溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體結構及理化特性的影響

劉煒熹 張業輝 張友勝 焦文娟 趙甜甜 周東來 黃利華 鐘偉銳

摘 要：研究烏鱧魚皮膠原蛋白肽在20～52 ℃低溫誘導下自組裝體的結構穩定性與理化性質，比較分析聚集體變化過程中圓二色譜、自組裝動力學、微觀結構、凝膠強度、粒徑、黏度、變性溫度和紅外光譜的變化。結果表明：在20～30 ℃溫度范圍內，升溫對烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝速率及聚集體穩定性具有促進作用，組裝成核時間縮短13.5 min，形成的三維網絡致密性增強，平均粒徑增大，凝膠強度從50.23 g/cm2升高至212.55 g/cm2（P<0.05），最大剪切黏度增加549.34%，β-折疊相對含量增加45.42%，膠原蛋白肽結構穩定性顯著增強;在30～52 ℃溫度范圍內，升溫促使纖維網絡結構發生溶解和絮集，凝膠強度降低97.87%（P<0.05），粒徑降低46.16%，最大剪切黏度和β-折疊相對含量降低;差示量熱掃描測定結果表明，聚集體自組裝程度越高，其熱穩定性越強。因此，適宜的溫度可有效改善烏鱧魚皮膠原蛋白肽纖維網絡的結構穩定性及理化性質。

關鍵詞：烏鱧魚皮膠原蛋白肽;溫度;自組裝;微觀結構;理化特性

Effect of Temperature on Aggregation Structure and Physicochemical Properties of Collagen Peptide from Snakehead Fish （Channa argus） Skin

LIU Weixi1， ZHANG Yehui1，*， ZHANG Yousheng1， JIAO Wenjuan1， ZHAO Tiantian1， ZHOU Donglai1， HUANG Lihua2， ZHONG Weirui3

（1.Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing， Key Laboratory of Functional Foods，

Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Sericulture and Agri-Food Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510610， China; 2.Department of Food， Guangzhou City Polytechnic， Guangzhou 510405， China;

3.Shanwei Wufeng Marine Biotechnology Co. Ltd.， Shanwei 516626， China）

Abstract： This study was designed in order to investigate the structure and physicochemical properties of self-assembled collagen peptide （CP） from snakehead fish skin induced by low temperatures 20–52 ℃ and to compare changes in circular dichroism （CD） spectra， self-assembly kinetics， microstructure， gel strength， particle size， viscosity， denaturation temperature and infrared spectra during the aggregation process. The results indicated that the increase of temperature in the range of 20–30 ℃ could promote the self-assembly rate and aggregate stability of CP， reduce the assembly nucleation time by

13.5 min， lead to the formation of a more compact three-dimensional network， increase the average aggregate size， raise the gel strength significantly from 50.23 to 212.55 g/cm2 （P < 0.05）， increase the maximum shear viscosity by 549.34% and β-sheet content by 45.42%， and significantly enhance the structural stability of CP. However， the increase of temperature in the range of 30–52 ℃ could facilitate the dissolution and flocculation of the fibrous network structure， decrease the gel strength by 97.87% （P < 0.05） and the average particle size of aggregates by 46.16% （P < 0.05）， and reduce the maximum shear viscosity and β-sheet content. Differential scanning calorimetric （DSC） results showed that the higher the degree of self-assembly， the stronger the thermal stability. In conclusion， the fibrous network structure stability and physicochemical properties of CP could be effectively improved at a suitable temperature.

Keywords： Channa argus skin collagen peptide; temperature; self-assembly; microstructure; physicochemical properties

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-115

中圖分類號：TS254.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）06-0001-09

引文格式：

劉煒熹， 張業輝， 張友勝， 等. 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體結構及理化特性的影響[J]. 肉類研究， 2021， 35（6）： 1-9. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-115.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LIU Weixi， ZHANG Yehui， ZHANG Yousheng， et al. Effect of temperature on aggregation structure and physicochemical properties of collagen peptide from snakehead fish （Channa argus） skin[J]. Meat Research， 2021， 35（6）： 1-9. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210428-115.? ? http：//www.rlyj.net.cn

我國水域遼闊，水產資源豐富，水產品總產量常年居于世界首位。2020年我國水產品總產量為6 545.02 萬t，

其中淡水產品總產量為3 234.64 萬t，同比增長約1.15%[1]。烏鱧（Channa argus）是我國主要淡水魚養殖品種，其肉質鮮美、營養價值高。在我國，多有術后患者和孕婦食用烏鱧的習慣，食用烏鱧可生肌活血、促進傷口收斂、加速表面傷口愈合[2]。烏鱧還具有增強記憶力和抗疲勞功效，體弱者食用烏鱧可快速恢復體力[3]。此外，烏鱧體表會分泌一種特殊黏液，不僅可以快速修復損傷表皮，還具有一定的抑菌活性。當前，烏鱧生產加工產品主要是凍魚片和生魚肉，在烏鱧加工過程中，魚皮、魚骨等加工副產物通常利用價值低，其中富含的生物活性成分未能得到有效的開發與利用。因此，提高加工副產物的利用率和利用價值，也是水產加工行業提高經濟利益的途徑之一。

