高原城市室內灰塵對人角膜上皮細胞損傷研究

畢 玨,張振寧,劉雨佳,楊丹蕾,鄭欽象,崔道雷,向 萍* (1.西南林業大學濕地學院,國家高原濕地研究中心,云南 昆明 6504；.西南林業大學生態與環境學院,環境修復與健康研究院,云南 昆明 6504；.溫州醫科大學附屬眼視光醫院,浙江 溫州 507)

灰塵作為一種復雜、多相的粒子混合物,異質性強[1],來源廣泛(土壤、大氣沉積顆粒物以及家居材料的磨損脫落等)[2-4],化學成分復雜[5].室內灰塵被認為是人體攝入和積累污染物的途徑之一[6-8].據統計,人們有超過 85%的時間在室內度過[9],且由于室內環境的密閉性,室內灰塵中的污染物濃度是室外灰塵中污染物濃度的數十倍[10].作為室內灰塵中負載的有毒污染物,重金屬因其濃度高、檢出率高[11],以及暴露后可對人類造成嚴重危害而被廣泛研究.

近年,國內外已開展室內灰塵中重金屬的研究,結果顯示室內灰塵中重金屬含量、富集程度高于室外灰塵[12-13].不同國家地區、不同功能區室內環境之間的差異,導致灰塵中重金屬含量差異較大,而污染來源和影響因素也各不相同[14-15].粒徑作為影響灰塵中重金屬含量分布的原因之一.國外學者研究發現室內灰塵中的As、Zn、Cu、Pb、Ni易富集在90～150μm粒徑范圍,而Cd和Mn易富集在45μm以下[16],但 Csavina等[17]認為重金屬易分布在小粒徑范圍.此外,Rashed[18]進一步研究發現灰塵中可溶性金屬易被植物和生物體獲得,應引起人們的重視.目前,針對室內灰塵重金屬的研究,主要集中在其含量、來源、人體健康風險、不同粒徑和空間分布特征等方面[19-23],研究較為單一,而國內目前較少關注灰塵中可溶性重金屬對人體健康暴露的影響.

目前,干眼、角膜炎的發病率逐年上升[24].有證據顯示,環境污染與眼表疾病的產生有關[25].流行病學也發現,灰塵暴露可引起眼部疾病的發生[26].眼表作為人體持續暴露于外界環境的組織之一[27],極易受外界污染物暴露的影響.研究證實,當人眼長時間暴露在辦公室灰塵內,會導致人淚液中炎癥細胞顯著降低,即使人眼暴露在正常灰塵濃度(<0.001～3.2mg/m3)下,也可能誘導人角膜上皮細胞損傷[28].但目前仍缺乏室內環境污染對眼表疾病的系統認識,而灰塵作為有毒重金屬匯集及遷移的媒介[29-30],當前已有研究發現 Pb暴露能夠導致白內障等蛋白質聚集性眼部疾病的發生[31],從而影響人眼健康.

目前室內重金屬污染研究區域多集中在沿海或平原較發達地區,昆明市屬于典型低緯度高海拔區域,年平均輻射量可達 260.75MJ/m2[32],高強度紫外輻射中,會使人群眼表功能更加敏感和脆弱.本文以高原城市昆明的室內灰塵為介質,考察不同功能區(辦公室、家庭住宅、學生宿舍)重金屬的含量水平,評估高原室內灰塵對人眼角膜上皮細胞損傷的健康風險,旨在為有效防控高原居民眼表健康風險提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器:等離子發射光譜儀(ICP-OES, Agilent 710,美國安捷倫科技公司);總有機碳分析儀(Vario,德國元素);臺式恒溫搖床(TS-211HSGZ,上海天星);干燥培養兩用箱(GPX-9162,上海躍進);二氧化碳培養箱(371,賽默飛世爾);實時熒光定量 PCR儀(Roche LightCycler?480 Ⅱ,瑞士羅氏);梯度 PCR 儀(Mastercycler Nexus Gradient, Eppendorf公司);酶標儀(SpectraMax? Plus 384, Molecular Devices公司,美國);低溫高速離心機(5804R, Eppendorf公司);Mastersizer 3000激光粒度分析儀(Malvern公司,英國);試劑: CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;抗菌-抗真菌劑(Antibiotic-Antimycotic)、胎牛血清(FBS)購自美國 GIBCO 公司;0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液購自武漢普諾賽生命科技有限公司;表皮生長因子EGF購自美國Life Technologies公司; RNA逆轉錄試劑盒購自日本寶日醫生物技術有限公司; PBS磷酸鹽緩沖溶液購自北京索萊寶科技有限公司; SYBR green qPCR master mix、總 RNA快速提取試劑、牛血清蛋白(CAS:9048-46-8)、溶菌酶(CAS:12650-88-3)購于南京翼飛雪生物科技有限公司、無水氯化鈣(CAS:10043-52-4)購于上海麥克林生化科技有限公司;定量 PCR所用引物序列信息來源于哈佛大學 Primer Bank(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/),由上海生工生物公司合成.

