ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對氣調包裝即食小龍蝦的保鮮效果研究

劉文浩，徐曉云，吳婷，徐若瀅，劉浩越

(華中農業大學 食品科學技術學院，武漢 430070)

小龍蝦，學名克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，也稱紅螯蝦和淡水小龍蝦，是我國重要的淡水經濟蝦[1]。小龍蝦肉質有彈性，味道鮮美，風味獨特，具備蛋白質含量高、脂肪和膽固醇含量低等特點，富含鎂、鋅、碘、硒和蝦青素等對人體健康有益的營養物質，受到消費者的廣泛喜愛[2-3]。但是小龍蝦的水分、蛋白質含量高，加之運輸和儲藏過程中的溫度波動和環境影響，易滋生微生物腐敗變質，導致貨架期較短[4-6]。鄧靈等[7]研究發現熟制小龍蝦中主要有蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌；周濤等[8]在不同溫度存放即食小龍蝦，探究了其微生物菌群變化，在4 ℃貯藏條件下優勢菌群為海洋桿菌屬和希瓦氏菌屬，在25 ℃貯藏條件下的優勢菌群為哈撒韋氏菌屬、芽孢桿菌屬、狹義梭菌屬，兩種貯藏溫度下優勢腐敗菌不同；于曉慧等[9]從儲藏末期即食小龍蝦中分離出的優勢腐敗菌為檸檬酸桿菌。

常見的蝦類產品防腐保鮮方法有低溫儲藏、加熱殺菌、輻照殺菌、真空包裝、氣調包裝、食品防腐劑的添加等，其中添加食品防腐劑能夠在保證食品營養價值和風味的同時起到抑菌、抗氧化的作用，可有效防止腐敗變質，延長產品貨架期。目前天然抑菌劑和化學防腐劑相比具有安全性高和抑菌譜廣等優點，按照來源可分為動物源、植物源和微生物源三類，有不同的應用范圍和特點，就即食食品延長貨架期來說，具備較高的研究價值[10-11]。ε-聚賴氨酸鹽酸鹽是鏈霉菌屬發酵過程中的代謝產物，經分離提取精制而獲得，是一種生物防腐劑具有抑菌能力強，抑菌范圍廣、水溶性好、熱穩定性強等特點[12]，根據GB 2760-2014添加限量為0.30 g/kg。李秋瑩等[13]綜述了ε-聚賴氨酸在水產品中不同的應用方式和抑菌機理，能有效保持水產品的新鮮程度，延長貨架期；楊華等[14]制備了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽微膠囊并將其應用在美國紅魚魚片中，具有較好的保鮮性能和長效抑菌性。

因此，本研究對即食小龍蝦中的腐敗菌進行分離鑒定，通過單因素抑菌試驗確定ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的最佳抑菌濃度，并應用在產品中，通過對15 ℃存放過程中菌落總數、大腸菌群、Aw、TVB-N、TBARS的研究，分析了天然保鮮劑對小龍蝦的保鮮效果及貨架期的影響，為進一步研究小龍蝦及其制品的防腐保鮮提供了一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

即食小龍蝦(原料小龍蝦經油炸、鹵制、攤晾、氣調包裝等環節制作)：某醬鹵食品有限公司提供；平板計數瓊脂、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂、煌綠乳糖膽鹽瓊脂、營養瓊脂、營養肉湯：北京陸橋技術股份有限公司；DNA提取試劑盒：武漢擎科生物有限公司；ε-聚賴氨酸鹽酸鹽：浙江新銀象生物工程有限公司；D-異抗壞血酸鈉：諸城華源生物工程有限公司；甲基紅、溴甲酚綠、2-硫代巴比妥酸：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；HWS-260恒溫恒濕箱 寧波樂電儀器制造有限公司；SW-CJ-2D雙人超凈工作臺 浙江蘇凈凈化設備有限公司；DK-98-Ⅱ電 熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；SHA-A恒溫振蕩器 常州天瑞儀器有限公司；GI54DP高壓滅菌器 廈門致微儀器有限公司；UV759紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；TDZ5-WS離心機 湖南平凡科技有限公司；AR224CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司；HD-3A水分活度測量儀 無錫華科儀器儀表有限公司；KDN-103A自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氣調包裝即食小龍蝦中腐敗菌的分離純化

按GB/T 4789.2-2010中的方法略有改動，將樣品稀釋液取0.1 mL涂布于已滅菌的NA營養瓊脂，同時做空白對照，每組樣品做3組平行。于37 ℃恒溫培養，培養48 h 后，選取菌落數在30～300的稀釋度進行計數。

根據菌落形態、革蘭氏染色結果進行分類，在營養瓊脂平板上劃線分離(重復3次劃線純化)，于37 ℃恒溫培養24 h，挑取典型單一菌落于-20 ℃磁珠保存。

1.2.2 腐敗菌的16S rDNA鑒定

1.2.2.1 提取細菌基因組DNA

將低溫保藏的菌種用LB培養基于37 ℃振蕩培養18 h活化，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，具體步驟根據試劑盒使用說明書。

