醬油釀造優良米曲霉菌株的高效選育

李雪玲，顏喆，胡文鋒

(華南農業大學 食品學院應用微生物研究室，廣州 510642)

醬油是一種重要的傳統調味食品，具有獨特的風味，在亞洲國家有廣泛的應用[1]。醬油除調味功能外，還具有保健功效，醬油中含有的一些生理活性物質具有抗癌、抗白內障、抗血小板凝固、抗氧化和抑制組氨酸脫羧酶的作用[2-4]。

米曲霉是一種非常重要的傳統發酵微生物，特別是在醬油發酵中更具有不可估量的作用[5]。醬油釀造主要依賴于米曲霉所產生的豐富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多種酶系來分解原料中的多種成分，從而形成醬油獨特的色、香、味、體。醬油生產米曲霉菌種的性能決定了醬油的品質及原料利用率，因此，醬油生產中選育優良的米曲霉菌株至關重要，它關系到醬油產品的產量和質量[6]。

由于各種因素的影響，譬如長期的移種和保藏，醬油生產中使用的米曲霉菌種會出現退化、變異，丟失某些重要形態特征或良好生產性能，造成生產不穩定、低產。因此，在未發生退化前就應該適時進行米曲霉菌種的復壯篩選，以保持其原有的優良性能。而傳統的復壯篩選工藝流程繁瑣，需要耗費大量人力、物力才能夠達到預期目標。本研究在傳統復壯篩選工藝的基礎上，建立氨基酸態氮得率的實驗模型，同時對米曲霉菌落形態特征與氨基酸態氮得率的關系也進行了大量的對比研究及驗證以高效選育優良菌株，為減少復篩的工作量，提高復壯篩選的效率和質量，提升釀造醬油品質提供了一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發菌株

米曲霉(Aspergillusoryzae)：廣東珠江橋生物科技股份有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 原料與試劑

面粉、豆粕、麥糠、食鹽：均由廣東珠江橋生物科技股份有限公司提供；化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 豆汁斜面培養基

大豆經低溫浸泡過夜、反復加水煮汁3 h后得到豆汁，調整其濃度，加入無機鹽制成豆汁斜面培養基，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3.2 酪蛋白培養基

干酪素4.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，Na2HPO41.07 g，KH2PO40.36 g，瓊脂粉20.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5～7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3.3 種曲培養基

面粉20 g，麩皮80 g，水80～100 mL，250 mL三角瓶裝濕料20 g，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3.4 大曲培養基

面粉200 g，豆粕700 g，麩皮100 g，水600 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備單孢子懸浮液

將米曲霉出發菌株接種于豆汁斜面培養基，于30 ℃培養3～5 d。選取生長良好的斜面菌種，用10 mL無菌水洗下斜面上的孢子，倒入含有玻璃珠的100 mL無菌三角瓶中，磁力攪拌5 min以分散孢子，然后用血球計數板計數，進行相應梯度稀釋后制成不同濃度的孢子懸浮液。

1.2.2 初篩

采用稀釋平板法篩選米曲霉：吸取酪蛋白培養基置于直徑9 cm的平皿中，將上述稀釋至適當濃度的孢子懸浮液添加在酪蛋白平板上，用滅菌的玻璃刮板涂布均勻，于32 ℃培養箱中倒置培養72 h，每個平皿的菌落數以6～8個為宜，觀察菌落形態特征，測量菌落直徑(d)、透明圈直徑(D)，計算K值(K=D/d)。

1.2.3 復篩1.2.3.1 中性蛋白酶活力測定

按照行業標準SB/T 10317-1999的方法測定酶活力[7]。酶活力定義：在40 ℃條件下，每1 g曲在1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位。

