微生物污染源解析技術研究進展

鄭前興,張 楊,于曉巍,韋思業,黃建洪,吳仁人* (.昆明理工大學環境科學與工程學院,云南 昆明 650500；.生態環境部華南環境科學研究所,廣東 廣州 50655)

隨著人口的激增和畜牧養殖業的快速發展,我國地表水體受人和動物糞便污染的情況日益嚴重[1].水體遭受糞便污染后,糞便中攜帶的致病微生物進入水體,會引起水源性疾病的爆發,對人類健康構成重大威脅[2-4].另一方面,糞便中含有的氮、磷等物質進入水體中,會導致水體的富營養化,造成水質惡化[5-6].

目前,大多數國家采用糞大腸菌群(Fecal coliform)或大腸埃希氏菌(Escherichia coli)等傳統指示微生物(FIB)來反映水體微生物污染狀況[7-9],包括我國的《地表水環境質量標準》[10](GB38382002)也一直采用糞大腸菌群作為評價水環境受微生物污染的指標[11].然而,FIB不能提供微生物污染宿主來源方面的相關信息[12-14],無法幫助研究和管理人員準確識別污染來源以達到“精準治污”的目的[15].此外,來自于不同宿主糞便中的致病微生物對于人體的致病機理和致病程度也有較大差異,因此識別糞便排放來源也有助于準確評估人類接觸水體后的患病風險.

微生物污染源解析技術(MST)是一種通過檢測水體中特異性生物標記或特定微生物群落結構而識別糞便污染來源的新技術[16-17].相比于 FIB,該方法不僅可以識別水體中的微生物污染來源,還能夠有效預測部分潛在致病菌的水環境行為,可對健康風險評估提供更準確的信息[18].目前,常用的MST主要有非庫依賴法和庫依賴法.非庫依賴法主要以PCR技術為主,通過擴增特異性生物標記基因識別糞便污染的排放源,具有時效強、成本低等特點[19-20];庫依賴法則主要以高通量測序技術為基礎,通過基于貝葉斯思想開發出的 SourceTracker源解析程序[21]、最大化微生物源跟蹤工具[22]和隨機森林[23]等識別特定的微生物群落結構,提供污染源信息,具有通量高、微生物信息全面等優勢[24-25].然而,2種源解析方法均有其特定的適用條件和缺陷.本文通過對前人的研究進行歸納、總結,闡明不同源解析方法存在的不足和使用條件,指出微生物污染源解析研究的最新發展方向,為建立準確、完善的微生物污染源解析技術提供幫助.

1 非庫依賴法

1.1 qPCR-MST基本原理

由于飲食結構和生存環境的差異,不同宿主腸道中的微生物種類、群落結構存在一定的區別,并且分類相同的指示微生物在不同宿主腸道中基因片段也有所不同.MST正是利用這一基因上的差異,通過檢測受污染水體中是否存在特異性生物標記,可以判斷不同糞便污染來源[26].目前,研究人員已針對反芻動物(牛、羊、鹿等)、哺乳動物(人、狗、馬、豬、貓等)和禽類(海鷗、雞、鴨、鴿子、雁等)等開發出了不同特異性標記物,并以PCR技術為基礎,在世界各地區成功識別出環境水樣中來自各種動物的糞便污染[15,26-28].例如,Bower等[29]識別出美國密歇根湖地區水體中的糞便污染主要來自于人和牛.張楊等[11]在珠江三角洲地區識別出城市地表水中的微生物污染主要來自人、禽類和反芻動物糞便.

1.2 標記物檢測-實時熒光定量PCR(qPCR)

聚合酶鏈式反應(PCR)是一項體外擴增核酸片段的技術,具有簡便易行、特異性強、靈敏度高等特點[30].通過使用特異性引物對水樣 DNA進行 PCR擴增,觀察是否出現目標條帶,即可判斷水樣受到何種動物糞便污染[3].但 PCR技術只能定性并且易產生非特異性擴增.而實時熒光定量 PCR(qPCR)技術,通過在 PCR反應中加入熒光基團進行實時監測,比PCR具有更高的特異性和靈敏度.還可以通過制備標準品構建標準曲線或加入內參基因的方法,確定每個反應的基因拷貝數,實現對污染物的定量分析[11].并且從采樣到分析全過程僅需幾小時就能完成,成為標記物檢測的首選方法.

