油茶果殼原花青素的提取及抑制α-淀粉酶活性的研究

劉承毅,吳雪輝

(1.華南農業大學 食品學院，廣州 510642；2.廣東省油茶工程技術研究中心，廣州 510642)

原花青素(proanthocyanidins)，是一類植物中廣泛存在的黃烷醇單體及其聚合體的多酚類化合物[1]。其單體主要包括兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素等[2]，單體通過聚合形成二聚體至多聚體，其中以C6-C4或C8-C4連接形成的多聚體為B型原花青素，以C2-O-C5或C2-O-C7等方式連接形成的多聚體為A型原花青素[3]。原花青素是一種天然的強抗氧化劑，常常作為添加劑應用于飲料、酒等中[4]。此外，有研究表明原花青素還具有降血糖、預防心血管疾病等作用[5-6]。

通過抑制口腔及腸道中α-淀粉酶的活性，可以減少對淀粉類食物的分解，降低人體對糖類的吸收，來達到降低血糖及防治糖尿病的目的[7]。原花青素具有較好的抑制α-淀粉酶活性的效果，Ann Barrett等[8]研究了可可、石榴、蔓越莓、葡萄中原花青素對α-淀粉酶活性的抑制作用，結果顯示：4種原花青素對α-淀粉酶活性均有一定的抑制作用；劉睿等[9]也發現高粱原花青素能夠有效抑制α-淀粉酶活性。

油茶果殼(Camelliaoleiferashell)是油茶籽果實的外種皮，占鮮果重量的50%～60%，因對其利用方式有限，果殼常常被作為廢棄物丟掉，造成了資源的浪費[10]。油茶果殼中含有豐富的原花青素[11]，目前，從果殼中提取原花青素及對α-淀粉酶活性抑制方面的研究較少，因此本文以油茶果殼為原料，采用溶劑提取法，利用響應面試驗優化原花青素的提取工藝，并探究對α-淀粉酶活性的抑制作用，以期為油茶果殼的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶果：采自東莞市樟木頭林場。

無水乙醇(分析純)：天津市富宇精細化工有限公司；濃硫酸、香草醛、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉(分析純)：廣州化學試劑廠；可溶性淀粉：天津市科密歐化學試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸(純度≥98%)：國藥集團化學試劑有限公司；原花青素標準品(純度≥95%)：上海如吉生物科技發展有限公司；豬胰α-淀粉酶(10 U/mg)：美國Sigma-Aldrich公司；阿卡波糖：上海伊卡生物技術有限公司。

UV-5200型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；BJ-150型多功能粉碎機 德清拜杰電器有限公司；JJ1000型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 廣州航信科學儀器有限公司；101-2A型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

將油茶果殼洗凈后切塊，于45 ℃的烘箱中烘干至恒重，粉碎過40目篩，密封、避光儲存于干燥箱中備用。

1.2.2 原花青素含量的測定

原花青素含量的測定參考孫蕓等[12]的方法并略做修改。

1.2.2.1 原花青素標準曲線的制作

分別加入0.50 mL濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mg/mL的原花青素標準溶液于試管中，依次加入2.50 mL 1%香草醛-甲醇溶液、2.50 mL 30%濃硫酸-甲醇溶液，在30 ℃溫度下避光水浴30 min。反應結束后，搖勻，用紫外分光光度計測500 nm 處的吸光值。以原花青素濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.2 樣品中原花青素含量的測定

取0.50 mL甲醇稀釋后的原花青素樣液按照1.2.2.1的方法進行反應，反應結束后用紫外分光光度計測500 nm處的吸光值。根據標準曲線計算樣品中原花青素濃度，并利用下式計算原花青素得率：

(1)

式中：C為測得的原花青素濃度，mg/mL；V為樣液體積，mL；n為樣品稀釋倍數；m為油茶果殼粗粉質量，g。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 油茶果殼中原花青素的提取

稱取5組，每組2.00 g的果殼粗粉，加入體積分數為40%的乙醇溶液，控制料液比為1∶20 (g/mL)；置于恒溫水浴鍋中，在50 ℃溫度下提取1 h，抽濾得濾液，提取1次，按照1.2.2.2的方法測定并計算原花青素的得率。

1.2.3.2 單因素試驗設計

根據1.2.3.1中原花青素的提取方法，在控制其他條件相同的情況下，僅改變其中一個條件，分別考察乙醇體積分數(0%、20%、40%、60%、80%)、提取溫度(30，40，50，60，70，80，90 ℃)、提取時間(2，4，8，12，20，30，60 min)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)和提取次數(1，2，3，4，5次)對原花青素得率的影響。

1.2.4 響應面試驗設計

綜合單因素試驗，選取對原花青素得率影響較大的3個因素，即：乙醇體積分數、料液比和提取時間，分別以A，B，C表示。以A，B，C為自變量，以原花青素得率為響應值(Y)進行試驗。采用Design-Expert 10對試驗數據進行回歸分析。每一自變量的低、中、高試驗水平分別以-1，0，1進行編碼。

