花椒總多酚的提取工藝優(yōu)化及其抑菌作用

王文杰，焦士蓉，孫博瑞，包善思

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039)

花椒是我們常見的調(diào)味品, 放在食物中不僅有特殊的芳香氣，花椒還具有抗菌、溫中散寒、除濕、止痛、殺蟲、解魚腥毒的功效，治積食停飲、心腹冷痛、嘔吐、齒痛、蛔蟲病、蟯蟲病、陰癢、瘡疥，在食品和藥品領(lǐng)域具有很大潛力[1]。利用植物中活性物質(zhì)制備農(nóng)藥是當(dāng)今熱點(diǎn)之一，對(duì)食品安全方面跨出了重要的一步，而花椒中總多酚物質(zhì)具有不錯(cuò)的殺菌效果[2-3]，抑菌作用是花椒的重要功能活性之一[4]。天然防腐領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[5-6]。近年來對(duì)花椒的研究主要集中在其精油和生物堿的提取利用[7]，花椒多酚類物質(zhì)研究相對(duì)較少，本文主要以花椒為原料，優(yōu)化多酚提取工藝并對(duì)其抑制病原真菌的能力做出了探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)：市售；福林-酚試劑(AR)：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；硫酸鏈霉素原藥(Amresco-0382)；90%多菌靈原藥(Carbendazim)：陜西先農(nóng)生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

供試菌株：玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydisbio-12080)、小麥赤霉菌(GibberellazeaeACCC 39334)、番茄灰霉菌(灰葡萄孢菌BotrytiscinereaPers. ACCC 36034)、葡萄白腐菌(白腐盾殼霉菌ConielladiplodiellaPetrak et Sydow ACCC 36140)、油菜菌核病菌(核盤菌Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary ACCC 36083)、柑橘綠霉菌(Penicilliumdigitatum(Pers.)Sacc ACCC 30389)、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary)均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PDA培養(yǎng)基[8]。

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；MP17C-KE美的家用微波爐 佛山市順德區(qū)北滘鎮(zhèn)三洪奇工業(yè)區(qū)；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取0.1 g沒食子酸，放入100 mL容量瓶中，加入100 mL蒸餾水定容。取不同體積的母液定容至50 mL，加入2 mL的福林-酚搖至均勻，靜置5 min，滴入4 mL 10%的碳酸鈉溶液，放入25 ℃恒溫水浴中，2 h后進(jìn)行吸光度測(cè)定[9-10]。于760 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of polyphenols

由圖1可知，其相關(guān)系數(shù)為R2=0.9998，說明此回歸方程的擬合度高，可準(zhǔn)確計(jì)算出多酚的質(zhì)量濃度。

1.2.2 多酚的提取實(shí)驗(yàn)

稱取10 g花椒于燒瓶中，倒入60%乙醇浸泡10 min，之后定容至100 mL，在恒溫水浴中回流提取，取樣100 μL，計(jì)算其中多酚的質(zhì)量濃度。

1.2.3 多酚含量的測(cè)定

花椒的干燥環(huán)境設(shè)置為50 ℃，干燥后進(jìn)行粉碎，稱取1 g粉碎后的花椒粉末，放入50 mL溶劑中進(jìn)行提取，抽濾并收集提取液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL提取液進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚質(zhì)量濃度，并按照公式(1)計(jì)算多酚收率。

(1)

式中：P為總多酚收率，mg/g；C為多酚的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為花椒提取液的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；W為花椒質(zhì)量，g。

1.2.4 單因子實(shí)驗(yàn)

參照李利華[11]的方法，對(duì)目數(shù)、乙醇濃度、料液比、微波功率和提取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取相同批次的備用花椒粉1.0 g，設(shè)置不同目數(shù)(<40，40～60，60～80，80～100，>100)、提取液乙醇濃度(0%、20%、40%、60%、80%)、不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)、微波功率(136，264，440，616，800 W)、提取時(shí)間(20，40，60，80，100 s)。根據(jù)單因素水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，最終選出3個(gè)最主要的影響因素，通過設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行極差分析后，響應(yīng)值選用多酚含量，選取對(duì)收率影響最大的料液比、乙醇濃度、微波時(shí)間這3個(gè)提取參數(shù)為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)[12]。采用Design Expert 8.05b軟件輔助實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼值見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design experiment

1.2.6 花椒總多酚物質(zhì)抑菌活性的初篩

參考朱奇奇等[13]的平板生長(zhǎng)速率法，并做適當(dāng)修改。通過下式計(jì)算其相對(duì)抑菌率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 目數(shù)對(duì)花椒多酚收率的影響