1.2.2.2 PCR擴增

用16S通用引物，2 μL的27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，2 μL的1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對DNA進行PCR擴增。PCR參數設置為98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環，72 ℃終延伸5 min，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物。

1.2.2.3 由武漢擎科生物有限公司測序

對獲得的序列在NCBI網站進行BLAST序列分析，選取相似度高的基因序列，采用MEGA 7.0軟件分析構建系統發育樹。

1.2.3 保鮮劑對腐敗菌的抑制作用

對分離純化的兩種菌進行活化和復壯。從磁珠保藏管中分別取出一顆磁珠放入含有100 mL營養肉湯培養基的錐形瓶中，于恒溫水浴搖床37 ℃，150 r/min培養18 h，菌液濃度約為108CFU/mL。

對ε-聚賴氨酸鹽酸鹽按照0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 g/kg濃度梯度用無菌水配制成100 mL的抑菌液備用。

根據顧勝[15]的方法有所改動，活化菌液濃度約為108CFU/mL，在無菌操作下稀釋6～7倍(至可計數)，分別吸取同等體積的菌液和抑菌液到試管中混勻，同時將相同體積的菌液與營養肉湯混勻做空白對照，各取0.1 mL至培養平皿中，倒入已滅菌冷卻至45～50 ℃的營養瓊脂培養基，充分混勻，凝固后倒置于37 ℃培養箱中培養24 h，觀察計數。統計平板上的菌落數，計算抑菌率，抑菌率=(空白組菌落數-抑菌組菌落數)÷空白組菌落數×100%。

1.2.4 保鮮劑的驗證實驗

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽按照配比加入到小龍蝦的鹵制中，以不加保鮮劑的小龍蝦為對照。在15 ℃儲藏中測定產品的感官、菌落總數、大腸菌群、TBARS值、TVB-N值、Aw值驗證保鮮劑對小龍蝦的保鮮效果。

1.2.5 指標測定1.2.5.1 感官評定

采取滿分10分的評分制度[16-17]，由6名感官評定人員參與評鑒，對氣調包裝即食小龍蝦從肉質、外觀、氣味3個方面進行分析，當評分在6分以下則表示感官品質較差、不可接受，具體評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 The sensory evaluation criteria

1.2.5.2 菌落總數的測定

按照GB 4789.2-2016中食品微生物菌落總數的測定方法實行。

1.2.5.3 大腸菌群的測定

按照GB 4789.3-2016中食品微生物大腸菌群的平板計數法實行。

1.2.5.4 水分活度(Aw)的測定

按照GB 5009.238-2016中食品水分活度的水分活度儀擴散法實行。

1.2.5.5 揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定

按照GB 5009.228-2016中食品中揮發性鹽基氮的自動凱氏定氮儀法實行。

1.2.5.6 脂質過氧化(TBARS)的測定

稱取10 g 絞碎均勻的蝦肉，加入50 mL 7.5%三氯乙酸和0.1% EDTA，振蕩30 min后過濾，取上清液5 mL加入5 mL TBA 溶液，沸水浴加熱40 min，冷卻后 4000 r/min離心20 min，取上清液加入5 mL氯仿，搖勻靜置分層，取上清液在532 nm處比色[18-19]。TBARS值計算公式如下：

TBARS/(mg/kg)=A532÷W×9.48。

式中: A532為待測液在532 nm處的吸光度值；W為樣品質量，g。

1.2.6 數據處理與分析

實驗采取3組平行，用SPSS 21和Excel軟件處理數據，用Origin作圖，采用NCBI網站和MEGA 7軟件分析16S rDNA測序結果。

2 結果與分析

2.1 平板菌落計數和腐敗菌的分離

即食小龍蝦肉經均質、濃度梯度稀釋后，測定菌落總數和大腸菌群，結果見圖1。15 ℃的氣調包裝即食小龍蝦在第2天大腸菌群超過2 lg CFU/g，根據GB 10136-2015，已超標，不能食用。

圖1 即食小龍蝦菌落數Fig.1 The bacterial colony count of ready-to-eat crayfish

根據菌落形態、革蘭氏染色結果對平板上的菌落進行分類，并計算所占比例，結果見表2。對腐敗菌劃線分離，保藏備用。

表2 腐敗菌的形態特征及比例Table 2 The morphological characteristics and proportion of spoilage bacteria

2.2 16S rDNA鑒定

對篩選得到的兩株菌進行DNA提取，利用通用引物進行PCR序列擴增，產物凝膠電泳圖見圖2，條帶單一明亮，大小約為1200 bp。

圖2 菌株擴增凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of strain amplification

對PCR產物測序，得到基因序列在NCBI網站進行BLAST序列分析，選取相似度在98%以上的菌株用MEGA 7軟件構建系統發育樹，結果見圖3。

圖3 菌株系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

由圖3可知，兩株菌歸類為弗氏檸檬酸桿菌，將其命名為弗氏檸檬酸桿菌J1和弗氏檸檬酸桿菌J2。

2.3 ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對腐敗菌的抑菌效果

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽作為一種廣譜抑菌劑，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌均有抑制作用，它是通過破壞細胞膜和細胞壁膜的完整性，造成物質外滲，影響蛋白質合成等正常生理功能，抑制微生物生長[20-21]。實驗結果表明，ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對弗氏檸檬酸桿菌J1和J2均具有較強的抑制作用，在低濃度添加量0.1 g/kg時就可達到抑菌率100%，未超出GB 2760-2014的添加限量0.30 g/kg，可作為單一防腐劑使用。

