無花果沙棘復合果醋發酵工藝優化

胡艦，朱正潔,，梁瀟瀅，王榮蘭，朱云龍*

(1.揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225127；2.江蘇恒順醋業股份有限公司，江蘇 鎮江 212100)

無花果(FicuscaricaL.)，薔薇目、桑科、榕屬的多年生木本開花植物，花隱于囊狀總花托內，外觀見果不見花，故名為無花果[1]。果皮薄且無核，食用方便，質感松軟，味濃香甜，氨基酸含量最高可達400 mg/100 g，富含多酚、維生素C、多糖、補骨脂素等活性成分和多種礦物質元素，兼具極高的營養和藥用價值[2]。沙棘(HippophaerhamnoidesL.)，歸屬為胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木[3]，收錄于國家衛健委公布的2019版最新藥食同源目錄。作為藥食兩用的原料，沙棘富含多種維生素、微量元素、不飽和脂肪酸以及人體所需的8種必需氨基酸，特別是維生素C的含量極高，是蘋果的數百倍，橘子的35倍，而且沙棘果實中的維生素C穩定性極強[4]。此外，沙棘果實中還含有大量的黃酮類化合物、超氧化物歧化酶(SOD)、酚類活性成分等生物活性物質，其藥用功效主要有延緩衰老、抵抗輻射、抑制血小板粘附、預防腫瘤、增強免疫力等，對心血管疾病也有良好的抵御效果[5]，是優質的保健食品原料，市場前景廣闊。

目前關于無花果和沙棘衍生食用產品的研究已有不少，但尚未見將二者結合生產復配產品的相關報道[6]。

本文以新鮮無花果、沙棘果為原料，在單因素實驗的基礎上結合響應面實驗設計，旨在探究優化無花果沙棘復合果醋的最佳發酵工藝，生產一種新型的健康營養果醋，為無花果、沙棘資源的綜合利用提供科學依據的同時，也為調味品市場產品種類的拓展提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無花果干：常熟神農果業有限公司；呂梁野生沙棘果：文水縣萬家富貢梨專業合作社；高活性釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；活性醋酸菌種：濟寧玉園生物科技有限公司；果膠酶(食品級)：蘇州久瑞生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸(以上3種試劑純度標準為分析純)：鄭州秋雨化工有限公司；蒸餾水：實驗室自制去離子水。

1.2 儀器與設備

TM-767多功能食品料理機 中山市帥龍電器有限公司；SPX-70B生化培養箱 上海康路儀器設備有限公司；RHZ-Q全溫空氣恒溫振蕩搖床 金壇區水北科普實驗儀器廠；TD5A-WS臺式離心機 南京曉儀儀器設備有限公司；HH-2恒溫數顯水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司；SNH-CSJ實驗室超純水機 山東聚創環保有限公司；PHSJ-3F臺式數顯pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；BSA224S賽多利斯電子分析天平 深圳市林濤儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點1.3.2.1 原料預處理

實驗選用新鮮成熟的無花果、沙棘果，此時果實中的含糖量和果酸含量均較高，便于微生物生長發酵。分別將鮮果洗凈后置于食品料理機中破碎成無花果汁、沙棘汁備用。

1.3.2.2 果膠酶酶解

分別在無花果汁、沙棘汁中加入質量分數為0.2%的果膠酶，置于水浴鍋中50 ℃酶解30 min，原因是應用果膠酶酶解破碎果實，不僅可有效加速果汁過濾，促進澄清，還有利于酒精發酵[7]。

1.3.2.3 離心過濾

將酶解后的無花果汁、沙棘果汁分別置于離心機中，設置條件為轉數5000 r/min，時間40 min。目的是去除果汁中的雜質和浮油，再分別用4層紗布過濾，然后按照實驗所需比例將二者混合備用。

1.3.2.4 菌種活化

按照1 g蔗糖，20 mL蒸餾水的比例配制糖液，然后加入2 g釀酒酵母在40 ℃培養箱中活化1 h，注意菌種不得出現包心結塊的現象。

1.3.2.5 酒精發酵

在無菌條件下，將經活化后的釀酒酵母接種至復合果汁中，添加量為0.2%，攪拌均勻，密封，置于30 ℃的恒溫培養箱中培養4～6 d制備無花果沙棘復合沙棘果酒，至酒精度不再上升即可停止發酵，其初始酒精度可用酒精計測量，初始pH值用pH計測量。