1.2 樣品的采集與處理

利用ArcGIS 10.2進行采樣點布設,按昆明不同功能區劃,供試樣品于2019年4～12月期間使用真空吸塵器(Panasonic, MC-WGE61)采集樣品,一共 41個室內灰塵樣品,其中辦公區 6個,學生宿舍及家庭住宅分別為16和19個,不同功能區采樣點樣品均為多點采集并分別混合成 1個樣品,樣品總量不少于2～5g.樣品帶回實驗室除去毛發、絮狀物、煙頭等雜物,冷凍干燥后分別過 325 目(45μm)、250 目(63μm)、200目(75μm)、150目(100μm)、10目(2000μm)尼龍篩,放置于清潔的鋁箔紙中,裝入玻璃小瓶于-20℃冰箱保存備用.

灰塵重金屬含量測定:按照美國 EPA的 USEPA 3050B方法[33],每個樣點設置3個平行,分別稱取4個不同粒徑及<100μm的200mg灰塵樣品于消解管內,加入10mL 1:1硝酸浸泡24h,放入消解爐內105℃下回流加熱蒸發至2mL,冷卻后加入2mL 30%濃度的過氧化氫,再次在105℃下消解至近干, 0.1mol/L的硝酸定容至50mL,使用0.45μm濾頭過濾至離心管中,最后利用ICP-OES測定灰塵中重金屬Pb, Cu, Cd, Zn, Cr,Ni, Co, As, Mn的含量.為保證分析結果的準確性,玻璃器皿用25%硝酸溶液浸泡24h以上,自來水、去離子水各清洗 3遍以上; ICP-OES加標回收率為(93.5%～110.6%),測定結果均達到質量控制要求.分析測試過程中重金屬標準品購于國家標準物質中心,所用水均為二次去離子水,試劑均為分析純.

灰塵粒徑測定:將收集的不同功能區灰塵分別通過2mm的尼龍篩,除去毛絮狀和其他雜物,使用激光散射方法[34],通過Mastersizer 3000激光粒度分析儀分別測定3次,并計算平均直徑.

灰塵中目標重金屬生物可給性測定:考慮到粒徑小于 100μm的灰塵更容易被人體吸附[35],各稱取上述不同功能區<100μm 室內灰塵 0.70g,并設置 3個平行,將灰塵加入到裝有 35mL模擬人工淚液(配方改自Weng等[36]磷酸緩沖鹽溶液0.01mmol/L、氯化鈣 0.01mmol/L、牛血清蛋白 0.1mg/mL、溶菌酶0.1mg/mL)的聚丙烯(polypropylene)離心管中,并同時加入抗菌-抗真菌溶液(終濃度 3%),渦旋振蕩5min,混勻后,使用搖床分別振蕩6h, 12h, 24h,振蕩完成后將離心管放入超聲波清洗機中,低溫連續超聲4次,15min/次,超聲功率為90%,用0.22μm的一次性濾頭過濾超聲后的灰塵混合液,通過ICP-OES測定灰塵中可溶性目標重金屬含量.灰塵中目標重金屬生物可給性由下式計算[37]:

式中: BA為室內灰塵重金屬在模擬人工淚液中的生物可給性, %; DS為室內灰塵重金屬在模擬人工淚液中溶解態含量, mg/kg; TS為室內灰塵中重金屬總含量, mg/kg.

