不同米曲霉對(duì)醬油低鹽固態(tài)發(fā)酵的影響

石磊，劉蕊，藤薇，侯麗華*

(1.天津利民調(diào)料有限公司，天津 300308；2.天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

醬油在我國(guó)傳承發(fā)展千年，由豆醬逐漸演變成人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾囊簯B(tài)調(diào)味品。通過(guò)微生物的作用對(duì)蛋白質(zhì)原料與淀粉類原料進(jìn)行分解，再經(jīng)復(fù)雜的生化反應(yīng)從而形成營(yíng)養(yǎng)豐富、鮮香味美的醬油。現(xiàn)今醬油的種類眾多，發(fā)酵工藝也不斷改良創(chuàng)新。但低鹽固態(tài)發(fā)酵法作為我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，具有生產(chǎn)周期短、簡(jiǎn)單高效、成本低的特點(diǎn)[1]，因此低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油仍占據(jù)不可取代的市場(chǎng)地位，并且這種價(jià)格低廉的中低檔醬油也符合低鹽健康飲食的理念。

制曲是醬油釀造的首要環(huán)節(jié)。生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)成曲一方面可以從優(yōu)化工藝參數(shù)方面入手[2-3]，另一方面則涉及到發(fā)酵菌種的選擇運(yùn)用。米曲霉在制曲過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，它分泌產(chǎn)生的各種酶，為醬油發(fā)酵的原料分解、物質(zhì)的轉(zhuǎn)化合成奠定了基礎(chǔ)[4]。因此，選擇適宜于發(fā)酵工藝的優(yōu)良米曲霉制曲是保證醬油質(zhì)量的關(guān)鍵。米曲霉滬釀3.042具有生長(zhǎng)快、分泌的酶系足夠豐富、不產(chǎn)毒素等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)醬油行業(yè)中一直被普遍使用[5]。近年來(lái)，研究者們以米曲霉滬釀3.042作為出發(fā)菌株進(jìn)行了菌種改造，得到米曲霉A100-8、米曲霉3.042-3、米曲霉3.042-3-c和米曲霉3.042-3-cd等。本文首次將以上米曲霉分別制曲，通過(guò)測(cè)定種曲孢子數(shù)和大曲酶活力，從中選取優(yōu)勢(shì)米曲霉進(jìn)行低鹽固態(tài)發(fā)酵的對(duì)比研究，探究其對(duì)醬油品質(zhì)的影響，為改造構(gòu)建的優(yōu)良米曲霉在醬油低鹽固態(tài)發(fā)酵中的實(shí)際應(yīng)用提供了一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

原料：麩皮、豆粕；菌種：米曲霉為本實(shí)驗(yàn)室保藏，見表1。

表1 本研究使用的5種米曲霉Table 1 The five kinds of A. oryzae used in this study

1.2 主要儀器設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器 日本雅馬拓科技有限公司；Multiskan GO酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 上海百典儀器設(shè)備有限公司；QP-2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制曲與發(fā)酵工藝

制曲與發(fā)酵步驟見圖1。

圖1 制曲與發(fā)酵的具體步驟Fig.1 The specific steps of koji making and fermentation

1.3.2 種曲孢子數(shù)的測(cè)定

按照SB/T 10315-1999規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 大曲酶活力的測(cè)定

酸性、中性、堿性3種蛋白酶活力按照SB/T 10317-1999的方法測(cè)定。1個(gè)蛋白酶活力單位定義為在40 ℃條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量。糖化酶活力[8]、纖維素酶活力[9]、果膠酶活力[10]的測(cè)定均采用DNS顯色法。1個(gè)糖化酶活力單位定義為在40 ℃、pH 4.6下每小時(shí)水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需的酶量。1個(gè)纖維素酶活力單位定義為在40 ℃、pH 4.8下每小時(shí)水解CMC產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量。1個(gè)果膠酶活力單位定義為在45 ℃、pH 4.4下每分鐘水解果膠質(zhì)產(chǎn)生1 μg D-半乳糖醛酸所需的酶量。

