超聲輔助草酸銨法提取南瓜果膠及其理化性質研究

李曉娟，唐彥武，王珣*，李家磊，趙偉，趙曦，王家有，陸杰，高強

(1.黑龍江省農業科學院生物技術研究所，哈爾濱 150028；2.黑龍江大學 生命科學學院，哈爾濱 150080；3.黑龍江省農業科學院食品加工研究所，哈爾濱 150086；4.黑龍江省農業科學院齊齊哈爾分院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；5.東北農業大學 資源與環境學院，哈爾濱 150030)

南瓜屬葫蘆科南瓜屬[1]。與肉用南瓜不同，籽用南瓜是取食種子的一類南瓜，果肉常被丟棄。中國是籽用南瓜栽植和生產大國，每年南瓜籽產量約占全世界的70%，而由此廢棄的南瓜果肉不僅給環境帶來污染，同時也造成了資源的巨大浪費[2]。籽用南瓜被丟棄的部分富含果膠、蛋白質及礦物質等，頗具開發前景[3]。果膠是一種分子量為20～400 kDa的生物大分子，最早于1824年由法國人Bracennot在胡蘿卜根中發現[4]，由于具有出色的膠凝性和穩定性，常作為一些食物的添加劑，如調味品、飲料、果凍等[5]。雖然有大量研究從柑橘、甜菜、百香果、蘋果、番薯及豆腐柴葉等副產品中取得果膠[6-11]，但隨著果膠在食品領域的需求增加，需要從國外進口。當前，工廠中常采用酸法提取果膠。近年來涌現出大量新方法，如超聲-微波法、離子交換法和酶法等[12-15]。針對工業生產中傳統方法的不足，本文以南瓜廢棄果肉為材料，采用超聲草酸銨協同提取法優化果膠提取工藝，并分析果膠產品的特性，以期為南瓜果膠的工業化生產提供新參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜品種為“金龍瓜1號”，2018年10月采自黑龍江省農業科學院畜牧所園區，采收后運回實驗室當天處理；所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 材料預處理

南瓜→去籽、洗凈、切塊→滅酶→烘干→粉碎→過60目篩→南瓜粉。

1.2.2 南瓜果膠提取的工藝流程

精確稱量南瓜粉適量，按設定比例放入設定濃度的草酸銨[(NH4)2C2O4]溶液，混勻，置于超聲儀中，在設定溫度下提取。將提取液真空濃縮至原來的1/4(V/V)，降至常溫后，加入4倍體積95%乙醇，過濾，收集固形物，冷凍干燥待測。

1.2.3 果膠得率測定[16]

取1 mL不同濃度半乳糖醛酸對照溶液(10，20，30，40，50，60，70，80 μg/mL)，分別加入H2SO46 mL，混勻，90 ℃加熱15 min，降至常溫。加入1.5 mg/mL咔唑無水乙醇0.2 mL，避光反應2 h。以1 mL蒸餾水替代半乳糖醛酸溶液作為陰性對照，按相同顯色步驟操作，檢測530 nm處各溶液吸光度。繪制半乳糖醛酸標準曲線：y=0.006963x+0.003286，R2=0.9983(y為吸光值，x為半乳糖醛酸)。

取經過稀釋的南瓜果膠1 mL，用來替代標準溶液。后續步驟按照標準曲線繪制方法進行。果膠得率按公式(1)計算：

果膠得率/%=(ρ×V×K)/(m×106)×100。

式(1)

式中：ρ為半乳糖醛酸含量(μg/mL)；V為果膠提取液總體積(mL)；K為果膠提取液稀釋倍數；m為南瓜粉質量(g)。

1.2.4 單因素試驗設計1.2.4.1 提取溫度

稱取一定量預處理得到的南瓜粉，加入0.8% (NH4)2C2O4溶液(1∶30，W/V)，混勻后置于超聲儀中，在不同溫度下提取60 min，降至常溫后離心(6000 r/min，15 min)，上清液稀釋后，采用硫酸咔唑法檢測得率，確定最佳提取溫度，溫度設定為40，50，60，70，80 ℃，每個試驗重復3次。

1.2.4.2 提取時間

稱取一定量預處理得到的南瓜粉，加入0.8% (NH4)2C2O4溶液(1∶30，W/V)，混勻后置于超聲儀中，在70 ℃溫度下提取不同時間。降至常溫后離心(6000 r/min，15 min)，上清液稀釋后，采用硫酸咔唑法檢測得率，確定最佳提取溫度，時間設定為40，60，80，100，120 min，每個試驗重復3次。

1.2.4.3 料液比

稱取一定量預處理得到的南瓜粉，加入不同體積0.8% (NH4)2C2O4溶液，混勻后置于超聲儀中，在70 ℃溫度下提取60 min。降至常溫后離心(6000 r/min，15 min)，上清液稀釋后，采用硫酸咔唑法檢測得率，確定最佳料液比，料液比設定1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(W/V)，每個試驗重復3次。

1.2.4.4 草酸銨[(NH4)2C2O4]濃度

稱取一定量預處理得到的南瓜粉，加入不同濃度的(NH4)2C2O4溶液(1∶30，W/V)，混勻后置于超聲儀中，在70 ℃溫度下提取60 min。降至常溫后離心(6000 r/min，15 min)，上清液稀釋后，采用硫酸咔唑法測定，計算果膠得率，確定最佳(NH4)2C2O4濃度，濃度設定為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%，每個試驗重復3次。

1.2.5 正交試驗設計

通過單因素試驗確定各元素取值范圍，設置四因素三水平正交試驗。正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.6 南瓜果膠品質分析