1.3 灰塵暴露液配置

稱取粒徑<100μm 辦公室灰塵 0.064g溶解于50mL人工淚液中,同時加入抗菌-抗真菌溶液(終濃度 3%),渦旋振蕩 5min,使其充分混勻后放入搖床振蕩 24h,之后將離心管放入超聲波清洗機中,低溫連續超聲提取 4次, 15min/次,超聲功率為 90%,用0.22μm 的無菌一次性濾頭過濾超聲后的灰塵母液(1280μg/mL),錫箔紙包裹于 4℃冰箱備用.據文獻報道正常室內灰塵濃度在<0.001～3.2mg/m3范圍內[28],相關室內灰塵對人眼角膜上皮細胞損傷研究中,灰塵暴露濃度在1～1000[38], 10～500[39], 50～3200[35]μg/mL不等,因此本文將灰塵暴露液濃度設置為20, 40,80, 160, 320, 640μg/mL.

1.4 人角膜上皮細胞培養、細胞形態和活力檢測

在測定細胞活力之前,使用 DMEM 高糖培養基稀釋灰塵母液.人角膜上皮細胞(HCECs)來自于浙江省溫州大學附屬眼視光醫院.HCECs細胞生長于含有10%胎牛血清、1%抗菌-抗真菌劑和10ng/mL的表皮生長因子的高糖DMEM細胞培養基中, 37℃、5% CO2條件下培養,當細胞融合達到 80%以上進行傳代,按照不同實驗目的,分別接種到 96/6孔板中.細胞活力測定:以 1×104個 cells/100μL/孔的密度將HCECs細胞接種到 96孔板中.待細胞融合度達到70%～80%時,依次加入0(對照組, DMEM), 20, 40, 80,160, 320, 640μg/mL灰塵暴露液, 37 ℃ 5% CO2條件下暴露 24h后,倒置顯微鏡下觀察細胞形貌,并拍照.隨后吸出灰塵暴露液,加入 CCK-8細胞活力檢測試劑,在二氧化碳培養箱中孵育 4h,完成后用酶標儀在450nm波長下測定OD值,計算細胞活力以及半數致死濃度值(LC50),實驗時每種處理設置5個平行孔,并重復CCK-8細胞活力檢測實驗3次取平均值.

1.5 實時定量PCR技術分析炎癥基因表達

待6孔板中細胞鋪滿約80%皿底面積時進行不同濃度20, 40, 80, 160, 320, 640μg/mL灰塵暴露液染毒,染毒24h后進行總RNA提取.待總RNA提取完成后,使用翼飛雪生物科技 cDNA第一鏈快速合成試劑盒(去基因組)進行 cDNA 的合成,步驟如下:取1000ng RNA,配制20μL反應體系.反應條件: 37℃15min, 85℃ 5秒(反轉錄酶的失活反應), 4℃下保溫.待逆轉錄反應完成后,將cDNA稀釋5倍后按照試劑盒說明配制 20μL的 PCR反應體系.檢測目的基因IL-1β, TNF-α的表達水平,引物序列如表1所示,反應平臺為Roche LightCycler?480 Ⅱ,平行孔設置同1.4.中CCK-8細胞活力檢測相一致.

表1 促炎癥基因qRT-PCR引物序列分析Table 1 qRT-PCR primer sequences for pro-inflammatory genes analysis

1.6 數據統計分析

實驗數據通過(平均值±標準差)表示, GraphPad Prism 8軟件進行統計學分析,灰塵中重金屬總含量、不同粒徑重金屬含量以及目標重金屬溶出率實驗結果采用 Two-way ANOVA法, CCK-8細胞活力、細胞炎癥因子 IL-1β和 TNF-α實驗結果采用One-way ANOVA法比較有無顯著性差異,以上實驗結果若P<0.05,則認為差異有統計學意義.