1.3.4 發(fā)酵過(guò)程中霉菌數(shù)的測(cè)定

將醬醪取出，用無(wú)菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品稀釋液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 醬油各項(xiàng)理化指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，將醬醪稱重，加入1倍80 ℃左右的蒸餾水充分混合浸泡后，使其自然沉降，再用離心機(jī)在8000 r/min離心10 min，過(guò)濾去除殘?jiān)蟮玫降尼u油用于測(cè)定各項(xiàng)理化指標(biāo)。還原糖含量采取DNS顯色法測(cè)定[11]。全氮和可溶性無(wú)鹽固形物的含量按照國(guó)標(biāo)GB 18186-2000規(guī)定的方法測(cè)定。氨基酸態(tài)氮與總酸含量按照國(guó)標(biāo)GB 5009.235-2016規(guī)定的方法測(cè)定。

1.3.6 醬油顏色指數(shù)的測(cè)定

將10倍稀釋的醬油液在不同波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，以蒸餾水作空白對(duì)照，計(jì)算紅色指數(shù)、黃色指數(shù)和色深物質(zhì)[12]。

1.3.7 醬油風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)

采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(SPME-GC-MS)的方法檢測(cè)[13]。

風(fēng)味物質(zhì)的鑒定：手動(dòng)積峰，對(duì)照質(zhì)譜儀記錄的質(zhì)譜圖與檢索數(shù)據(jù)庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，篩選相似度在80%以上的物質(zhì)，定性分析，并以面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 種曲孢子數(shù)的跟蹤測(cè)定

由圖2可知，5種米曲霉的種曲孢子數(shù)在第24～48 h期間增長(zhǎng)緩慢，第48 h后，出現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在第72 h種曲孢子數(shù)均達(dá)到最大值，并且滿足工業(yè)生產(chǎn)對(duì)種曲孢子數(shù)的要求(5×109個(gè)/g)。整體而言，多核米曲霉的種曲孢子數(shù)>單核米曲霉，即米曲霉滬釀3.042>米曲霉3.042-3；米曲霉3.042-3-cd>米曲霉3.042-3-c。在第72 h種曲收曲時(shí)，5種米曲霉的種曲孢子數(shù)從大到小依次為：米曲霉3.042-3-cd(7.50×109個(gè)/g)>米曲霉滬釀3.042(7.40×109個(gè)/g)>米曲霉3.042-3-c(7.29×109個(gè)/g)>米曲霉A100-8(7.15×109個(gè)/g)>米曲霉3.042-3(6.88×109個(gè)/g)。

圖2 米曲霉種曲孢子數(shù)增長(zhǎng)情況的比較Fig.2 The comparison of the number of spores of Aspergillus oryzae

2.2 大曲酶活力的測(cè)定

在大曲階段的第36 h、第40 h和第44 h測(cè)定5種米曲霉的6種酶活力，綜合比較5種米曲霉的產(chǎn)酶情況，為醬油發(fā)酵奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.2.1 蛋白酶活力

米曲霉具有分泌蛋白酶的強(qiáng)大能力。蛋白酶分解高溫蒸煮變性的蛋白質(zhì)原料，對(duì)醬油氨基酸、多肽、風(fēng)味前體物質(zhì)的產(chǎn)生具有重要作用。本試驗(yàn)對(duì)酸性、中性、堿性3種蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果見圖3～圖5。

圖3 大曲階段酸性蛋白酶活力的變化Fig.3 The changes of acid protease activity during Daqu stage

圖4 大曲階段中性蛋白酶活力的變化Fig.4 The changes of neutral protease activity during Daqu stage

圖5 大曲階段堿性蛋白酶活力的變化Fig.5 The changes of alkaline protease activity during Daqu stage