1.3.2.6 醋酸發酵

利用無水乙醇NaOH(或者HCl)溶液，按照實驗要求對復合果酒的酒精度與pH進行適當的調節，在無菌條件下，取制備好的復合果酒每100 mL于一支250 mL三角瓶中，接入適量醋酸菌種，置于搖床上設置轉速為130 r/min，固定溫度30 ℃進行醋酸發酵，至酸度不再上升時即可終止發酵。

1.3.2.7 過濾滅菌

將經醋酸發酵的復合果醋用4層紗布過濾，所得原漿醋在水浴鍋中進行巴氏滅菌，滅菌條件設置為68 ℃、20 min，經熱灌裝即可得復合果醋成品。

1.3.3 無花果、沙棘最佳比例的確定

參照釀造食醋的相關國家標準[8]設計感官評價表，主要從外觀、滋味和氣味、組織狀態以及雜質這4個方面對復合果醋產品進行評價。設置無花果、沙棘復配的比例為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1(V/V)。

1.3.4 發酵工藝的確定1.3.4.1 單因素實驗

每次實驗以1000 g無花果沙棘復合果汁為基礎，以復合果醋產品總酸度含量(g/dL)為評價指標，探究醋酸菌接種量、初始沙棘果酒酒精度、初始沙棘果酒pH值和醋酸發酵搖床轉數對沙棘果醋發酵的影響。設置4個因素的梯度為：醋酸菌接種量(4%、5%、6%、7%、8%)、初始酒精度(6%、8%、10%、12%、14%)、初始pH值(2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)、搖床轉數(100，110，120，130，140 r/min)。單因素實驗采用控制變量法，固定參數為：醋酸菌接種量5%、初始酒精度8%、初始pH值3.5、搖床轉數120 r/min。

1.3.4.2 響應面設計

為確定無花果沙棘復合果醋發酵工藝的最優參數，經單因素實驗得出醋酸菌接種量、復合果酒初始酒精度和初始pH值這3個因素對復合果醋發酵工藝較為顯著，故以這3個因素為考察變量，以復合果醋產品總酸含量(Y)為考察指標，進行響應面設計，具體設計水平見表1。

表1 復合果醋發酵工藝響應面設計表Table 1 The response surface design of fermentation technology of compound fruit vinegar

1.4 測定方法與數據處理

產品總酸含量的測定采用酸堿中和法[9]。所有實驗進行3次平行實驗測定記錄平均值，統計學分析采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件，單因素制圖采用Origin 7.5，響應面模型擬合采用Design-Expert 8.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 無花果、沙棘最佳比例的確定

按實驗要求對不同比例的無花果、沙棘汁在固定的發酵條件下制作而成的復合果醋產品進行感官評價，結果見表2。

表2 無花果、沙棘最佳配比的感官評價表Table 2 The sensory evaluation of the best ratio of fig and sea-buckthorn

由表2可知，不同的無花果、沙棘汁配比所制作的復合果醋感官品質不同，當無花果與沙棘復配比例為1∶3(V/V)時，復合果醋產品的感官品質在外觀、滋味和氣味、組織狀態等方面均為最佳狀態，故確定無花果、沙棘的最佳比例為1∶3(V/V)。

2.2 發酵工藝單因素實驗

2.2.1 醋酸菌接種量對復合果醋總酸含量的影響

陳曦等[10]的研究表明，發酵最終產物的總酸含量受發酵時間的影響，而發酵時間又直接受菌株接種量的影響。

由圖1可知，在其他3個因素一定的情況下，復合果醋產品的總酸含量在醋酸菌接種量為4%～6%的范圍內時，呈逐漸升高的趨勢，而當醋酸菌接種量大于6%后趨于穩定。醋酸菌接種量太小時，復合果醋的發酵時間受限，導致發酵不完全，產生的乙酸量低，但是超過一定范圍后，菌體細胞的生長繁殖會消耗沙棘果中的營養物質，另外一方面，從實際生產成本的角度考慮，也應要求接種量要盡可能小。所以，選擇醋酸菌接種量6%為下一步響應面實驗的中心點。