2 結果與討論

2.1 昆明室內灰塵中重金屬含量特征

如表2所示,分別對昆明地區居民住宅(簡稱 R)、辦公室(簡稱O)及學生宿舍(簡稱D)<100μm 的混合灰塵中重金屬總量分別進行測定,其中居民住宅灰塵中目標金屬平均總含量為Cd (8.36mg/kg) < Co (13.6mg/kg)< As (15.7mg/kg) < Cr (47.5mg/kg) < Pb (114.5mg/kg)

表2 不同類型室內灰塵中重金屬總量及可溶解率Table 2 Total concentration and solubility of heavy metals in three indoor dust samples

昆明室內灰塵中重金屬Cd, Ni, Zn的平均總含量分別是云南省昆明市土壤背景值[40]的(R:52.3、O:39.3、D:28.8 倍); (R:4.5、O:9.5、D:5.9 倍); (R:10.7、O:12.3、D:11.2倍).經統計分析(Two-way ANOVA法),昆明市辦公室灰塵中Ni, Mn, Zn顯著高于居民住宅及學生宿舍(P<0.01),而其余金屬元素在各類型室內灰塵間的含量無顯著差異.此外,辦公室灰塵中的Cr和Pb都高于家庭和宿舍.相比其他兩個區域,辦公室空間更為密閉,空氣流動性差,同時該區域經常使用電腦和打印機[41],這些行為可能導致其灰塵中的重金屬 Cr, Pb含量高于家庭和宿舍.本文還比較了國內外各城市地區不同類型室內灰塵重金屬含量(表3),由于Co, As的相關研究較少,因此重點關注其余7種重金屬.Cr, Cu, Pb, Mn和Zn含量水平高于中國河北[22]及蘭州[42](除去Cr)、加拿大Toronto[43](除去Cu)等國內外城市.宿舍灰塵中Cr含量低于中國北京、蘭州,馬來西亞及印度等地[13,44-46].此外,本文區室內灰塵中Ni含量高于表3中所列國家和地區.有研究者認為不銹鋼器皿的使用和驅蚊線圈的燃燒可能是室內Ni濃度升高的原因之一[47-48].同時,粒徑也可能影響Ni在灰塵中的分布,例如Doyi等[16]發現Ni易富集在150μm粒徑以下.此外,家庭灰塵中Pb和 Zn含量水平低于中國合肥[14]、澳大利亞Sydney[30]、埃及 Alexandria[49]和俄羅斯Chelyabinsk[50]等地.以上 4個城市人口密度均大于昆明,大量的人口以及繁忙的交通可能會導致重金屬含量的增加.Alexandria是埃及最大的海港,該地區道路灰塵中 Pb的濃度達 260mg/kg.盡管埃及自2000年開始逐步淘汰含鉛汽油,但土壤中沉積的鉛可能會通過再懸浮進入該城市灰塵中.此外澳大利亞和埃及研究者[30,49]均認為房屋使用年限能夠影響室內灰塵重金屬含量分布.Sydney市中心房屋老舊,室內灰塵中 Pb濃度隨房齡增加而增加(r=0.510,P<0.001),同樣的Alexandria房屋居住年限在15～30a之間,舊房子內的油漆、地板及混凝土磨損風化可能導致重金屬的釋放.Praveena等[51]發現,墻壁油漆的顏色能夠顯著影響室內重金屬的含量,例如黃色油漆可能會導致Cd、Cu、Pb和Zn的含量增加,而綠色涂料則導致 Zn含量升高.問卷和實地調查發現,本文進行灰塵采樣房屋使用年限小于 5a,多為新建筑且墻體均為白色乳膠漆,因此昆明室內灰塵Zn含量低可能與此有關.

表3 昆明市室內灰塵中重金屬含量與國內外其他城市對比(mg/kg)Table 3 Comparison of heavy metals in indoor dust of Kunming and other cities from the published data (mg/kg)