由圖3可知，除米曲霉3.042-3-cd的酸性蛋白酶活力在第44 h出現(xiàn)小幅下降以外，其他4株米曲霉的酸性蛋白酶活力在第36～44 h均逐漸緩慢升高，第44 h酸性蛋白酶活力達(dá)到最高。其中米曲霉A100-8的酸性蛋白酶活力在測(cè)定的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于其他菌株。米曲霉A100-8是經(jīng)誘變選育出的一株高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，說(shuō)明其高產(chǎn)酸性蛋白酶的特性可以穩(wěn)定遺傳。但總體來(lái)看，大曲階段各時(shí)間點(diǎn)的酸性蛋白酶活力均較低，米曲霉A100-8酸性蛋白酶活力在第44 h時(shí)最大值僅達(dá)到496.96 U/g，一方面可能與大曲中的pH環(huán)境有關(guān)，另一方面可能與所用原料有關(guān)，豆粕和麩皮與大豆和小麥混合原料制曲相比空隙小，空氣穿透性較差，不利于曲霉生長(zhǎng)產(chǎn)酶分解原料[14]。

由圖4可知，在大曲階段，中性蛋白酶活力遠(yuǎn)高于酸性蛋白酶，這也與研究乳酸菌與米曲霉共制曲時(shí)測(cè)定的酶活結(jié)果一致[15]。5株米曲霉的中性蛋白酶活力在制曲第36～44 h期間呈緩慢升高的趨勢(shì)，在第44 h時(shí)均達(dá)到酶活力的最大值。米曲霉3.042-3-cd的中性蛋白酶活力在第44 h增加最多，并超越了其他米曲霉，達(dá)到1676.87 U/g。其他米曲霉的中性蛋白酶活力在第44 h差異不大，均在1450 U/g左右。

由圖5可知，5株米曲霉的堿性蛋白酶活力變化不同。米曲霉滬釀3.042、米曲霉3.042-3、米曲霉3.042-3-c和米曲霉3.042-3-cd的堿性蛋白酶活力在制曲第36～44 h呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。而米曲霉A100-8的堿性蛋白酶活力幾乎維持在穩(wěn)定的水平。但總體來(lái)看，每種米曲霉的堿性蛋白酶活力自身變化幅度不大，并且在第36 h、第40 h與第44 h均達(dá)到1000 U/g以上，其中米曲霉3.042-3堿性蛋白酶的活力最高，米曲霉A100-8酶活力次之。

2.2.2 糖化酶活力

糖化酶同樣是醬油發(fā)酵中起到關(guān)鍵作用的酶系之一。淀粉質(zhì)原料通過(guò)淀粉酶的作用，形成小分子糖類物質(zhì)等成分，有利于提高醬油的口感，也為糖酵解途徑提供了基礎(chǔ)，從而增加了成品醬油中芳香物質(zhì)的含量。

由圖6可知，5株米曲霉的糖化酶活力在第36～40 h呈逐漸上升的趨勢(shì)，第44 h時(shí)米曲霉3.042-3-cd與米曲霉A100-8的糖化酶活力出現(xiàn)小幅度下降。但米曲霉A100-8始終具有最高的糖化酶活力，第40 h達(dá)到最大值3324.10 U/g，第44 h雖然酶活力下降，但仍達(dá)到3056.85 U/g，因此米曲霉A100-8在分解淀粉質(zhì)原料上具有優(yōu)勢(shì)。與其余4株米曲霉相比，米曲霉3.042-3-cd具有較高的糖化酶活力。

圖6 大曲階段糖化酶活力的變化Fig.6 The changes of glucoamylase activity during Daqu stage

2.2.3 纖維素酶活力與果膠酶活力

纖維素酶和果膠酶的存在使原料充分分解，提高了原料的利用率。但是米曲霉分泌過(guò)多的纖維素酶和果膠酶會(huì)影響淋油工藝，造成醬油無(wú)鹽固形物含量降低等不利影響。

由圖7可知，在制曲第36～40 h，5株米曲霉的纖維素酶活力呈下降趨勢(shì)。但在第44 h，纖維素酶活力出現(xiàn)回升。整個(gè)制曲期間，米曲霉滬釀3.042保持最高的酶活力，而米曲霉3.042-3-c的酶活力遠(yuǎn)低于米曲霉滬釀3.042，第40 h為106.10 U/g，第44 h為205.74 U/g。其次酶活較低的為米曲霉3.042-3-cd，這說(shuō)明整合到米曲霉的CreA基因及cis-acting順式作用元件仍穩(wěn)定地發(fā)揮作用。