1.3 特異性生物標記的適用性

特異性生物標記是針對不同宿主腸道微生物中特定的基因序列開發而來,具有宿主遺傳性和特異性.然而,受不同地區的氣候、飲食習慣及生活方式等差異性的影響,各地區宿主體內的腸道微生物種類和結構也不盡相同.例如,Lu等在美國俄亥俄州對野鵝的糞便進行生物多樣性分析時發現,芽孢桿菌占腸道菌的 30.2%,而在加拿大安大略省則為46.3%[1,31].不同地區宿主腸道微生物結構的變化也進一步導致了開發出的特異性標記物表現出顯著的地區差異性.因此,在目標研究區域驗證特異性標記物的特性表現,識別具有地區適用性標記物是開展微生物污染源解析工作的重要前提.

1.3.1 定性靈敏度 靈敏度是指標記物在目標糞便樣本中的陽性率,計算公式 R=TP/(TP+FN),其中TP是對目標樣本擴增顯示陽性的樣本數;FN是對目標樣本擴增顯示陰性的樣本數[32].標記物的靈敏度與其對糞便污染物的檢出率息息相關,靈敏度越高,該標記物指示目標宿主糞便污染的性能越好.然而,不同地區標記物的靈敏度表現通常存在較大差異.例如,Schiaffino等[33]在秘魯識別出人源擬桿菌標記物BacHum靈敏度為 80%,具有較好的適用性.在泰國和尼泊爾部分地區 BacHum靈敏度甚至高達95%～100%[34].然而在印度[35]和肯尼亞[36]BacHum的靈敏度分別僅有 50%和 18%.導致這一現象的主要原因是擬桿菌的遺傳變異以及各地區氣候和生態壓力不同[33,37].

為克服傳統MST標記物(如擬桿菌、線粒體標記物)存在的靈敏度低或對潛在致病菌指示性較差等缺點,研究人員針對人腸道中豐度較高的噬菌體crAssphage開發出了人源特異性標記物 CPQ_056和 CPQ_064[38].由于該類標記物是針對噬菌體的特異性基因開發而來,被認為與致病菌有近似的環境行為,成為目前標記物驗證工作的熱點[39-40].Stachler等[41]在美國部分地區識別出CPQ_056和CPQ_064靈敏度高達100%.然而,本實驗室采用crAssphage標記物對在我國 28個城市采集的糞便樣品進行檢測時,CPQ_056和 CPQ_064靈敏度表現較差分別為61%(71/117)和 67%(78/117)[15].Ahmed 等[26]在澳大利亞的研究中CPQ_056靈敏度也僅有38%.導致這一結果的原因可能是crAssphage在不同地區人類腸道中的分布特征具有一定的差異性.已有研究報道歐洲和美國地區受糞便污染的水體中crAssphage的豐度顯著高于亞洲和非洲[42-43].說明盡管crAssphage廣泛存在于世界各地人類腸道中,但其豐度也具有明顯的地區差異性.此外,宿主年齡、健康或其它因素均會改變糞便中crAssphage的分布特征[44-46],從而影響 qPCR檢測結果[15,46].因此,在大尺度目標區域內開發出靈敏度表現穩定的標記物仍是目前MST技術需要進一步解決的難題.

1.3.2 源強特征 如果標記物僅具有較高的定性靈敏度,而源強特征(即標記物在目標物種中的檢出濃度分布特征)較差,則當微生物污染源被稀釋或是樣本處理過程中DNA濃度損失時,可能會導致檢測的標記物濃度低估水體污染水平,甚至無法檢出水樣中的糞便污染[15,26].因此,近年來部分研究人員在開展標記物驗證時,除識別標記物的定性靈敏度外,進一步探究了標記物的源強特征.

研究表明,不同源指示微生物在目標宿主腸道內的豐度會影響標記物的檢出濃度.Zhang等[15]的研究發現人源擬桿菌標記物 HF183、BacHum 和BacH在人糞樣本中的檢出濃度比假定蛋白BF3236標記物 Hum163和Hum2以及 crAssphage標記物CPQ_064和CPQ_056檢出濃度高1～2個數量級.導致這一現象的原因可能是在大部分哺乳動物腸道中,擬桿菌的相對豐度高于其它種類的腸道微生物[47-48].此外,相同源指示微生物種類在不同宿主之間的分布差異也對標記物的檢出濃度有顯著影響.例如,Reischer等[49]在世界六大洲針對擬桿菌標記物適用性開展的研究發現,用于指示反芻動物糞便污染的擬桿菌標記物BoBac、BacR以及BacCow的檢出濃度均高出人源擬桿菌標記物 BacH和BacHum 1～2個數量級,且濃度分布的離散程度更低,說明反芻動物標記物具有較好的源強特征,這與Zhang等[15]在我國調查的擬桿菌標記物源強特征的結果一致.這可能是反芻動物腸道中的擬桿菌豐度要高于人類所致.Hong等[50]在分析哺乳動物腸道菌群時發現,反芻動物和豬腸道內擬桿菌相對豐度普遍高于人類,同時大部分擬桿菌屬如 Bacteroides caccae、Bacteroides uniformis、Bacteroides vulgatus和 Bacteroides fragilis等在牛和豬腸道微生物群落結構中的豐度表現也更為穩定.由此可見,源指示微生物在宿主腸道中的分布特征與特異性標記物的源強特征具有極強的關聯性,在標記物的開發、設計階段,應充分考慮源指示微生物的分布及穩定性等情況,以提高源解析結果的準確性.