續表3

2.2 灰塵人工淚提取液中重金屬溶出率

研究發現,被人體吸收的重金屬能夠造成細胞膜脂及蛋白質的氧化損傷,最終導致細胞死亡[52].前期研究發現,灰塵中并非所有的重金屬均會被人體利用和吸收[25].淚液是覆蓋于眼球前表面的一層液體,灰塵中的重金屬污染物可能通過淚液這一介質最終接觸到角膜上皮細胞,從而誘發潛在的毒性效應,然而尚未見灰塵中可溶出重金屬對人眼表健康影響的報道,且大多數針對灰塵毒性的研究均以重金屬總含量作為參考[53].為進一步了解金屬元素在淚液中的溶出率,本文測定了灰塵中重金屬在人工淚提取液中的可溶出濃度,結果如表2所示.3種不同類型灰塵中Cd、Cr、Cu、Mn、Ni在人工淚提取液中含量最高,且宿舍灰塵中的重金屬在人工淚模擬液中的溶出率隨著提取時間的增加而增加.通過分析每種目標金屬的生物可給性發現,宿舍灰塵提取24h后目標重金屬可溶解率由高到底依次為Mn(36.0%) > Cr (22.3%) > Cd (21.2%) > As (16.4%) >Zn (14.5%) > Cu (7.58%) > Ni (4.93%) > Co (3.42%)> Pb (2.54%).與宿舍不同,辦公室灰塵中目標重金屬的可溶解率分別為As (16.1%) > Cd (5.3%) > Co(3.99%) > Cr (3.92%) > Cu (3.88%) > Ni (2.71%) >Mn (1.86%) > Zn (0.02%) = Pb (0.02%).此外,灰塵提取24h后,居民住宅除As、Pb未溶出外,其余金屬元素溶出率為Co (10.6%) > Cr (7.82%) > Cu (7.62%) >Ni (4.12%) > Mn (2.34%) > Cd (1.41%) > Zn (0.67%),其趨勢與辦公室相似.此外,與相似研究作對比發現,辦公室和家庭灰塵人工淚提取液中 Ni、Cd、Cu、Zn等過渡金屬溶出量低于灰塵Hank’s水提取液[54],可能是由于溶出介質差異導致.可見本文中灰塵重金屬元素生物可給性均低于 36%,且可能以不同化學形態存在,如果以重金屬總含量進行相關毒性或健康風險評價可能會高估其風險.

2.3 不同粒徑室內灰塵中重金屬含量分布規律

通過激光粒度儀對昆明室內灰塵粒徑進行分析發現,辦公室灰塵中<63μm 粒徑占比為 61%,而500～150μm、150～63μm 各占 10%和 29%.居民住宅在 500～150μm、150～63μm 粒徑范圍占比相近(25.1%, 26.3%),<63μm 粒徑占 48.6%.然而宿舍粒徑分布與其他功能區有所區別,最大粒徑占比在500～150μm 范圍(39.3%),而 150～63μm 和 63μm 以下各占26.6%及34.1%.居民住宅、辦公室及學生宿舍灰塵中值粒徑分別為67.5, 53.6, 122μm.此外,據前人研究發現,室內灰塵的粒徑范圍從>2μm 到<63μm 不等,其中約三分之一的灰塵<500μm[41],本文結果與之相似.考慮到室內灰塵粒徑在100μm以下易被人體吸附[35],并可能對人體健康產生危害.鑒于此,本文將粒徑分為4個范圍(F1:100～2000μm,F2:75～100μm, F3:63～ 75μm, F4:45～63μm),并探討昆明市不同粒徑范圍室內灰塵中重金屬含量分布規律.粒徑作為表征灰塵理化性質的重要指標之一,粒徑間的差異可能會影響灰塵中重金屬含量的分布[58].通過 ICP-OES對不同粒徑灰塵中重金屬進行檢測發現, 9種重金屬在4個粒徑中均有檢出.由圖 1可看出,重金屬在各粒徑之間的分布規律較為多變,這與其他研究相一致[59],同時部分重金屬在不同粒徑上的分布呈現不規則的波動.居民住宅灰塵中的 Zn、Mn、Ni、Pb、Cr、Cd、Cu 在不同粒徑范圍差異不顯著.經分析可能由于本文中灰塵粒徑范圍之間相差較小,因此可能造成各重金屬元素在不同粒徑間含量差異不顯著.宿舍和辦公室灰塵中的Cr隨灰塵粒徑的減小而升高,這與曹治國等[44]對北京市海淀區室內灰塵中重金屬的研究結果相一致.辦公室及宿舍灰塵中Zn (857.7, 737.1mg/kg)、Mn(634.8, 367.6mg/kg)、Pb (163.51, 102.1mg/kg)、As(19.7, 18.5mg/kg) 4種元素易在 F2粒徑(75～100μm)上富集.而宿舍灰塵中 Cu (209.8mg/kg)和Ni(402.0mg/kg)則在 63～75μm 粒徑段達到峰值.本文結果還與McKenzie等[60]研究相一致,其認為地球化學組分中, 63μm 以下的灰塵易富集重金屬,同時在該粒徑范圍內觀察到Cr、Ni、Cu、Zn和Pb顯著富集.此外,<100μm 的灰塵顆粒易再懸浮到空氣中,由于人角膜上皮位置特殊,使得其長時間持續暴露在空氣中,容易受環境污染物,如大氣顆粒物、化學物質、病原微生物等因素影響,并引起一系列的并發癥(角膜炎、紅腫、角膜潰瘍、異物感等),嚴重情況下能夠導致失明[61].因此,選擇粒徑<100μm 室內灰塵進行角膜上皮細胞毒性效應研究.