1.2.5 α-淀粉酶活性抑制作用測定

參考丁華杰等[13]的方法并略做修改，向25.00 mL具塞刻度試管中依次加入0.50 mL 2.00 mg/mL α-淀粉酶溶液、0.50 mL 0.20 mol/L磷酸緩沖液、0.50 mL不同濃度的原花青素溶液，于37 ℃水浴鍋中反應10 min，然后加入0.50 mL在37 ℃預熱過的1%淀粉溶液，反應6 min后加入1.00 mL DNS溶液，并立即放入沸水中加熱5 min，加熱完畢后放入流水中冷卻至室溫，定容至25.00 mL，于540 nm處測吸光度值。試驗以相同濃度阿卡波糖作陽性對照，繪制不同濃度抑制劑對α-淀粉酶活性的抑制曲線，用下式計算α-淀粉酶活性的抑制率：

(2)

式中：A1、A2、A3、A4分別是空白管、空白對照管、樣品管、背景對照管的吸光度值。

1.3 數據統計及分析

2 結果與分析

2.1 原花青素標準曲線的繪制

由圖1可知，原花青素標準曲線方程為：y=2.63x+0.0394(R2=0.9991)，在0.05～0.30 mg/mL范圍內時，原花青素濃度與吸光值線性關系良好。

圖1 原花青素標準曲線Fig.1 The standard curve of proanthocyanidins

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對原花青素得率的影響

乙醇體積分數對原花青素得率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of proanthocyanidins

由圖2可知，乙醇體積分數在0%～40%范圍內時，隨著乙醇濃度增大，原花青素得率增大；當乙醇體積分數達到40%時，得率達到最高值，隨著乙醇體積分數的進一步增大，原花青素得率開始下降。原花青素是一種多酚類化合物，含有較多酚羥基，因而具有一定極性，依據相似相溶的原理，當溶劑極性和原花青素極性相當時，溶解度達到最大，得率最高[14]。

2.2.2 提取溫度對原花青素得率的影響

提取溫度對原花青素得率的影響見圖3，圖中A和B分別為80 ℃和90 ℃提取液冷卻后的狀態。

由圖3可知，當提取溫度在30～80 ℃范圍內時，原花青素得率隨著溫度的升高而增大，80 ℃時達到最大值；超過80 ℃后，原花青素得率下降。溫度升高，會加速原花青素的溶出，但高溫同樣也能加快原花青素的氧化破壞[15]，最終，在80 ℃時得率達到最大值。在試驗中發現，80 ℃時提取液冷卻后會出現少量凝膠，90 ℃時則會出現大量凝膠。有研究表明，油茶果殼中含有較多膠類物質[16]，此類物質經過高溫后冷卻會形成凝膠，由于這種不利反應會影響后續的純化過程，所以選擇70 ℃作為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of proanthocyanidins

2.2.3 提取時間對原花青素得率的影響

提取時間對原花青素得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of proanthocyanidins

由圖4可知，提取時間為2 min時就可以提取到很大部分的原花青素，并且隨著時間的增加，得率持續增大，到12 min時得率達到最大值，超過12 min后，原花青素得率下降。原因是隨著時間的增加，果殼中原花青素溶解越來越充分，得率增加，但時間過長也會導致酚類物質遭到破壞[17]，不利于原花青素的提取，因此選擇提取時間為12 min。此外，相比于從葡萄籽[18](提取時間為4 h)和板栗殼[19](提取時間為1.5 h)中提取原花青素，從油茶果殼中提取原花青素的時間很短，這可能與果殼材料特性有關，油茶果殼結構呈多孔狀[20]，且易吸水膨脹，使果殼內物質容易與溶劑接觸并溶解，因此采用直接溶劑提取能夠在較短時間內完成果殼中原花青素的提取。

2.2.4 料液比對原花青素得率的影響

料液比對原花青素得率的影響見圖5。

圖5 料液比對原花青素得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the yield of proanthocyanidins

由圖5可知，料液比在1∶10～1∶50 (g/mL)范圍內時，原花青素得率隨著溶劑的增加而增加。增大溶劑量可以加大溶劑與物料的接觸面積[21]，使原花青素的得率增加，當料液比為1∶40 (g/mL)后，部分與油茶果殼結合較緊密的原花青素已很難被提取出來，得率趨于穩定。考慮得率和成本，選擇料液比為1∶40 (g/mL)。

2.2.5 提取次數對原花青素得率的影響

提取次數對原花青素得率的影響見圖6。

圖6 提取次數對原花青素得率的影響Fig.6 Effect of extraction times on the yield of proanthocyanidins

由圖6可知，提取2次時，原花青素得率顯著降低，提取3～5次時，可以發現提取液中原花青素已經很少，說明提取1次就能在很大程度上提取出果殼中的原花青素。綜合考慮能源消耗、材料成本，選擇提取次數為1次。