膠原蛋白肽產量豐富，廣泛應用于食品、化妝品和醫藥等行業，不僅具有抗氧化、抗皺延衰、增強免疫力、降血壓血脂、美白肌膚和保濕鎖水等多種功效，且低溫條件下具有良好的生物活性。當前，已有關于膠原蛋白與溫度關系的研究。如許蓉等[4]研究不同溫度對雞胸軟骨Ⅱ型膠原蛋白溶液的影響，研究發現，膠原蛋白的黏度和結構與溫度呈現負相關關系，隨著溫度升高，膠原蛋白黏度減小，螺旋分解增加。Aukkanit等[5]研究不同提取溫度對銀線魚膠原蛋白自組裝纖維的影響，結果表明，10 ℃條件下提取的膠原蛋白不僅具有較高的自組裝率，而且自組裝纖維直徑更大。Zhu Shichen等[6]研究不同溫度條件下（20～37 ℃）草魚膠原蛋白的微流變學特性發現，升溫對膠原纖維網絡的形成具有促進作用，且纖維緊密性增強。當前有關溫度與烏鱧膠原蛋白肽自組裝關系的研究較少。因此，本研究采用烏鱧副產物魚皮制備膠原蛋白肽，探究不同溫度對膠原蛋白肽自組裝聚集體的結構穩定性及理化性質的影響，為膠原蛋白肽自組裝改性方面的進一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏鱧活魚（質量約500 g），購于廣州華潤萬家超市。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 福晨化學試劑有限公司;戊二醛、氫氧化鈉（均為分析純） 天津市大茂化學試劑廠;乙酸（分析純） 江蘇強盛功能化學股份有限公司;無水乙醇（分析純） 上海凌峰化學試劑有限公司;正丁醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司;胃蛋白酶 上海源葉生物科技有限

公司。

1.2 儀器與設備

JascoJ-815圓二色譜儀 日本分光公司;UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司;S-3400N掃描電子顯

微鏡 日本日立公司;WJL-628激光粒度分析儀 上海

儀電物理光學儀器公司;ST85B3-1真空冷凍干燥機 美國

Milirock公司;DSC200F3差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 德國Netzsch公司;AR-1500 EX流變儀 美國TA公司;LRH-250F生化

培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;VERTEX33傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司;TA-XT.Plus物性分析儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 烏鱧魚皮膠原蛋白肽的制備

參考文獻[7-9]的方法，首先將烏鱧魚皮洗凈切碎，以料液比1∶10（m/V）將魚皮加入0.1 mol/L NaOH中，反應24 h去除膠原蛋白中的色素和雜蛋白，魚皮取出后用超純水沖洗至中性并瀝干;以料液比1∶10添加體積分數10%正丁醇溶液，與魚皮混合反應24 h進行脫脂處理，取出魚皮，用超純水沖洗至中性后瀝干;再以0.5 mol/L乙酸作為溶劑，以料液比1∶10添加至瀝干后的魚皮中，提取膠原蛋白48 h，隨后將溶液

10 000 r/min、4 ℃離心20 min獲得上清液;向上清液中加入NaCl鹽析至出現沉淀，4 ℃、8 000 r/min離心10 min后取沉淀，以料液比1∶10用0.5 mol/L乙酸復溶，隨后采用去離子水（1∶50，V/V）透析24 h，將透析液凍干，獲得膠原蛋白。

將膠原蛋白復溶于0.1 mol/L乙酸后采用胃蛋白酶（酶比活力1∶3 000），10 ℃酶解2 h，獲得膠原蛋白肽溶液。

1.3.2 圓二光譜測定

將1.3.1節酶解所得質量濃度0.5 mg/mL膠原蛋白肽溶液在pH 4、不同溫度（20、25、30、37、42、52 ℃）條件下自組裝10 min后，分別移取300 μL膠原蛋白肽溶液于光程為1 mm的比色皿中，在波長190～260 nm、持續通入氮氣的條件下進行圓二光譜掃描，實驗重復2 次[10]。

1.3.3 濁度測定

參考賈俊強[11]、Leo[12]等方法并略作修改，使用紫外分光光度計測定不同溫度（4、20、25、28、30、37、42、52 ℃）條件下，pH 7、1 mg/mL膠原蛋白肽自組裝過程中吸光度。波長設為313 nm，將樣品放置于恒溫環境中，每隔1 min采集吸光度數據。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察不同溫度（20、25、30、37、42、52 ℃）條件下，pH 7、質量濃度10 mg/mL、自組裝10 min膠原蛋白肽凝膠的形貌與微觀結構。上機樣品參照Chen等[13]方法進行制備。

