不同陳化時間廣陳皮表面細菌和真菌多樣性變化分析

楊放晴,何麗英,楊丹,申夢園,王福,劉友平,胡媛

(成都中醫藥大學 藥學院,四川 成都,611137)

廣陳皮為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑的干燥成熟果皮[1],有理氣健脾、燥濕化痰之功效。其藥用歷史悠久,是嶺南地區著名道地中藥材[2]。同時可制成陳皮茶、飲料、添加劑和香料等,具有很高的食用價值[3]。傳統理論認為陳皮“陳久者良”[4],現代主要從不同貯藏年限的陳皮化學成分變化、藥理作用的強弱比較等方面對其進行探討,而對陳皮陳化機理的現代研究相對薄弱[5-6]。本課題組前期研究發現,陳皮中黃酮類成分的增長與藥材貯藏過程中表面污染真菌黑曲霉等的代謝活動相關[7]。相關文獻也報道微生物參與了陳皮的陳化過程,能夠轉化陳皮中化合物從而使活性物質含量增加[8]。

既往基于傳統的分離培養方法對廣陳皮中微生物多樣性進行研究,但廣陳皮中微生物菌群種類繁多,采用傳統的方法無法檢測出所有微生物,導致低估了菌群數量和多樣性[9]。隨著現代生物技術的發展和測序成本的降低,高通量測序技術越來越受到國內外學者的關注[10]。如陳聰聰[11]對3個不同產地的廣陳皮進行高通量分子測序,發現廣陳皮表面存在大量的Bacillus、Pseudomonas、Lactococcus、Enterococcus、Mycobacterium、Arthrobacter；何靜[12]對不同產地陳皮表面細菌群落多樣性進行研究,發現主要分布有Bacillus、Pseudomonas、Sphingomonas、Methylobacterium、Acinetobacter、Enhydrobacter、Enterobacter;劉麗娜[8]研究4個不同年份廣陳皮表面微生物群落多樣性,能準確檢測到的細菌屬有Pseudomonas、Sphingomonas、Methylobacterium、Lactobacillus等,檢測到的真菌屬有Xeromyces、Alternaria、Symmetrospora、Xerochrysium、Cladosporium、Mortierella、Pleurotus、Chaetomium、Gibberella；張鑫等[13]分析了不同產地陳皮表面真菌群落多樣性,發現主要優勢真菌是Erythrobasidium、Penicillium、Aspergillus、Rhodotorula和Mycosphaerella。不同學者研究結果不太一致,究其原因是由于這些研究實驗材料不一。但未見對陳化過程中陳皮表面細菌、真菌結構的分析報道。

本研究首次采用高通量測序技術對固定采收地點、采樣地點、果樹樹齡、貯藏養護條件下,陳化1～5年的廣陳皮表面微生物群落結構及多樣性變化進行分析,以期揭示廣陳皮陳化過程中微生物群落變化特征及變化規律,為適合陳皮陳化微生物的篩選提供基礎,同時為后續優勢功能菌的分離篩選,深入研究廣陳皮陳化機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 廣陳皮樣品的收集

于廣東省江門市新會區三江鎮新馬單村收集陳化1、2、3、4、5年的廣陳皮樣品(均在同一環境下貯存)各1批,編號依次為Y1～Y5。采集后迅速保存于-80 ℃。實驗所用樣品經成都中醫藥大學嚴鑄云教授鑒定為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑(Citrusreticulatacv. ‘Chachi’)的干燥成熟果皮。

1.2 主要試劑和儀器

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司；DZX-50KBS型立式高壓滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；GeneJET 膠回收試劑盒,Thermo Scientific公司；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、高效高保真酶,New England Biolabs 公司；Bio-rad T100 梯度 PCR 儀,美國Bio-rad公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒、NovaSeq 6000測序系統,Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取

用棉簽在廣陳皮表面擦拭多次,擦拭面積5 cm×5 cm共計用20支棉簽。擦拭后,將棉簽部分剪下。采用CTAB法提取基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度,取適量樣品入離心管,使用無菌水稀釋樣品至10- 6g/L[13]。