圖7 大曲階段纖維素酶活力的變化Fig.7 The changes of cellulase activity during Daqu stage

由圖8可知，5株米曲霉的果膠酶活力均呈先下降后上升的趨勢(shì)。米曲霉滬釀3.042的果膠酶活力最高。米曲霉3.042-3-cd的果膠酶活力雖在第36 h出現(xiàn)最大值372.44 U/g，但后期出現(xiàn)大幅度降低。第44 h時(shí)，米曲霉3.042-3-c的果膠酶活力最低，為220.91 U/g，其次是米曲霉3.042-3-cd，為274.77 U/g。

圖8 大曲階段果膠酶活力的變化Fig.8 The changes of pectinase activity during Daqu stage

綜上所述，通過(guò)酶活力的測(cè)定，確定第44 h收曲，此時(shí)各種酶活力旺盛。在5種米曲霉中，米曲霉A100-8在分泌酸性蛋白酶活力和糖化酶活力上具有明顯優(yōu)勢(shì)，米曲霉3.042-3-cd種曲孢子數(shù)多，其表達(dá)出的纖維素酶活力與果膠酶活力降低的性狀能夠穩(wěn)定遺傳并且在第44 h收曲時(shí)中性蛋白酶最高。所以，選擇米曲霉A100-8與米曲霉3.042-3-cd分別制曲，進(jìn)行低鹽固態(tài)發(fā)酵。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中霉菌數(shù)的變化

發(fā)酵過(guò)程中，每隔8 d取樣，記錄醬醪中霉菌數(shù)的變化情況。

由圖9可知，霉菌數(shù)隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。第8 天時(shí)，霉菌數(shù)已降到約為4.5 log CFU/g。第32 天發(fā)酵結(jié)束，霉菌數(shù)約為1.5 log CFU/g。這說(shuō)明在醬油鹽水發(fā)酵階段，高溫環(huán)境嚴(yán)重限制了米曲霉的生長(zhǎng)。對(duì)比兩種米曲霉制曲發(fā)酵，米曲霉3.042-3-cd比米曲霉A100-8霉菌數(shù)略高。

圖9 發(fā)酵期間霉菌數(shù)的變化Fig.9 The changes of mold count during fermentation

2.4 醬油理化指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)最終醬油進(jìn)行了理化指標(biāo)的對(duì)比分析，結(jié)果見表2。

表2 醬油各項(xiàng)理化指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of physicochemical indexes of soy sauce

氨基酸態(tài)氮、全氮與可溶性無(wú)鹽固形物是評(píng)價(jià)醬油等級(jí)的重要指標(biāo)。還原糖促進(jìn)了醬油色澤與風(fēng)味的形成[16]。發(fā)酵過(guò)程中pH降低，微生物發(fā)酵產(chǎn)酸等導(dǎo)致總酸的積累。由于米曲霉A100-8具有較高的酸性蛋白酶活力與糖化酶活力，使得米曲霉A100-8制曲的發(fā)酵醬油在氨基酸態(tài)氮、全氮、還原糖及無(wú)鹽固形物含量上高于米曲霉3.042-3-cd，尤其是還原糖明顯增加，而米曲霉3.042-3-cd制曲的發(fā)酵醬油總酸含量高。

2.5 發(fā)酵結(jié)束后顏色指數(shù)的測(cè)定

紅色指數(shù)、黃色指數(shù)及色深物質(zhì)可以一定程度反映醬油的呈色情況，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 醬油顏色指數(shù)的對(duì)比Table 3 Comparison of color indexes of soy sauce