圖1 醋酸菌接種量對復合果醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.2 初始酒精度對復合醋總酸含量的影響

由圖2可知，在其他3個因素一定的情況下，不同的初始酒精度對復合果醋產品的總酸含量影響較大，初始酒精度在4%～12%的范圍內時，復合果醋產品的總酸含量呈現先升高后逐漸下降的趨勢。因為在乙醇含量較低時，醋酸菌作用對象有限且生長繁殖較慢，產酸量偏低，隨著初始酒精度由4%逐漸升高至8%，沙棘果醋的總酸含量迅速增加；而酒精度一旦超過醋酸菌的可耐受范圍，又會直接對醋酸菌的生長代謝產生抑制作用[11]。此外，多余的乙醇還會與乙酸發生酯化反應。因此，選擇初始酒精度8%為下一步響應面實驗的中心點。

圖2 初始酒精度對復合果醋總酸含量的影響Fig.2 Effect of initial alcohol content on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.3 初始pH值對復合醋總酸含量的影響

不同菌種對pH的最適要求和耐受范圍均不同，只有選擇最適的pH值才有利于菌的生長及產物的生產，以此提高生產效率[12]。

由圖3可知，在其他3個因素一定的情況下，當初始pH值在2.5～4.5范圍內變化時，復合果醋產品的總酸含量呈現先升高后下降的趨勢，當pH值為3.5時，總酸含量達到最高為，6.5 g/dL。所以，綜合認為pH為3.5時，最適宜進行復合果醋的醋酸發酵，故而確定響應面實驗設計中該因素值3個水平為3.0，3.5，4.0。

圖3 初始pH對復合果醋總酸含量的影響Fig.3 Effect of initial pH value on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.4 搖床轉速對沙棘醋總酸含量的影響

相關研究顯示：搖床轉速越高，發酵液中溶解的氧氣含量越高，二者呈現正相關關系，而醋酸菌屬于好氧型微生物，發酵環境中的氧氣含量直接影響醋酸菌的生長代謝和發酵效率[13]。

由圖4可知，在其他3個因素一定的情況下，復合果醋產品的總酸含量隨搖床轉速的增加呈先逐漸升高后略有下降最后趨于平穩的趨勢，其原因可能是轉速太高，使得醋酸發酵過于劇烈，反而不穩定，也難以操控。與圖1～圖3對比可知，產品總酸含量隨搖床轉速的變化而變化的幅度最小，可認為其影響不如其他3個因素顯著，所以不將其列入下一步的響應面，綜合分析，確定復合果醋發酵的最適搖床轉速為130 r/min。

圖4 搖床轉速對復合果醋總酸含量的影響Fig.4 Effect of shaking speed on total acid content of compound fruit vinegar

2.3 發酵工藝的響應面擬合

2.3.1 響應面設計與結果

由2.2部分的實驗結果可知，搖床轉速對復合果醋總酸含量影響的極差最小，僅為R(搖床轉速)=1.9，由此可以說明搖床轉速對最終產品總酸含量的影響較其他3個因素稍弱。所以選擇醋酸菌接種量(A)、初始酒精度(B)和初始pH值(C)這3個因素為自變量，以復合果醋產品的總酸含量(Y)為優化實驗響應值，采用Box-Behnken中心組合實驗設計3因素3水平的實驗，以此優化復合果醋發酵工藝參數，結果見表3。

表3 Box-Behnken實驗設計及結果Table 3 Box-Behnken experiment design and results

續 表

2.3.2 模型建立與方差分析

對Box-Behnken實驗設計組配的17組數據進行響應面擬合和統計學分析，可得復合果醋產品總酸含量關于所選3個因素的擬合回歸方程：

Y(總酸含量)=7.03-0.3A+0.15B+0.096C-0.17AB-0.03AC+0.028BC-0.73A2-0.65B2-0.39C2。

利用軟件對所得的復合果醋總酸含量擬合模型進行方差分析，具體結果見表4。

表4 復合果醋總酸含量方差分析Table 4 The variance analysis of total acid content of compound fruit vinegar