1.3.2 PCR擴增與測序

以稀釋后的基因組DNA為模板,根據測序區域的選擇,使用帶Barcode的特異引物。細菌主要針對16S rDNA的V4區進行擴增,引物為515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)[14]。真菌擴增區域為ITS1區,引物為ITS1-1F-F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS1-1F-R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)[14]。使用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR,確保擴增效率和準確性[15]。PCR反應體系(30 μL)：Phusion Master Mix(2×)15 μL,正反引物(2 μmol/L)各 1.5 μL,gDNA(1 mg/L)10 μL,ddH2O 2 μL。細菌PCR 反應參數：98 ℃預變性1 min；98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環；72 ℃ 5 min。真菌PCR 反應參數：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s,35個循環；56 ℃ 30 s；72 ℃ 15 s；72 ℃ 7 min。

1.3.3 PCR產物的混樣和純化

PCR產物使用質量分數2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等濃度混樣,充分混勻后使用質量分數2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產物,割膠回收目標條帶并用膠回收試劑盒回收目標條帶。

1.3.4 文庫構建和上機測序

使用Illumina 公司的TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫經Qubit定量和文庫檢測合格后,用NovaSeq 6000 測序系統進行上機測序。

1.4 數據分析

去除Barcode序列和引物序列,使用FLASH v1.2.7軟件進行拼接,得到原始Tags 數據(raw tags)。Raw tags進行嚴格的過濾處理[16]后參照QIIME v1.9.1[17]的Tags質量控制流程,與物種注釋數據庫比對剔除嵌合體,得到有效序列。利用UPARSE v7.0.1001軟件[18]以97%的一致性將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)。16S：用MOTHUR方法與SSUrRNA 數據庫對OTUs代表序列進行物種注釋分析(設定比對閾值為0.8～1)[19]。ITS：用QIIME軟件中的BLAST方法與Unit數據庫對OTUs代表序列進行物種注釋分析。獲得分類學信息,對各個分類水平上的群落結構進行統計分析。通過QIIME軟件進行Alpha多樣性指數分析。利用R軟件v2.15.3進行Alpha多樣性指數組間差異分析及繪制主成分分析(principal component analysis,PCA)圖。利用LEfSe軟件對樣品進行線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)。

2 結果分析

2.1 樣本數據統計

對不同陳化時間廣陳皮樣品進行微生物群落結構和多樣性測序分析質控后細菌共得到1 790 539條有效數據,對有效序列進行聚類,以97%的一致性將序列聚類為OTUs,共得到可分類OTUs數目約為90 033個,范圍為1 769～3 616。真菌共得到1 997 205條有效數據,以97%的一致性將序列聚類為OTUs,累計得到可分類OTUs數目約為7 886個,范圍在126～435。

2.2 不同陳化時間廣陳皮表面微生物多樣性分析

Alpha 多樣性用于分析樣品內微生物群落豐富度和多樣性。常用的分析指數包括Shannon、Simpson、Chao1、ACE和Coverage[20]。其中ACE指數和Chao1指數表示群落物種豐富度,Simpson指數和Shannon指數表示群落多樣性,Coverage指數表征測序得到的物種覆蓋率[21]。樣本中細菌的覆蓋率均在0.977以上,真菌覆蓋率均在0.999以上,表明測序深度均已覆蓋到測試樣本中的大部分物種,具有可靠的數據質量。

不同陳化時間廣陳皮表面細菌的Shannon、Chao1指數相對真菌而言普遍較大,說明廣陳皮陳化過程中細菌的物種總數和種類多于真菌。在表1中,陳化2年樣品具有最高的Shannon指數(7.67)和Chaol指數(3 632),此時細菌物種總量最高,群落組成最復雜。再者,Shannon指數和Chao1指數在5年陳皮樣品中數值最低,分別為5.78和2 082,明顯低于其余樣品。說明在廣陳皮陳化過程中細菌的物種總數和種類呈降低趨勢,細菌物種趨向單一化。

表1 不同陳化時間廣陳皮表面細菌Alpha多樣性指數(n=6)