水分含量和pH值的測定分別參照GB 5009.3-2010[17]和QB 2484-2000[18]；總半乳糖醛酸的測定參照國標GB 25533-2010[19]；酯化度的測定參照顧振宇的方法[20]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度

由圖1可知，果膠得率隨著溫度的上升先增多后減少，70 ℃是果膠得率的轉折點，溫度在40～70 ℃之間，果膠得率較低，可能是因為非水溶性果膠轉化為水溶性果膠的速率與溫度呈正相關[21]，故隨溫度上升生成更多可溶性果膠，故果膠得率不斷增加；當溫度大于70 ℃時，部分可溶性果膠分子被毀壞，所以出現得率降低的現象。因而，選擇60～80 ℃作為正交試驗果膠提取溫度的水平范圍。

圖1 提取溫度對果膠得率的作用

2.1.2 提取時間

由圖2可知，40～60 min時果膠得率呈現上升趨勢，60～120 min時果膠得率呈現下降趨勢，這可能是由于非水溶性果膠需要一定時間轉化為水溶性果膠，當轉化過程不徹底時，果膠得率較低。隨著時間的增長，非可溶性果膠不斷轉化為可溶性果膠。但時間過長可引起果膠解脂，得率隨之減少。因而，選擇40～80 min作為正交試驗果膠提取時間的水平范圍。

圖2 提取時間對果膠得率的作用

2.1.3 料液比

由圖3可知，增加料液比中溶劑的比例可使果膠得率上升。料液比大于1∶30，增速放緩。一方面，料液比中溶劑比例增大，降低了提取液的粘性，使得果膠易于溶出；另一方面，當料液比超過1∶30時，增加溶劑雖然不能大幅提升得率，但仍有小幅上升趨勢。綜合考慮，料液比過大，對設備要求較高，耗時耗能，因此增加后續分離工作的難度，因而選擇1∶20～1∶40作為正交試驗果膠料液比的水平范圍。

圖3 料液比對果膠得率的作用

2.1.4 草酸銨[(NH4)2C2O4]濃度

由圖4可知，在濃度為0.2%～0.8%范圍內，果膠得率隨(NH4)2C2O4濃度的增加而增加，當(NH4)2C2O4濃度超過0.8%時，果膠得率開始減少。這可能是由于(NH4)2C2O4濃度較小時，果膠酸鈣轉化不完全，從而導致果膠提取不完全。而(NH4)2C2O4濃度過大時，水解程度往往超過預期而產生脫脂裂解現象，表現為得率減少[22]，因此選擇(NH4)2C2O4濃度為0.8%。

圖4 (NH4)2C2O4濃度對果膠得率的作用

2.2 正交試驗結果

單因素試驗結果確定了各因素的水平，為獲得最佳參數，進行四因素三水平正交試驗，結果見表2和表3，3次試驗結果取平均值。

表2 正交試驗直觀分析表Table 2 The orthogonal test analysis table

表3 正交試驗方差分析表Table 3 The variance analysis table of orthogonal test

極差(R)反映了各因子對果膠得率影響的顯著性，由表2可知，對南瓜果膠的得率影響從大到小依次為A>D>C>B。由均值(K)結果可知南瓜果膠提取的最佳工藝組合為A3B2C2D2。

由表3可知，方差分析結果與直觀分析結果一致，其中提取溫度對果膠得率的影響最顯著。因此，提取溫度80 ℃、提取時間60 min、料液比1∶30、(NH4)2C2O4濃度0.8%是南瓜果膠提取的最優工藝。

2.3 驗證試驗

根據正交試驗所得最優提取工藝條件，采用超聲輔助草酸銨法提取南瓜果膠3次，結果見表4。

表4 驗證試驗結果Table 4 The results of verification test

由表4可知，驗證試驗得到的南瓜果膠得率最終為6.09%，表明超聲輔助草酸銨法優化出的南瓜果膠提取參數可行。

2.4 南瓜果膠的理化指標測定

果膠產品質量評價一般參照QB 2484-2000和FCC標準。本試驗對超聲輔助草酸銨法提取果膠樣品的pH值、溶解度、干燥減量、半乳糖醛酸和酯化度進行測定，測定結果與QB 2484-2000和FCC標準進行比較。

由表5可知，果膠的pH滿足QB 2484-2000和FCC標準的要求。人體對果膠的利用程度與溶解度有關，南瓜果膠的溶解度較好。干燥減量可以反映出果膠水分含量，含水量低的果膠的品質較好，南瓜果膠的干燥減量滿足QB 2484-2000和FCC標準的要求。果膠有高酯果膠和低酯果膠之分，酯化度大于50%的為高酯果膠，否則為低酯果膠。經測定，酯化度為75.23%，說明南瓜果膠屬高酯果膠范疇。

表5 產品質量分析結果Table 5 The analysis results of product quality

3 結論

采用超聲聯合草酸銨法提取南瓜果膠，單因素試驗說明不同提取溫度、提取時間、料液比和(NH4)2C2O4濃度的果膠得率都呈現先上升后下降的趨勢，極差分析結果表明提取溫度對南瓜果膠得率的影響最顯著，正交試驗結果表明，提取溫度80 ℃、提取時間60 min、料液比1∶30、(NH4)2C2O4濃度0.8%時，果膠得率可達6.09%。采用超聲輔助草酸銨法最佳工藝條件提取南瓜果膠，符合QB 2484-2000和FCC標準。從環保、果膠品質等角度考慮，超聲輔助草酸銨法可用于果膠的工業化生產。