2.3 響應面試驗結果與分析

2.3.1 響應面試驗設計及結果

根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，選取對原花青素得率影響較大的3個因素，即：乙醇體積分數、料液比、提取時間，分別以A，B，C表示，試驗因素和水平設計見表1。試驗方案及結果見表2，試驗共17個試驗點，其中4，7，10，14，17是中心試驗，其余為析因試驗。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface test design

表2 響應面分析結果Table 2 The results of response surface analysis

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗

采用Design-Expert 10對所得的試驗結果進行多元回歸分析，分析結果見表3。由于各因素對原花青素得率的影響不是簡單的線性關系，為了明確各因子對響應值的影響，對表2中原花青素得率進行回歸擬合，獲得二次多項回歸方程：R1=5.410+0.056A+0.360B+0.120C+0.042AB+0.035AC-0.060BC-0.330A2-0.130B2- 0.190C2。

表3 回歸分析結果Table 3 The results of regression analysis

由表3可知，整體模型的P值<0.01，表明該二次方程模型達到極顯著水平。失擬項為0.30>0.05，表明該項不顯著，說明未知因素干擾很小。模型相關系數R2=0.9907，校正決定系數RAdj2=0.9788，說明該模型對試驗擬合較好，可以用于原花青素得率的理論值預測。乙醇體積分數、提取時間、料液比的P值均小于0.05，說明各條件對原花青素得率均有顯著性影響。由F值可知，各因素對原花青素得率的影響次序為：料液比>提取時間>乙醇體積分數。

2.3.3 響應面分析

使用Design-Expert 10軟件繪制得到等高線圖和響應面圖(見圖7)，分別反映了乙醇體積分數、料液比和提取時間的交互作用。其中等高線圖呈圓形，表示交互作用不顯著，呈橢圓形則表示交互作用顯著[22]，由圖7可知，各因素等高線圖均接近圓形，表明各因素之間的交互作用不明顯。

圖7 各因素交互作用對原花青素得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour maps of the interaction of various factors on the yield of proanthocyanidins

2.3.4 提取條件的優化及驗證試驗

結合回歸模型的數學分析可知，油茶果殼原花青素的最佳提取工藝參數為：提取時間13.27 min，乙醇體積分數43.12%，料液比1∶50(g/mL)。實際中，調整參數為：提取時間13 min，乙醇體積分數43%，料液比1∶50(g/mL)，在此工藝條件下油茶果殼原花青素的理論得率為5.64%。為檢驗響應面法的可靠性，采用最佳提取條件進行3次重復試驗，實際測得的平均原花青素得率為5.58%，接近于理論預測值。此結果說明實際試驗值與軟件預測值吻合度良好，證明此優化方案可行。

2.4 原花青素對α-淀粉酶活性的抑制作用

原花青素對α-淀粉酶活性的抑制曲線見圖8。

圖8 油茶果殼原花青素對α-淀粉酶活性的抑制曲線Fig.8 Inhibition curves of proanthocyanidins from Camellia oleifera shell on α-amylase activity

由圖8可知，在0.08～1.50 mg/mL濃度范圍內，原花青素對α-淀粉酶活性的抑制率快速增加，超過1.5 mg/mL后，抑制率增加趨于平緩。周培羽等[23]研究了原花青素對α-淀粉酶的抑制作用及抑制機理，結果顯示：不同聚合度的原花青素均能夠插入α-淀粉酶的活性位點，占據催化中心，阻礙α-淀粉酶與底物的結合。當原花青素濃度低于1.5 mg/mL時，α-淀粉酶的結合位點未飽和，抑制率快速升高；濃度超過1.5 mg/mL后，結合位點趨于飽和，抑制率緩慢增加。結果顯示：油茶果殼原花青素對α-淀粉酶的活性抑制呈現一定的劑量依賴關系，當濃度為2.00 mg/mL時，α-淀粉酶活性的抑制率達到79.64%，低于對照物阿卡波糖的92.06%。

分別對圖8中原花青素和阿卡波糖濃度和抑制率的關系進行多元非線性擬合，計算得出原花青素的半抑制濃度為0.71 mg/mL，對照物阿卡波糖的半抑制濃度為0.30 mg/mL。原花青素粗提物對α-淀粉酶活性的抑制效果弱于阿卡波糖，可能是粗提物中含有較多雜質，后期對原花青素的純化過程有利于進一步提升抑制效果[24]。

3 結論

通過單因素試驗結合響應面分析法優化油茶果殼中原花青素的提取工藝，并探究原花青素對α-淀粉酶活性的抑制作用。結果顯示：油茶果殼中原花青素的最佳提取工藝條件為提取時間13 min，乙醇體積分數43%，料液比1∶50(g/mL)，原花青素含量達到極大值5.58%，與理論預測值接近。測定了不同濃度下原花青素對α-淀粉酶活性的抑制作用，抑制率可達到79.64%，半抑制濃度為0.71 mg/mL，表明油茶果殼原花青素具有較好的抑制α-淀粉酶活性效果，有望作為膳食添加劑應用于血糖控制及糖尿病的防治。