對于真菌,由表2可知,陳化3年樣品具有最高的Shannon指數(4.14)和Chao1指數(439),此時真菌物種總量最高,群落組成最復雜。Shannon指數和Chao1指數在2年陳皮樣品中數值最低,分別為0.93和129,低于其余樣品。在廣陳皮陳化過程中,真菌的Shannon指數和Chao1指數變化趨勢沒有細菌明顯,但總體上呈降低趨勢。具體見圖1。

表2 不同陳化時間廣陳皮表面真菌 Alpha 多樣性指數(n=6)

圖1 不同陳化時間廣陳皮表面細菌和真菌群落多樣性(Shannon)及相對豐度(Chao 1)分析**P<0.01

2.3 微生物群落結構組成及其動態變化

2.3.1 不同陳化時間廣陳皮微生物門水平群落組成特征

不同陳化時間廣陳皮門水平細菌群落組成如圖2-a所示,Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Cyanobacteria等為優勢細菌。Proteobacteria為廣陳皮陳化過程中的絕對優勢菌門,不同陳化時間廣陳皮所有樣本相對豐度均在70%以上。Firmicutes隨陳化時間的增加相對豐度總體呈增長趨勢,并在陳化2年時相對豐度最高(10.22%)。Cyanobacteria 在廣陳皮陳化過程中相對豐度呈波動變化(0.77%～6.22%)。Actinobacteria隨陳化時間的增加總體呈降低趨勢,在陳化1年時相對豐度最高(7.21%),說明Actinobacteria的細菌較少或基本沒有參與陳皮陳化過程。根據高通量測序結果,在門的分類水平上,不同陳化時間廣陳皮樣品間細菌群落組成基本一致。

不同陳化時間廣陳皮門水平真菌群落組成如圖2-b所示,Ascomycota、Basidiomycota等為優勢真菌。Ascomycota為陳化1～5年廣陳皮中主要優勢真菌,相對豐度分別為62.17%、8.89%、46.11%、86.06%和52.13%。其次為Basidiomycota,相對豐度分別為13.13%、1.3%、17.94%、0.57%和1.49%。不同陳化時間廣陳皮中真菌群落結構一致,只是不同陳化時間廣陳皮的群落組成比例有差異。

圖2 門水平上細菌(a)及真菌(b)樣本的群落組成分析

2.3.2 不同陳化時間廣陳皮微生物屬水平群落組成

由圖3-a可知,在細菌屬水平上,主要分布為unidentified_Rickettsiales、Phyllobacterium、Methylobacterium、unidentified_Cyanobacteria、Pseudomonas、Sphingomonas、Stenotrophomonas、Lactococcus、Bacillus等。在已知細菌中,Phyllobacterium、Stenotrophomonas在陳化1～4年時相對豐度呈增加趨勢,在陳化4年相對豐度最高,分別為19.58%和10.21%,至陳化5年迅速下降。Pseudomonas隨陳化時間的增加相對豐度總體呈增加趨勢,在陳化4年時相對豐度最大(13.02%)。Methylobacterium隨陳化時間增加相對豐度總體呈降低趨勢,在陳化1年時相對豐度最高,為19.56%。Sphingomonas、Bacillus在陳化過程中相對豐度皆呈波動變化,其波動范圍分別在3.04%～7.02%、0.71%～1.24%。Lactococcus僅在陳化5年的廣陳皮樣本中存在,其相對豐度為3.14%。值得關注的是,陳皮表面Methylobacterium、Pseudomonas、Sphingomonas、Stenotrophomonas、Lactococcus、Bacillus與多種揮發油相關[11-12]；在對煙葉微生物結構多樣性分析中發現,Pseudomonas、Sphingomonas、Stenotrophomonas為廣泛分布的優勢細菌屬[22]。煙葉陳化過程中,菌屬間呈此消彼長的關系,細菌優勢功能菌群變化與化學成分逐級降解間呈顯著相關[23],能夠有效降低煙葉中尼古丁等有害成分的含量[24],增加煙葉香氣[25]。