2.4 天然保鮮劑的保鮮效果應用結果

即食小龍蝦在存放過程中由于溫度波動，脂肪和蛋白質氧化等容易滋生微生物，引起產品腐敗，根據前期實驗室研究基礎添加1.5% D-異抗壞血酸鈉能夠有效降低醬鹵產品的氧化程度，因此添加0.01% ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和1.5% D-異抗壞血酸鈉可達到抑制微生物生長和抗氧化的目的，延長氣調包裝即食小龍蝦在(15±2) ℃儲藏條件下的貨架期。

2.4.1 感官評價

由表3可知，隨著存放時間延長，對照組和保鮮劑處理組的感官評分逐漸降低，但處理組下降的程度明顯小于對照組。對照組在1～3 d，實驗組在1～5 d時小龍蝦的組織結構完整，肉質緊實有彈性，體表顏色鮮紅，氣味正常，無明顯變化，處于一級和二級鮮度，感官可接受。對照組到第4天，處理組到第6天，感官評分<6，此時小龍蝦結構變得松散，蝦肉發硬發黑，外殼變暗紅，出現黑色斑點，略帶異常氣味，感官不可接受，認定小龍蝦已經腐敗變質。說明ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和D-異抗壞血酸鈉維持了小龍蝦的感官品質，抑制了存放過程中微生物的滋生，起到了較好的防腐保鮮效果，延長了產品的貨架期。

表3 感官評分Table 3 The sensory evaluation scores

2.4.2 菌落總數和大腸菌群

由圖4和圖5可知，在儲藏過程中即食小龍蝦的大腸菌群和菌落總數逐漸增加，對照組明顯高于保鮮劑處理組。根據GB 10136-2015和李肖嬋的研究[22]，大腸菌群數2 lg CFU/g和菌落總數5 lg CFU/g為貨架期終點。對照組在第2天時大腸菌群數已超過2 lg CFU/g，產品不能食用；處理組在1～4 d時大腸菌群和菌落總數都<10，第5天開始微生物生長，第6天時大腸菌群數到3.6 lg CFU/g，菌落總數達到5.1 lg CFU/g，小龍蝦已經腐敗。與對照組相比，保鮮劑明顯延緩了微生物的生長，保證了即食小龍蝦的存放，貨架期延長了4 d。

圖4 大腸菌群變化Fig.4 Changes of coliform

圖5 菌落總數變化Fig.5 Changes of the total number of bacterial colony

2.4.3 TVB-N變化

由圖6可知，小龍蝦在存放中揮發性鹽基氮的含量逐漸升高，且對照組的含量顯著高于保鮮處理組。根據GB 2733-2015和于曉慧的研究，將TVB-N值20 mg/100 g作為腐敗臨界值，對照組在1～3 d內揮發性鹽基氮的含量持續上升，達到21.6 mg/100 g。處理組在1～4 d內緩慢增長，由于微生物的生長分解蛋白質產生鹽基氮類物質，在第6天達到22.3 mg/100 g，產品不可食用。因此，保鮮劑的處理能夠抑制即食小龍蝦中微生物的生長，減緩揮發性鹽基氮值的升高，有效延長了產品的貨架期。

圖6 TVB-N值變化Fig.6 Changes of TVB-N values

2.4.4 TBARS值的變化

由圖7可知，TBARS值與即食小龍蝦的儲藏時間呈正相關，這是由于在存放過程中小龍蝦中的不飽和脂肪酸不斷被氧化產生醛和酮等過氧化物[23]，使TBARS值升高。對照組明顯高于保鮮劑處理組，是由于ε-聚賴氨酸鹽酸鹽抑制微生物的生長分解脂肪，D-異抗環血酸鈉抑制脂質的過氧化，減緩了TBARS值的增長，起到了保鮮的作用。

圖7 TBARS值變化Fig.7 Changes of TBARS values

3 結論

通過對15 ℃下儲存的氣調包裝即食小龍蝦中腐敗菌進行分離篩選，16S rDNA序列鑒定得到優勢腐敗菌為弗氏檸檬酸桿菌；研究了ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對腐敗菌的抑制作用，使用量在0.1～0.3 g/kg范圍內均能達到100%抑菌率；添加了0.01% ε-聚賴氨酸鹽酸鹽和1.5% D-異抗壞血酸鈉的氣調包裝即食小龍蝦在(15±2) ℃條件下，能夠有效保持小龍蝦的感官品質，明顯減少了微生物數量的增長，減緩了TVB-N含量、TBARS值的上升速率，保持了產品的新鮮程度，使即食小龍蝦的貨架期由原來的2 d延長到6 d。