1.3.3 交叉反應(假陽性反應) 特異性是評價標記物的另一重要指標,是指標記物在非目標糞便樣本中的陰性率,計算公式S=TN/(TN+FP),其中TN是對非目標樣本擴增顯示陰性的樣品數;FP是對非目標樣本擴增顯示陽性的樣品數[32].一個高度宿主特異性的標記物可以準確識別糞便污染的來源.迄今為止,尚未發現一種標記物可對其宿主表現出絕對的特異性[15].在非目標樣品中發生的交叉反應是導致標記物特異性降低的主要原因[51],例如 Malla等[34]發現人源特異性標記物 crAssphage與狗、鴨、雞,豬產生較高比例的假陽性反應,導致其特異性下降至 63%.目前,關于標記物與非目標動物產生交叉反應的機理尚不明確,部分研究推測不同動物在特定環境中存在的共居關系可能會導致含有標記基因的微生物在腸道內短暫定殖,進而使得標記物產生假陽性結果.例如,Nshimyimana等[52]在新加坡的研究發現人源特異性標記物 HF183中來自兔子糞便的假陽性信號比例較高,而該地區兔子是常見的寵物.同時,相似的飲食也會引起標記物與非目標宿主產生交叉反應[33,39,53].如在本文前期研究中,馬和驢與反芻動物標記物 Rum-2-Bac、Bac708、BacCow產生較高水平的交叉反應[15],進一步分析可能是因為馬、驢和反芻動物飲食均以草料為主,其腸道微生物具有同源性或相似性[54].

盡管標記物均會產生假陽性擴增,但大多數標記物僅與部分非目標動物產生交叉反應,且不同標記物產生的交叉反應動物也不盡相同,這為有效排除假陽性反應,準確識別微生物污染來源提供了可能.已有諸多研究報道,標記物與糞便樣品的交叉反應可以通過同時檢測兩個或多個標記物來解決[15,26].例如,本文前期研究表明,Hum2在驢糞樣品中存在的交叉反應可以通過使用人源標記物CPQ_056進行識別,并且CPQ_056在狗和鴨糞樣本中的假陽性擴增也可用Hum2識別[15].Ahmed等[26]也發現HF183在雞、鴯鹋和考拉糞便中的假陽性擴增可以用crAssphage標記物CPQ_056來識別.

1.3.4 假陽性信號強度 盡管標記物對非目標宿主糞便樣品產生的假陽性擴增給微生物污染源解析的應用帶來了一個重大挑戰,但大多數假陽性信號強度顯著低于標記物的源強特征.例如,Reishcer等在 16個國家開展評估人和反芻動物擬桿菌標記物表現時,發現BacH、BacHum、BacCow、BacR和BoBac 的源強特征較假陽性信號強度高出 2～4個數量級[49].Ahmed等[26]的研究也發現標記物CPQ_056、HF183和Lachno3的源強特征比假陽性信號強度高 1～5個數量級.因此,通過稀釋樣品、純化DNA等方法,可以將標記物的假陽性信號降低至檢測限以下,從而準確識別糞便污染來源[55-56].例如,Hundesa等[7]和Li等[57]在進行微生物污染源解析工作時,通過稀釋 DNA,降低了假陽性信號水平,準確識別出目標區域的豬源糞便污染.值得注意的是,部分非目標動物與標記物產生的假陽性信號強度可能與目標動物中的檢出濃度位于同一數量級.此類假陽性信號可能無法通過實驗手段予以排除[15].在開展微生物污染源解析工作時,應注意篩選出對標記物產生假陽性信號強度較高的物種,通過標記物組合的方式對其進行識別,甚至避免使用此類標記物.然而,盲目增加標記物個數,會導致組合中存在冗余的標記物,增加監測成本.因此,建立不同標記物組合的工具箱(toolbox)對于準確識別污染源具有重大意義.基于此,Ballesté等[58]和 Blanch 等[59]研究了影響標記物組合的因素.Ballesté等考慮了標記物衰減對MST結果的影響,發現當水樣老化和稀釋后,標記物的源強特征降低,而難以識別污染源[58].Blanch等人提出,如果標記物在環境中具有相似的衰減規律,則此類標記物組合能較好地識別環境水體中糞便污染,適合建立“toolbox”,在檢測被稀釋或混合樣品時也具有優勢[59].然而根據本文目前正在開展的研究結果,使用具有不同衰減趨勢的標記物,建立“toolbox”可以幫助研究人員獲得糞便污染的更多背景信息,包括定性和定量信息.如擬桿菌標記物BacHum具有較高的靈敏度,crAssphage標記物CPQ_056衰減速率較小,同時使用BacHum和CPQ_056可以幫助識別不同時期(近期和遠期)甚至是遠離監測點的污染源.