一般紅色指數(shù)超過(guò)3.0表明醬油紅色比較顯著。黃色指數(shù)與紅色指數(shù)成正相關(guān)，黃色指數(shù)較高，炒菜上色不發(fā)烏[17]。由表3可知，紅色指數(shù)和黃色指數(shù)較高的為米曲霉A100-8發(fā)酵醬油。色深物質(zhì)則相反，指數(shù)較高的為米曲霉3.042-3-cd發(fā)酵醬油。

2.6 醬油風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)

通過(guò)GC-MS對(duì)兩組醬油進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)，各類風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量見圖10。

圖10 醬油各類風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量Fig.10 The relative content of flavor compounds in soy sauce

由圖10可知，本試驗(yàn)低鹽固態(tài)發(fā)酵中醛類、醇類、酸類、酚類占比大，總相對(duì)含量達(dá)到90%左右，剩余10%的風(fēng)味物質(zhì)為酮類、酯類與其他類。米曲霉3.042-3-cd發(fā)酵醬油在酸類、醇類、酚類和其他類物質(zhì)的相對(duì)含量高于米曲霉A100-8，而米曲霉A100-8發(fā)酵醬油在醛類與酯類風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量上相比于米曲霉3.042-3-cd都有微弱的提升，具體風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量及檢測(cè)的種類個(gè)數(shù)見表4。

表4 醬油風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量及個(gè)數(shù)Table 4 The number and relative content of flavor compounds in soy sauce

續(xù) 表

由表4可知，米曲霉A100-8發(fā)酵醬油中檢測(cè)到風(fēng)味物質(zhì)的種類較多，總計(jì)達(dá)到52種。米曲霉3.042-3-cd為46種。兩組醬油均是醛類檢測(cè)到的種類最多，主要以苯甲醛、苯乙醛、異戊醛為主，具有杏仁、焦糖味的苯甲醛和苯乙醛是許多食品中的芳香活性化合物，而異戊醛具有果味和麥芽味。酸類中主要以乙酸為主，醇類中占比較大的依次是異戊醇、苯乙醇、1-辛烯-3-醇。在酚類物質(zhì)的檢測(cè)中，愈創(chuàng)木酚的相對(duì)含量最高。另外，3.042-3-cd制曲發(fā)酵檢測(cè)到微量的4-乙基-2-甲氧基苯酚(4-EG)成分。4-EG這種呈香物質(zhì)的產(chǎn)生被認(rèn)為與木質(zhì)素的代謝有關(guān)，可以增加醬油的煙熏味。酯類、酮類和其他類(呋喃吡嗪類)也是醬油風(fēng)味的重要組成部分，尤其是酯類具有強(qiáng)揮發(fā)性，使醬油的香氣更協(xié)調(diào)。但總體而言，兩組醬油酯類的相對(duì)含量較少，另外，與市售的低鹽固態(tài)醬油相比，醇類的相對(duì)含量較少[18]，這可能與本試驗(yàn)的低鹽固態(tài)工藝特點(diǎn)有很大關(guān)系，需要進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)滬釀3.042、3.042-3、3.042-3-c、3.042-3-cd和A100-8 5株米曲霉種曲孢子數(shù)與大曲酶活力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)米曲霉A100-8在第44 h收曲時(shí)具有最高的酸性蛋白酶活力(496.96 U/g)與糖化酶活力(3056.85 U/g)。米曲霉3.042-3-cd種曲孢子數(shù)最大(7.50×109個(gè)/g)，生長(zhǎng)快并且纖維素酶與果膠酶活力降低的性狀能得到穩(wěn)定遺傳。在低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝中，運(yùn)用米曲霉A100-8與米曲霉3.042-3-cd制曲發(fā)酵的醬油在理化指標(biāo)上均為同一等級(jí)水平。米曲霉A100-8發(fā)酵醬油的顏色指數(shù)較高，風(fēng)味物質(zhì)種類更豐富。而米曲霉3.042-3-cd在酸類和醇類物質(zhì)的相對(duì)含量上高于米曲霉A100-8。在實(shí)際生產(chǎn)中，可根據(jù)需要選擇適宜的米曲霉來(lái)提升低鹽固態(tài)醬油的品質(zhì)。