在真菌屬水平上,主要包括Xeromyces、Cladosporium、Zasmidium、Symmetrospora、Aureobasidium、Fusarium、Aspergillus等(圖3-b)。其中Xeromyces在廣陳皮陳化過程中相對豐度總體呈增長趨勢,陳化4年時相對豐度最高(49.72%)。Zasmidium、Fusarium在陳化1年時相對豐度最高,分別為22.58%和11.53%,隨陳化時間的增加,相對豐度迅速下降,至陳化5年時豐度一直較低,說明Zasmidium、Fusarium的真菌菌落較少或基本沒有參與陳皮陳化過程；Cladosporium、Symmetrospora、Aureobasidium在陳化1年和3年樣本中相對豐度較高,其中Cladosporium、Aureobasidium在陳化3年豐度最高,分別為13.78%、8.48%,Symmetrospora在陳化1年豐度最高(10.87%)。Aspergillus在陳化3年豐度最高,為0.92%。值得注意的是,本課題組前期在陳皮表面鑒定出Aspergillusniger、Aspergillusflavus、Aspergillusfumigatus3種真菌,屬于Aspergillus。可見Aspergillus在陳皮中檢出率較高。Aspergillus雖是陳皮在陳化過程中常見的致病菌和霉菌,但大量文獻報道[7-8,26]Aspergillusniger等真菌廣泛應用于微生物轉化,影響陳皮藥效物質基礎的變化。

2.4 不同陳化時間廣陳皮樣本微生物屬水平豐度聚類分析

選取豐度排名前35的細菌屬和真菌屬,根據每個樣本各屬的豐度均值,分別對樣本之間細菌、真菌相對豐度進行聚類分析,得到熱圖。熱圖可以通過板塊顏色的相似性及差異性來反映多個樣本在各分類水平上群落組成,這樣能直觀地比較分析不同樣本在同一個分類學水平上的的異同[27]。將細菌屬水平群落結構熱圖(圖4-a)中Z>1的物種定為優勢細菌屬,繪制成表(表3)。結合表3和圖4-a可知,Methylobacterium,Sphingomonas等在陳化1年樣本中聚集較多；Bacillus,Lysinibacillus等在陳化2年樣本中分布最為豐富；Rickettsia,Craurococcus等主要分布在陳化3年樣本中；Phyllobacterium,Pseudomonas等分布在陳化4年的樣本；Pantoea,Lactococcus等在陳化5年時分布較多。

表3 不同陳化時間廣陳皮表面優勢細菌屬分布情況

將真菌屬水平群落結構熱圖(圖4-b)中Z>1的物種定為優勢真菌屬,繪制成表(表4)。結合表4和圖4-b可知,Zasmidium,Cladosporium等在陳化1年樣本中聚集較多；Rhodotorula在陳化2年樣本中分布最為豐富；Cladosporium,Aureobasidium等主要分布在陳化3年樣本中；Xeromyces,Xerochrysium分布在陳化4年的樣本；Gibellulopsis,Erythrobasidium在陳化5年時分布較多。

a-屬水平上細菌群落結構熱圖；b-屬水平上真菌群落結構熱圖

表4 不同陳化時間廣陳皮表面優勢真菌屬分布情況

2.5 不同陳化時間廣陳皮物種組成相似度分析

應用PCA分析對不同陳化時間廣陳皮樣品物種組成相似度進行評價,若樣品的物種組成越相似,則在PCA圖中距離越相近。對不同陳化時間廣陳皮樣本進行屬水平上細菌的PCA分析,研究細菌樣本的相似性和差異性。結果顯示第1主坐標(PC1)和第2主坐標(PC2)分別解釋65.08%和12.02%的群體遺傳變異。PCA分析結果顯示,陳化5年的樣本距離其他樣本較遠,說明陳化5年的樣本群落組成與其他樣本相比具有一定的菌群差異(圖5-a)。對不同陳化時間廣陳皮樣本進行屬水平上真菌的PCA分析,第1主坐標(PC1)和第2主坐標(PC2)分別占所有差異的44.13%和38.69%。根據距離遠近,陳化1年與陳化3年品的距離較小,物種組成相似。陳化2、4、5年樣本間距離較小,物種組成接近(圖5-b)。