本文前期研究識別出部分適用于我國的標記物(見表 1)[15],并成功識別出龍江流域人源污染>反芻動物(牛)>豬和禽類.從表 1可以看出標記物的靈敏度和特異性呈現一定負相關關系,較難同時滿足靈敏度、特異性>80%.根據美國國家環境保護局(US EPA)建議,表現好的標記物靈敏度和特異性應大于80%[26,60].同時,在同一宿主中不同種類標記物的源強特征差異較大,這在以往的研究中容易被忽略,而這為選取何種標記物作為評價污染源貢獻率和潛在的健康風險水平提出了重大挑戰.例如,在開展微生物定量風險評估以 USEPA感染胃腸道疾病的風險閾值(30/1000)為標準時,擬桿菌標記物 HF183濃度為4100GC/100mL[61],而crAssphage標記物CPQ_056濃度為9100GC/100mL[62].未來應進一步探索致病菌的分布特征和傳統水質指標與各類標記物檢出濃度的內在關系,以期為相關水質指標的制定以及人類健康風險的評估提供關鍵信息.

表1 不同標記物表現Table 1 Different marker performance in China

2 庫依賴法

高通量測序(HTS)又叫下一代測序或深度測序,可一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子同時進行序列測定.大量序列數據的產生,讓研究人員能更深入地挖掘基因組信息,擴展到以前難以深入的領域,極大地促進了人們對腸道微生物多樣性的理解,也使得研究人員可通過分析微生物群落的結構特征來識別微生物污染的來源[63-66].庫依賴法的基本原理是通過對不同來源動物糞便16S rRNA基因進行高通量測序[67-71],然后構建糞便源解析文庫(FTL),并通過開發出的機器學習方法與水樣中的微生物群落進行對比,最終識別出微生物污染來源及相對貢獻量.目前,已開發出的機器學習方法有SourceTracker、最大化微生物源跟蹤工具(FEAST)、隨機森林(Random Forest)等[21-23],SourceTracker因具有準確性好,靈敏度高和特異性強等優勢得到了較為廣泛的應用[6].因此,本文主要對采用SourceTracker開展源解析的方法進行論述.

2.1 SourceTracker

通過對不同宿主糞便以及環境水樣 16S rRNA基因進行高通量測序,SourceTracker源解析程序將不同糞便來源微生物群落和待分析的水體微生物群落當做一個整體,基于貝葉斯算法,識別水樣中不同宿主來源微生物所占比例,解析水樣糞便污染來源[21].目前,研究人員已在不同區域應用此方法識別出了水環境中不同糞便污染來源及其貢獻率[71-72].例如,Brown等[73]使用SourceTracker成功識別出蘇必利爾湖河口糞便污染主要來自污水處理廠排放的廢水(70%)和海鷗糞便(30%),與qPCR方法所得結果一致[74-75].為了進一步評估 SourceTracker解析污染源的能力,Staley等[76]將5種來源糞便以不同比例添加到淡水中,發現其識別糞便污染準確性高達91%;即使在較低濃度下也未出現假陰性結果,其特異性超過現有大部分MST標記物.此外,有研究表明庫依賴法源解析結果的準確性與 SourceTracker運行參數設置存在一定的內在聯系[77-78].Brown等[73]在解析蘇必利爾湖河口的污染源時,發現多次運行SourceTracker所得相對標準偏差(RSD)與預測結果呈負相關關系,污水處理廠排放廢水的糞便污染比例為68.3%,其RSD為2.48%;而鵝糞便污染比例為6.1%,RSD達20.71%.Henry等[79]評估近海岸糞便污染時觀察到類似的現象,當人源污染比例為 10%時,RSD為8%;而人源污染比例為0.1%時,RSD高達55%,其預測準確性較低.因此,可以通過增加SourceTracker的運行次數,利用RSD值排除假陽性結果(RSD>100%)[80],以獲取更為準確的污染源信息[81].此外,Henry等[79]研究了抽平深度、burn-in次數、dirichlet超參數α和β對SourceTracker預測的靈敏度和準確性影響;發現隨著 SourceTracker抽平深度從1000增加到50000,檢測靈敏度可以從90%增加到100%,α和β值的改變也提高了SourceTracker預測的靈敏度和準確性,而burn-in次數對結果影響較小.可見,SourceTracker運行參數顯著影響源解析結果,而目前相關研究較少,尚未確定SourceTracker運行最優參數.綜上所述,SourceTracker為識別不同污染來源提供了便利,但仍需對程序運行參數進行優化,使預測結果更加準確.