由圖2可知，花椒多酚的提取量隨著目數(shù)的增加先提高后下降，當(dāng)目數(shù)為80～100目時(shí)，多酚收率達(dá)到最高。

圖2 目數(shù)對(duì)花椒多酚收率的影響Fig.2 The effect of mesh number on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.1.2 乙醇濃度對(duì)花椒多酚收率的影響

由圖3可知，花椒的多酚收率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)有較高的收率65.36 mg/g。這可能是60%乙醇的極性使糖類等水溶性物質(zhì)浸出量不大，且達(dá)到斷裂化學(xué)鍵的濃度。乙醇液價(jià)格低廉、安全性高且有利于清潔生產(chǎn)[14]，所以將乙醇作為提取的溶劑選擇。

圖3 乙醇濃度對(duì)花椒多酚收率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.1.3 料液比對(duì)花椒多酚收率的影響

適當(dāng)?shù)牧弦罕仁沟梦锪吓c溶劑間有好的濃度差，有利于提高多酚的提取速率，能夠降低成本。由圖4可知，花椒的多酚收率隨著溶劑用量的增加先增大后降低，其下降的原因可能是其中的多酚物質(zhì)已經(jīng)大部分溶出，溶劑用量已經(jīng)不會(huì)對(duì)收率有促進(jìn)作用，繼續(xù)增加溶劑用量干擾多酚測(cè)量。

圖4 料液比對(duì)花椒多酚收率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.1.4 微波功率對(duì)花椒多酚收率的影響

微波產(chǎn)生的電磁場(chǎng)加速了被萃取成分由物料內(nèi)部向萃取溶劑界面的擴(kuò)散速率，從而縮短了萃取時(shí)間[15]。由圖5可知，隨著微波功率提高，花椒多酚收率不斷增高，當(dāng)功率達(dá)到600 W之后，多酚收率開始下降，這是由于微波功率過高導(dǎo)致不均勻或急速受熱，使花椒多酚發(fā)生分解，導(dǎo)致收率下降。

圖5 微波功率對(duì)花椒多酚收率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.1.5 微波提取時(shí)間對(duì)花椒多酚收率的影響

不同的提取時(shí)間同樣也影響著多酚收率。由圖6可知，在60 s內(nèi)多酚收率不斷上升，之后開始下降，可能是由于在60 s內(nèi)多酚已經(jīng)提取完成，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶出的多酚物質(zhì)變少。

圖6 微波提取時(shí)間對(duì)花椒多酚收率的影響Fig.6 Effect of microwave extraction time on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum Maxim.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

通過單因素實(shí)驗(yàn)，選取對(duì)多酚收率影響較大的料液比(B)、乙醇濃度(A)、微波提取時(shí)間(C)這3個(gè)因素做Box-Behnken設(shè)計(jì)，并且以花椒多酚收率(R)作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken response surface design and results

利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型方差，見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

經(jīng)過Design Expert回歸擬合分析，得到多酚收率(R)對(duì)乙醇濃度(A)、料液比(B)和微波時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸方程為：R=77.72+0.11A+0.42B+0.67C-4.32AB-2.86AC—5.52BC-5.68A2-6.42B2-4.11C2。

由表3可知，回歸模型P=0.0292<0.05，即具有一定的顯著性。失擬項(xiàng)P=0.9451>0.05，不顯著，說明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合程度很高。R2=0.9179，表明實(shí)際值與采用該方法的預(yù)測(cè)值有著很高的相關(guān)性。說明該方法具有可靠性，選用該方法對(duì)不同條件下的多酚收率進(jìn)行預(yù)測(cè)是有效的。回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，3個(gè)影響因素對(duì)花椒總多酚提取率的影響依次是：C(提取時(shí)間)>B(料液比)>A(乙醇濃度)。因素AB、BC、A2、B2對(duì)花椒總多酚的提取有顯著影響(P<0.05)。

2.3 因子間交互作用分析

由圖7可知，在微波時(shí)間水平為0，即微波時(shí)間為60 s時(shí)，料液比與微波提取時(shí)間對(duì)花椒多酚收率的交互效應(yīng)。響應(yīng)面曲線平滑，即乙醇濃度對(duì)花椒總多酚的提取率影響較小，而料液比的影響則較大，表現(xiàn)為曲線較為陡峭。由等高線圖可知，當(dāng)料液比為1∶40(g/mL)時(shí)，等高線明顯呈橢圓形，說明料液比與乙醇濃度對(duì)花椒總多酚含量的交互效應(yīng)比較顯著。

圖7 料液比和乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction between solid-liquid ratio and ethanol concentration

