不同程度增加，同時TVB-N含量顯著下降，這說明微生物復合發酵法能顯著提高沙蟹汁的風味品質。本研究為沙蟹汁的規模化生產和風味改良提供理論基礎，且對于沙蟹汁的市場推廣具有重要的實際意義。