圖1 重金屬在不同類型室內灰塵中的粒徑分布特征Fig.1 Heavy metals concentrations across 4size fractions of three types of indoor dust samples

2.4 辦公室灰塵人工淚提取液對角膜上皮細胞形態及活力影響

細胞形態改變是反映細胞生理功能紊亂和毒性的重要指標[62].本文發現, HCECs經辦公室灰塵人工淚提取液暴露后,通過顯微鏡觀察到隨暴露液濃度的增大,細胞形態由多邊形變為梭子形(圖2(a)～(d),可能導致上皮間質轉化的發生, HCECs轉化為更具移動能力的間質細胞[63].同時由圖 2(d)可看出細胞在 1280μg/mL濃度下,細胞縮小且部分細胞出現透明懸浮,提示細胞出現了死亡,有研究證明過度的炎癥會導致程序性細胞死亡[64].鑒于此,本文借助CCK-8細胞活力試劑盒分析了HCECs經灰塵人工淚提取液暴露24h后對其活力的影響.結果如圖2(e)所示,隨暴露液濃度的增加細胞活力呈濃度依賴性.低濃度下(20μg/mL, P<0.05)灰塵人工淚提取液能夠促進細胞增殖,可能原因是低濃度下能夠引起細胞的應激反應,并激活了細胞增殖的相關分子通路[65-67].然而在40～320μg/mL濃度下,細胞活力未受到明顯影響,可能原因是細胞受到刺激,激活了細胞的抵御機制,細胞通過自我調控來抵御外界不利刺激,處于動態平衡過程[25].而當暴露液濃度增加至1280μg/mL 時,細胞活力顯著降低(86.2±7.3)%, P<0.01,這可能是因為外界灰塵濃度過大,產生的不利刺激遠遠超過了細胞的自身抵御能力,從而出現細胞活力降低[68].類似地, Huang等[52]比較了室內灰塵(250～2000μg/100μL)水提取液對肝癌細胞(HepG2)、人皮膚角質層細胞(KERTr)和肺上皮細胞(A549)毒性的影響,發現隨著灰塵水提取物濃度的升高,細胞活力逐漸降低,并且對 KERTr細胞的抑制作用比HepG2和A549細胞更早出現.此外,有研究將PM2.5暴露于小鼠角膜上皮細胞,發現活細胞數呈濃度依賴性下降,當濃度為 25～200μg/mL 時,細胞存活率為80%～90%.即使在實驗最高濃度為 1200μg/mL 時,仍有60%的細胞存活[69].本文將細胞存活率與灰塵濃度進行非線性擬合,其中半數致死濃度(LC50)為2410μg/mL見圖2 (f).本文前期研究了南京室內灰塵水提取液對人角膜上皮細胞的毒性,其Hank’s灰塵水提取液暴露細胞24h后LC50為1278μg/mL[35],本文中LC50要大于其結果.灰塵中水溶性較好的重金屬能夠對細胞產生毒性作用[70],例如在細胞水平上,灰塵中包含Ni、Cd、Cu、Zn等過渡金屬,可能通過誘導活性氧的產生,破壞膜脂、蛋白質和 DNA,從而導致細胞死亡.由于本文中模擬人工淚提取液所溶出的重金屬低于Hank’s水提取液,因此誘導的毒性效應程度相對較低[35].也提示進行角膜毒性研究時,選擇接近角膜組織的人工淚液較其他介質提取更為合理準確.