2.2 糞便源解析文庫(FTL)

2.2.1 宿主種類對FTL的影響 庫依賴法解析污染源的準確性與糞便源解析文庫息息相關.由于不同區域、不同宿主之間糞源微生物結構的變異性有較大差異,使用SourceTracker解析污染源時,必須考慮 FTL 的不同組成.Brown等[82]在使用SourceTracker分析已知污染源(牛糞和污水)的水樣時,發現當FTL中納入過多的宿主類型(海貍、貓、雞、牛、鹿、狗、鵝、鷗、馬、兔子、豬、火雞、污水)時,預測結果出現了禽類和馬的假陽性結果,而禽類和馬糞污染在目標研究區域內實際是不存在的.與此相對,當FTL中僅納入牛、馬和污水樣本時,雖然禽類污染的假陽性結果消失,但馬糞污染的假陽性結果仍然存在.由此可見,FTL中涵蓋宿主種類過多或過少均會影響SourceTracker源解析結果.另一方面,解析目標研究區域的污染源時,能否采用其它地區糞便樣本建立 FTL也是研究者關注的重點.例如,Staley等[76]發現,使用非目標區域采集的糞便樣本構建FTL時,難以準確識別區域內水環境中的糞便污染來源,轉而使用目標區域內的糞便樣本構建FTL后,運用SourceTracker模型則能夠準確將不同的污染源準確區分開來.因此在使用SourceTracker解析污染源時,對目標區域潛在糞便來源調查以構建合適 FTL對于準確識別污染源至關重要.此外,還有研究發現不同時期收集的糞便樣本構建的 FTL可能對源解析結果也具有一定影響.O'Dea等[6]在探究 FTL的變異性時發現,兩次收集的糞便樣本微生物群落相似性最大僅為 15%,主要原因是宿主腸道微生物群落可能受到氣候變化的影響,同種類宿主在不同時期表現出的糞源微生物群落結構差異較大.綜上所述,FTL也具有“地區適用性”,在目標區域解析污染源時,應考慮糞源微生物群落組成的地理以及種間變異性,定期更新FTL以保證源解析結果的準確性.

2.2.2 樣本量對 FTL的影響 FTL構建使用每個糞便來源共同的 OTU,高種內變異性可能會使SourceTracker難以識別污染源,因此每類宿主應納入的個體數量成為困擾建庫源解析法準確性的重要因素.已有部分研究嘗試通過權重分析來確定源文庫中各宿主應囊括的樣本量,以保證源解析結果的準確性[83].例如,Brown等[82]在使用SourceTracker解析蘇必利爾湖河口的污染源時,用權重分析確定了使 FTL中具有統計意義的樣本數,發現當每類宿主的樣本量小于12時,權重在31%以下,而樣本量大于 12時,權重達到了 100%,能夠準確識別各污染源.Staley等[76]的研究表明,即使FTL中僅包含10個樣本,采用 SourceTracker仍然能夠準確識別盲樣中的糞便污染來源.甚至有研究人員僅采用了 2個樣本即可建立 FTL,并準確識別水體中的污染來源[84].值得注意的是,除了權重分析,部分研究還通過 RSD來評估宿主樣本量大小對源解析結果的影響.當FTL中樣本量較小時,SourceTracker解析污染源的準確性相對較低.例如,當蝙蝠、人、牛和兔子樣本數量分別為8、2、3和4時,SourceTracker預測結果的相對標準偏差高達 68%,運行結果難以真實地反映出水體中污染物的宿主來源[79].由此可見,未來仍需加強對 FTL最適樣本量的研究,在保證源解析結果的同時避免資源的浪費.