由表4可知，所構建的模型p<0.0001，表明模型極顯著，而失擬項p=0.2856，>0.05，說明失擬項不顯著(p>0.05)，模型擬合程度良好，該回歸方程可用于描述醋酸菌接種量(A)、初始酒精度(B)、初始pH值(C)和復合果醋產品總酸含量的關系。方差分析結果顯示R2=0.9830，RAdj2=0.9611，二者接近，說明預測值與真實值相關性很高[14]。比較F值大小可得，3個因素中，對沙棘果醋發酵工藝影響的程度依次為A>B>C，其中一次項A和二次項A2、B2、C2極顯著(p<0.01)，顯著(p<0.05)的項有一次項B和交互項AB，而不顯著(p>0.05)的項是一次項C和交互項AC、BC。需要注意的是，3個因素中雖C項不顯著，但是其p值為0.065，十分接近顯著水平，這可能與實驗次數和精度有關，日后工業生產中需要重新考量。

2.3.3 響應面及等高線分析

Box-Behnken響應面優化法目前已較多地運用于生物培養基優化、藥劑制備以及食品加工優化中。3D響應曲面直接顯示出了所研究的3個因素對果醋產品發酵工藝的影響趨勢，平面等高線圖中線與線之間的疏密度則表現了兩個不同因素交互對果醋發酵工藝的影響程度，3D曲面圖坡度越陡，等高線呈橢圓形且越密集，說明該項對果醋發酵工藝的影響越大[15]。各因素間的交互對果醋發酵工藝的影響見圖5。

圖5中(a)的響應面坡度最陡峭，等高線呈橢圓形而且較為密集，說明醋酸菌接種量、初始酒精度二者的交互對復合果醋發酵工藝的影響最顯著，這與表4中pAB<0.05的結論一致。圖5中(b)和圖5中(c)的3D響應面圖均較為平緩，等高線呈圓形而非橢圓形，說明當初始酒精度一定時，醋酸菌接種量和初始pH值的交互作用對果醋發酵工藝的影響較小；當醋酸菌接種量一定時，初始酒精度和初始pH值的交互作用對果醋發酵工藝的影響也較小，與表4所列回歸分析的結果相吻合。

(a)

(b)

(c)

2.3.4 復合果醋發酵工藝的最優參數及驗證

利用Design Expert 8.0軟件對回歸方程偏導求解，可得出果醋發酵的最優工藝參數：醋酸菌接種量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1。在此工藝條件下進行3次驗證實驗，得到果醋產品實際總酸含量為7.270 g/dL，較優化之前的各組數據有顯著提升(p<0.05)，此工藝參數下模型的預測值7.339 g/dL，相對誤差僅為0.949%，不到1%。由此可以驗證本研究所得的理論生產模型與實際情況有較好的擬合度，能有效地反映出醋酸菌接種量、初始酒精度、初始pH值等工藝環節參數與復合果醋產品總酸含量的關系，可用于指導生產發酵型無花果沙棘復合果醋。

3 結論

本研究以新鮮無花果、沙棘果為開發原料，首先，通過感官評價法確定了二者的最佳配比，再利用單因素實驗選出了醋酸菌接種量、初始酒精度、初始pH值這3個影響相對顯著的因素，在此基礎上以果醋總酸含量為響應值進行響應面優化實驗，所得模型擬合程度良好(p<0.0001)，得出最終的最優工藝參數為：醋酸菌接種量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1。生產過程中具體操作參數為：醋酸菌接種量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1、搖床轉速為130 r/min。通過驗證實驗，此工藝下的復合果醋產品總酸含量為7.270 g/dL，較優化之前有顯著提升(p<0.05)，產品感官上體現為醋味醇和、酸甜味協調，帶有無花果和沙棘特有的果香，開發前景廣闊。該研究不僅為優化無花果沙棘復合果醋的發酵工藝提供了科學指導，也對豐富調味品市場產品種類提供了新的方向。