圖2 辦公室灰塵提取液對人角膜上皮細胞形貌和活力的影響Fig.2 Effects of office dust extract on morphology and viability of Human corneal epithelialcells

2.5 辦公室灰塵人工淚提取液激活炎癥基因 IL-1β和TNF-α的表達

空氣污染物通過誘導炎癥因子基因過表達,從而引起眼表炎癥疾病,如角膜炎、結膜炎等[25-26].灰塵暴露細胞后也能夠引起促炎癥反應[71].然而人工淚液中生物可給態重金屬是否會激活炎癥基因表達仍然未知.本文將不同濃度 20,40,80,160,320,640,1280μg/mL辦公室灰塵人工淚提取液暴露 HCECs,并利用實時定量 PCR技術檢測分析典型眼表炎癥因子白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的基因表達水平變化.如圖3所示, IL-1β的mRNA相對表達量呈濃度依賴性,在40～640μg/ mL,分別增加3, 1.7和2.2倍.1280μg/mL濃度下其mRNA相對表達量顯著上調并達到最大值(16.68),與對照相比增加了16倍.而TNF-α在> 40μg/mL時出現濃度依賴性降低,分別降低 0.75～0.82倍,在最高濃度(1280μg/mL)時顯著增加至對照組的 2.4倍.本文中引起炎癥因子 IL-1β和TNF-α基因上調,可能是生物有效態重金屬誘發了細胞氧化應激反應,從而激活了下游的炎癥相關信號通路[72].IL-1β作為先天免疫反應的最重要的促炎因子,在眼科疾病的發病機制中起著重要的作用,其能促進細胞炎癥、細胞凋亡以及細胞外基質的積累[73].此外,灰塵中重金屬誘導的氧化應激通常會激活NF-κB和AP-1等轉錄因子,誘導炎癥因子(如 IL-1β)和趨化因子(如 TNF-α)的表達,從而引起炎癥反應[74].本文結果和以往報道有所差異, Xiang等[35]發現,灰塵水提液暴露人角膜上皮細胞后,僅在50μg/mL濃度時TNF-α的mRNA顯著升高,而 200,800,3200μg/mL 均下調.可能由于所用的提取液及灰塵樣品的不同,造成所溶出的污染物濃度間有差異,最終導致細胞應對污染物刺激的分子機制也有所差別.

圖3 辦公室灰塵提取液暴露后誘導人角膜上皮細胞炎癥相關基因表達Fig.3 Expression of inflammatory genes after office dust extracts exposure

3 結論

3.1 昆明市居民住宅、辦公室及學生宿舍室內灰塵中重金屬Zn(717.6, 825.5, 748.6mg/kg)平均含量最高, Cd平均含量最低(8.4, 6.3, 4.6mg/kg).辦公室灰塵中 Ni, Mn, Zn顯著高于居民住宅及學生宿舍(P<0.01),但其余6種金屬元素含量無明顯差異.此外,3種類型灰塵中Cd, Ni, Zn的含量均超過云南省昆明市土壤背景值.

3.2 室內灰塵中重金屬在人工淚提取液中的溶出率低于36%,居民住宅中Co (10.6%)、辦公室中As(16.1%)及學生宿舍中的Mn (36%)平均溶出率最高.宿舍灰塵中的重金屬溶出率隨提取時間的增加而增加,而居民住宅及辦公室灰塵中Co, As, Cr, Pb的溶出率無明顯的一致性規律.

3.3 Zn、Mn、Ni、Pb、Cr、Cd、Cu 在不同粒徑范圍(F1:100～2000μm, F2:75～100μm, F3:63～75μm,F4:45～63μm)差異不顯著.辦公室及宿舍灰塵中的Zn(857.7, 737.1mg/kg)、Mn(634.8, 367.6mg/kg)、Pb(163.51, 102.1mg/kg)、As(19.7, 18.5mg/kg)在75～100μm 粒徑段達到最高值,宿舍灰塵中 Cu(209.8mg/kg)和Ni(402.0)在63～75μm達到最高值.

3.4 灰塵人工淚提取液暴露人角膜上皮細胞 24h后,能夠引起HCECs細胞形貌由多邊形變為梭子形,灰塵暴露液濃度為 1280μg/mL時,細胞活力顯著降低(86.2±7.3)%,P<0.01,同時炎癥因子IL-1β和TNF-α基因出現上調.