1.2.3.2 醬醪發酵指標測定

總酸、氨基酸態氮的檢測按照GB/T 18186-2000《釀造醬油》的方法進行[8]。

1.2.3.3 孢子發芽率測定

按照行業標準SB/T 10316-1999的方法測定發芽率[9]。

2 結果與分析

2.1 米曲霉菌株的初篩

從酪蛋白平板上挑選出菌落直徑d、透明圈直徑(D)和K值(K=D/d)在不同范圍的菌落，并記錄相應菌落的孢子特征。根據d、D、K值及菌落孢子的特征將挑選出的菌落分成A，B，C，D，E，F 6個類別，每種類別選取1個典型的菌株(見表1)。將6類菌株分別接種于豆汁試管斜面，30 ℃培養72 h，菌種形態特征見圖1。

表1 初篩米曲霉菌株的各項指標Table 1 The indexes of Aspergillus oryzae strainin preliminary screening

圖1 初篩米曲霉菌株的菌落形態特征Fig.1 The colony morphological characteristics of Aspergillus oryzae strain in preliminary screening

由圖1可知，E菌落孢子較多，菌絲致密，F菌落孢子多，菌絲薄、疏，A，B，C，D 4個菌落孢子少，菌絲稀疏。通過測定這些菌株三角瓶、制曲階段的中性蛋白酶活以及低鹽發酵放油的氨基酸態氮指標，復篩優良的米曲霉菌株。

2.2 優良米曲霉菌株的復篩

2.2.1 菌株三角瓶成曲中性蛋白酶活力的測定

將初篩挑選出的6株斜面菌種分別接種到三角瓶培養基進行擴大培養，32 ℃培養72 h，三角瓶成曲檢測中性蛋白酶酶活，結果見圖2。E，F兩個菌株三角瓶成曲的中性蛋白酶活力明顯比對照菌株高約1000 U/g，其中E菌株提高幅度較大。

圖2 米曲霉復篩菌株三角瓶成曲的中性蛋白酶活力Fig.2 The activity of neutral protease of rescreened Aspergillus oryzae strain in triangular flask

2.2.2 菌株制曲中性蛋白酶活力的測定

模擬大生產條件進行小規模制曲，檢測制曲成曲的中性蛋白酶活力，結果見圖3。E，F兩個菌株制曲成曲的中性蛋白酶活力分別為2480，2300 U/g，比對照菌株分別高13.76%和5.5%，可見通過復壯篩選能夠篩選出中性蛋白酶活力顯著提高的菌株。

圖3 米曲霉復篩菌株制曲成曲中性蛋白酶活力Fig.3 The activity of neutral protease of rescreenedAspergillus oryzae strain in finished koji

2.2.3 復篩菌株低鹽發酵放油氨基酸態氮含量的測定

按照低鹽固態發酵法，將復篩挑選出的菌株做低鹽發酵，檢測低鹽發酵總酸、氨基酸態氮，結果見圖4和圖5。E菌株在三角瓶、制曲階段的中性蛋白酶活力最高，低鹽發酵放油的氨基酸態氮也較高，比對照高8.4%，可見E菌株蛋白質分解能力最強，提高了原料的利用率，該菌株為選育出的優良高產菌。

圖4 復篩菌株低鹽發酵頭油總酸含量Fig.4 The total acid content of first oil of rescreened strain by low-salt fermentation

圖5 復篩菌株低鹽發酵頭油氨基酸態氮含量Fig.5 The amino acid nitrogen content of first oil of rescreened strains by low-salt fermentation

2.2.4 多元線性回歸分析

以菌落直徑d和K值為自變量，以氨基酸態氮得率為因變量，用SPSS軟件建模，進行多元線性回歸分析。經分析，回歸方程的相關系數R=0.963，決定系數R2=0.927，經方差分析，F=19.184，P=0.020，回歸方程有效，見表2和表3。

表2 回歸方程方差分析表Table 2 The variance analysis of regression equation ANOVAb

表3 回歸分析檢驗結果Table 3 The testing results of regression analysis coefficientsa

回歸得到不同菌落的氨基酸態氮得率水平(U)與K值和菌落直徑d之間的關系為：U=0.035d+0.332K+0.060(式1)，式中菌落直徑d相當于比生長速率，K相當于單個孢子的氨基酸態氮得率系數，對于不同的菌株其比生長速率和氨基酸態氮得率系數不同，因此它們的d值和K值也不同，根據式1可以從酪蛋白平板上的菌落直徑d和K值判斷菌落的氨基酸態氮得率水平。