由圖8可知，在乙醇濃度水平為0，即乙醇濃度為60%時(shí)，料液比與乙醇濃度對(duì)花椒多酚收率的交互影響。由響應(yīng)面圖可知，微波時(shí)間對(duì)花椒總多酚提取影響較大，表現(xiàn)為曲線較陡峭，而料液比影響相對(duì)較小。等高線圖表現(xiàn)為明顯的橢圓形，可以得到總多酚的提取率受料液比和微波時(shí)間交互作用的影響較為顯著。

圖8 料液比和微波時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the interaction between solid-liquid ratio and microwave time

由圖9可知，在料液比水平為0的情況下，即料液比為1∶40時(shí)，乙醇濃度與微波時(shí)間對(duì)花椒多酚收率的交互影響。由響應(yīng)面圖可知，圖像呈現(xiàn)馬鞍形，說明乙醇濃度與微波時(shí)間對(duì)多酚提取的影響較接近。乙醇濃度與微波時(shí)間對(duì)花椒總多酚提取的影響比較，乙醇濃度的影響較為顯著，等高線更接近乙醇濃度。

圖9 乙醇濃度與微波時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of the interaction between ethanol concentration and microwave time

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過實(shí)驗(yàn)輔助軟件Design Expert優(yōu)化提取條件得到理論的最佳提取條件和響應(yīng)值：料液比為1∶ 37.3 (g/mL)，乙醇濃度為67.3%，微波提取時(shí)間為67.3 s，花椒總多酚含量為63.95 mg/g。

模型的驗(yàn)證：綜合考慮和分析實(shí)驗(yàn)的好操作性，以及溶劑濃度高對(duì)多酚測(cè)量帶來的干擾，選取料液比為1∶40(g/mL)，乙醇濃度為60%，微波提取時(shí)間為60 s，微波功率為616 W的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果為63.11 mg/g；通過理論方程計(jì)算花椒總多酚含量為64.27 mg/g，相對(duì)誤差為1.84%，小于10%，證明響應(yīng)面優(yōu)化花椒總多酚提取工藝是可行的，該模型有效。

2.5 花椒總多酚提取物抑菌活性的初篩結(jié)果

將從花椒提取中的總多酚物質(zhì)配制成濃度為100 mg/mL的培養(yǎng)基，按照上述的實(shí)驗(yàn)方法，用花椒提取物對(duì)7種植物病原真菌進(jìn)行抑菌活性的初篩，初篩的結(jié)果見表4。

表4 花椒總多酚提取物對(duì)7種植物病原真菌的抑菌率Table 4 The antibacterial rates of total polyphenol extracts from Zanthoxylum bungeanum Maxim. against seven plant pathogenic fungi

由表4可知，花椒總多酚對(duì)7種植物病原菌抑制率相對(duì)較小，對(duì)番茄灰霉菌的抑菌率相對(duì)較高，達(dá)到73.81%。

2.6 不同濃度花椒總多酚提取物對(duì)番茄灰霉菌的抑菌結(jié)果

表5 不同濃度總多酚對(duì)番茄灰霉素的抑菌率Table 5 The antibacterial rates of total polyphenols with different content against Botrytis cinerea

圖10 不同濃度總多酚對(duì)番茄灰霉菌的抑菌效果Fig.10 The antibacterial effect of total polyphenols with different content against Botrytis cinerea

采用不同濃度的花椒總多酚對(duì)番茄灰霉菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明花椒總多酚濃度與對(duì)番茄灰霉菌的抑菌率呈線性相關(guān)，可以得到線性回歸方程Y=1.1920X+3.2072，相關(guān)系數(shù)r=0.9539，EC50=31.91 mg/L，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，卡方值X2=0.294，其結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

通過Box-Behnken響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)，確定了花椒總多酚提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件：料液比為1∶40 (g/mL)，提取劑乙醇濃度為60%，所用的微波提取時(shí)間為60 s。在該優(yōu)化條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，80～100目花椒粉末，在微波功率為616 W時(shí)提取的多酚含量能夠達(dá)到63.11 mg/g。

通過活性初篩和穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)分析，得出花椒總多酚物質(zhì)對(duì)7種病原真菌的抑制率相對(duì)較小，其中花椒總多酚提取物對(duì)番茄灰霉菌的抑制率最高，為73.81%，達(dá)到50%以上。分析花椒總多酚對(duì)番茄灰霉菌穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到回歸方程是Y=1.1920X+3.2072，相關(guān)系數(shù)為0.9539，EC50=31.91 mg/L，經(jīng)卡方檢驗(yàn)(X2=0.294，df=3，P>0.05)，其結(jié)果可靠。