a-細菌樣本；b-真菌樣本

2.6 不同陳化時間廣陳皮微生物差異物種分析

LEfSe分析能夠在組與組之間尋找具有統計學差異的Biomarker,柱狀圖種展示了LDA Score>4的物種,即組間具有統計學差異的Biomarker。柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小。在柱狀圖中,分析了不同陳化時間廣陳皮表面由門至屬(或種)分類級別的微生物。由圖6-a可知,陳化1年廣陳皮中細菌豐度差異顯著的物種有3種,主要是Rhizobiales、Beijerinckiaceae、Methylobacterium；陳化2年時細菌差異顯著物種主要是unidentified Gammaproteobacteria；陳化3年細菌差異顯著物種主要是Rickettsiaceae、Rickettsia等7種；陳化4年為Rhizobiaceae、Gammaproteobacteria等11種。陳化5年為unidentified Rickettsiales、Rickettsiales 等16種。可以看出在陳化5年廣陳皮中細菌差異顯著物種最多。

由圖6-b可知,陳化1年廣陳皮中真菌豐度差異顯著的物種有15種,主要是Dothideomycetes、Capnodiales、Mycosphaerellaceae、Zasmidium等；陳化3年時真菌差異顯著物種主要為Basidiomycota、Cystobasidiomycetes等9種；陳化4年真菌顯著差異物種主要是Eurotiales、Eurotiomycetes、Aspergillaceae等6種。可以看出在陳化1年廣陳皮中真菌差異顯著物種最多。

a-細菌樣本；b-真菌樣本

3 結論

既往報道主要在陳皮表面致病菌的分離鑒定和生物學特征上,對陳化過程中微生物群落結構及多樣性變化研究鮮有報道。結合歷代本草對于陳皮陳化時間“隔年”、“2、3年”記載和地理標志產品新會陳皮規定自然陳化3年以上者才為陳皮,該實驗首次通過高通量測序技術對固定采收地點、采樣地點、果樹樹齡、貯藏養護等條件陳化1～5年的廣陳皮表面微生物群落結構及多樣性變化進行研究。

結果表明不同陳化時間廣陳皮樣本表面細菌、真菌組成結構基本一致,但相對豐度差異明顯,優勢菌屬不同。Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Cyanobacteria是不同陳化時間廣陳皮表面主要優勢細菌菌門。細菌屬水平上,主要分布有unidentified_Rickettsiales、Phyllobacteriu、Methylobacterium、unidentified_Cyanobacteria、Pseudomonas、Sphingomonas、Stenotrophomonas、Lactococcus、Bacillus。隨陳化時間的增加,從以Methylobacterium、Sphingomonas為優勢轉變為以Bacillus,Pseudomonas,Stenotrophomonas,Lactococcus為主。就真菌而言,Ascomycota、Basidiomycota是不同陳化時間廣陳皮表面主要優勢真菌菌門。真菌屬水平上,主要分布有Xeromyces、Cladosporium、Zasmidium、Symmetrospora、Aureobasidium、Fusarium、Aspergillus。隨陳化時間的增加,從以Zasmidium、Cladosporium、Symmetrospora、Fusarium為優勢轉變為以Cladosporium、Aureobasidium、Aspergillus、Xeromyces為主。

本實驗通過高通量測序技術,不僅全面揭示參與廣陳皮自然陳化過程中的微生物群落及其動態變化規律,并檢測出不同陳化時間廣陳皮表面優勢菌屬,為后續優勢功能菌的分離篩選及探究陳皮陳化機理提供科學依據。陳皮陳化對提升陳皮質量至關重要,然而陳皮自然陳化過程時間長、成本高。目前,利用微生物轉化增加有效成分,改善品質研究較為廣泛。因此可以在明確陳皮陳化機理后可以探索是否有“人工催陳”方法來縮短陳化時間、減少經濟的損失、資源的浪費[5]。