2.3 土著微生物對庫依賴法源解析結果影響

水環境中的土著微生物對維持生態平衡,修復和改善水質狀況起到重要作用,但同時也給建庫源解析方法的應用帶來較多的不確定性.已有研究表明,源文庫中與土著微生物分類較為接近的物種可能會導致難以準確區分微生物污染來源[85].例如,在Brown等[73]的研究中,由于海鷗和鵝的糞源微生物群落與研究區域水體中的部分土著微生物分類較為接近,導致源解析結果中出現了海鷗和鵝等動物的假陽性信號.Brown等[82]在驗證源文庫的有效性時也發現由于污水中存在接近 40%的微生物種類與湖水中的土著微生物較為接近,導致源解析結果的準確性顯著降低.此外,土著微生物與水體中糞源微生物存在的相互作用也可能顯著干擾建庫源解析法的準確性.Byappanahalli等[86]在探討土著微生物與糞源微生物的共存關系時發現,在土著微生物的抑制作用下,糞源微生物繁殖數量減少了 1～2個數量級,這顯著影響糞源微生物與源文庫的對應關系.相反,部分腸道微生物也可能在環境中與土著微生物產生共生效應,進而導致源解析結果中包含部分假陰性結果.目前,關于環境中生物因素對于測序源解析方法的影響研究較少,未來應加強土著微生物與源文庫中各類微生物相互作用機制的研究.

近年來,MST在準確識別和量化環境中的糞便污染來源上取得了較大的進展,2種源解析方法均得到了廣泛應用.基于 PCR技術的庫依賴法可以在較短時間內獲得糞便污染信息,基于高通量測序的庫依賴法可一次識別和量化多個污染源.總體而言,2種源解析方法有其各自的適用條件(表 2),在幫助管理和研究人員識別環境水體中的糞便污染上各有優勢.

表2 2種源解析方法對比Table 2 Comparison of two MST methods

3 結論

非庫依賴法識別污染源的性能與標記物表現相關,對地區適用性標記物的識別和評估應基于定性(即靈敏度和特異性)和定量(即源強特征)兩方面的研究.在開展微生物溯源工作時,使用具有不同衰減規律的標記物,建立標記物組合“toolbox”有助于排除假陽性信號,提高污染源識別的準確性.庫依賴法識別污染源的準確性受 SourceTracker運行參數和 FTL組成的影響.FTL構建仍需考慮“地區適用性”,在通過權重分析確定FTL中應涵蓋的宿主種類及個體數量的同時增加程序運行次數可顯著提高SourceTracker識別污染源的能力.

4 展望

對于非庫依賴法,大多數研究對標記物的適用性評價主要以定性靈敏度和特異性為主,而忽略了標記物的源強特征.此外,對導致標記物特異性下降的交叉反應產生的機理尚不明確,影響源解析結果的準確性.而建立不同標記物組合的“toolbox”可以提高識別污染源的能力,基于此本文課題組已構建模擬反應器探究不同標記物的衰減規律,以期為“toolbox”建立提供理論依據.未來應加強對標記物源強特征產生差異的成因以及交叉反應產生機理方面的探索,為標記物的開發提供理論支撐.

對建庫源解析方法而言,由于糞源微生物群落結構具有變異性,導致 FTL表現出時間和空間上的差異,進而影響源解析結果.因此,未來應加強種內和種間變異程度對建庫源解析方法影響的研究,探究構建 FTL時應涵蓋的宿主種類、個體數量及 FTL更新周期,提高識別糞便污染的能力.

環境中土著微生物的種類對于建庫源解析方法影響較為顯著,但由于土著微生物群落結構變化及地區差異性較大,使得關于土著微生物對建庫源解析方法的影響規律認識還不夠深入.基于此,本文課題組已對不同樣本進行高通量測序,以期揭示不同糞源微生物群落結構的異同,區分糞源微生物與土著微生物的豐度及分布特征.未來應加強對土著微生物與糞源微生物競爭機制的研究,闡明 FTL受土著微生物種類的影響機理,提高在土著微生物影響下SourceTracker識別污染源的能力.

致謝：感謝哈爾濱工業大學汪磊博士對本論文英文摘要以及表的英文表題的審閱和修訂.