用回歸方程建立模型的方法可以更準確地判斷菌株的氨基酸態氮得率水平與菌落直徑d和K值之間的關系，可見菌落直徑和K值都相對較大時，該菌株的氨基酸態氮得率水平也較高。

2.2.5 篩選菌株菌落形態特征的回歸分析

E，F兩個菌株三角瓶、制曲的中性蛋白酶活力和低鹽發酵放油的氨基酸態氮水平都明顯比對照菌株高，其中E菌株的優勢更為明顯，為復篩得到的高產菌株。

由表1和圖1可知，E，F兩個菌落孢子都比較多，但F的菌絲不如E的致密、厚，由此可見初篩挑選菌落時，要將菌落直徑、K值和菌落形態特征三者結合起來作為評價標準，重點挑選孢子多和菌絲致密、厚的菌落，采用此評價標準可以大大提高菌株篩選的效率和準確性。

2.2.6 優良菌株穩定性研究

將E菌株進行5次斜面傳代，每一代斜面菌種同時接種于三角瓶種曲培養基中進行菌種培養，每傳代一次檢測三角瓶菌種的中性蛋白酶活力和發芽率[10]，結果見圖6和圖7。

圖6 優良菌株的遺傳穩定性Fig.6 The genetic stability of superior strains

圖7 優良菌株的連續傳代的發芽率Fig.7 The germination rate of continuous passage of superior strains

由圖6可知，E菌株經過5代連續傳代培養，其三角瓶成曲的中性蛋白酶活力均保持在7900 U/g以上，而且酶活力變化不大，該菌株保持了較好的產酶穩定性[11]，每一代的酶活力都優于出發菌株(酶活7014 U/g)。由圖7可知，三角瓶成曲的發芽率均保持在94.0%以上，每一代的發芽率都優于出發菌株(發芽率89.6%)，綜合復篩與遺傳穩定性實驗結果可知該菌株同時擁有較高的酶活力與穩定的遺傳穩定性[12]。

3 結論

該研究通過醬油釀造優良米曲霉菌株的初篩和復篩，選育出E菌株為高產優良菌株，該菌株在三角瓶、制曲階段的中性蛋白酶活力以及低鹽發酵放油的氨基酸態氮指標都具有明顯的優勢。在此基礎上建立了米曲霉氨基酸態氮得率的篩選模型，得到了氨基酸態氮得率與K值和菌落直徑d的關系，建立回歸方程U=0.035d+0.332K+0.060，米曲霉氨基酸態氮得率的高低可以通過酪蛋白平板上的菌落直徑大小和K值來確定，菌落直徑和K值都相對較大時，該菌株的氨基酸態氮得率水平也較高，通過菌落直徑d和K值可以初步判斷菌株發酵放油的氨基酸態氮水平，減少了復篩的工作量，提高了復壯篩選的效率和準確性。

研究結果表明，可以通過酪蛋白平板上的菌落形態特征判斷菌株的產酶能力和發酵放油的氨基酸態氮水平，一般菌落孢子較多、菌絲較厚的菌株產酶能力強，氨基酸態氮得率高，將K值和菌落直徑結合起來挑選菌株，采用此方法選育菌株，選育準確性和效率都較高。

篩選出的優良菌株的傳代穩定性是重要的參考標準，如果菌株在傳代過程中的酶活迅速降低，證明篩選出的菌株很容易退化。

采用蛋白酶活力高的優良菌株釀造醬油，不僅可以提高原料的利用率，而且能減少釀造工業的污染。采用米曲霉氨基酸態氮得率的篩選模型選育高效優良的菌株，可以為實際生產中制曲菌種的選擇提供依據，并為制曲菌株的選育研究提供參考。