1.3.5 凝膠強度測定

參考宋曉敏等[14]的方法并略作修改，采用物性分析儀對不同溫度條件下，pH 7、質量濃度10 mg/mL、自組裝10 min膠原蛋白肽凝膠的凝膠強度進行測定，選用P/0.5圓柱探頭做穿刺實驗，參數設定為：觸發力5 g，測試前、測試中和測試后速率均為1.0 mm/s，應變50%。

1.3.6 粒徑測定

取等量的不同溫度條件下膠原蛋白肽溶液自組裝10 min后樣品，置于超純水中配制成質量濃度2 g/100 mL分散溶液，采用激光粒度分析儀測定膠原蛋白肽自組裝顆粒粒徑分布。

1.3.7 黏度測定

采用流變儀測定不同溫度條件下處理膠原蛋白肽凝膠的黏度（剪切應力）曲線。將3 mL pH 7、10 mg/mL膠原蛋白肽溶液置于測試平臺上，測定條件設置為平板直徑40 mm，測試前溫度20、25、30、37、42、52 ℃，測試前平衡時間（自組裝時間）5 min，平衡后將溫度設為常溫25 ℃，在剪切速率為0.01～0.1 s-1變化范圍內測定黏度變化[15]。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜測定

將不同溫度條件下自組裝膠原蛋白肽樣品凍干后分別與KBr混合，樣品（1～2 mg）與KBr質量比1∶100，在4 000～400 cm-1范圍內測定樣品傅里葉變換紅外光譜[10]。

1.3.9 熱變性溫度測定

參考Jolanta等[16]方法，將烏鱧魚皮膠原蛋白肽溶液在不同pH值（pH 4、6、7、8、9、10）、溫度30 ℃條件下自組裝1 h處理樣品冷凍干燥后，以空的鋁制坩堝作為對照。DSC測定方法：準確稱取10 mg膠原蛋白肽凍干樣品，用20 μL超純水充分溶脹24 h（4 ℃），溫度掃描范圍為20～60 ℃，升溫速率2 ℃/min，樣品室氮氣流速20 mL/min。

1.4 數據處理

采用SPSS v26.0軟件進行數據處理和結果分析，結果表示為平均值±標準差;紅外光譜圖使用PeakFit 4.12軟件進行數據處理;圓二色譜數據采用Prodata軟件處理;所有數據圖均采用Origin 9.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽圓二色譜的影響

RPN. 正吸收峰與負吸收峰的比值（ratio of positive to negative）。

圓二色譜通過測定生物大分子物質的手性結構產生的左右旋光差異吸收來分析生物分子結構，可用于分析膠原蛋白肽鏈三螺旋結構[17]。由圖1可知，膠原蛋白肽存在2 個極為明顯的吸收峰，其中195～205 nm有一個負吸收峰，215～225 nm存在一個正吸收峰，這是膠原蛋白肽三螺旋結構在圓二光譜圖中的吸收性質[18]。其中，RPN與膠原蛋白的螺旋程度呈現正相關[11]，反映了膠原蛋白肽分子中的螺旋區域與非螺旋區域的相對含量[19]。不同溫度條件對峰值具有一定的影響，膠原蛋白肽在20、25、30 ℃條件下的圓二色譜圖與RPN變化并不明顯，說明在此溫度下膠原蛋白肽鏈仍保持良好的三螺旋結構，但隨著溫度的升高，其負吸收峰逐漸增大，說明在達到變性溫度前，升溫可促進膠原蛋白肽自組裝，在保持原有結構的條件下，自組裝有利于膠原蛋白結構的穩定。當溫度處于37 ℃時，其負吸收峰峰值明顯增加，正吸收峰消失，RPN驟然下降，說明在該溫度下，膠原蛋白肽三螺旋結構已經完全打開，此時膠原蛋白肽鏈為松散的3 條亞基鏈[20]。原因可能是由于溫度達到了膠原蛋白肽的變性溫度，膠原蛋白肽三螺旋結構因溫度的升高而分解，變得松散，相比于37 ℃圓二光譜吸收曲線，42 ℃及52 ℃處理時變化并不明顯，可能是膠原蛋白肽處于某一溫度范圍，某部分結構受到溫度影響較為明顯，但其結構的進一步崩解需要更高的溫度。這說明高溫長時間處理會引起膠原蛋白肽解螺旋，出現三螺旋向單體的轉變，最終可能引起烏鱧皮膠原蛋白肽的自組裝方式發生變化。

2.2 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝速率的影響

不少研究者[21-22]認為，膠原蛋白肽自組裝過程可在波長313 nm條件下進行檢測，通過313 nm波長處的吸光度變化來反映不同外界條件下膠原蛋白肽自組裝過程所需時間長短。由圖2可知，烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝過程吸光度變化曲線為S型，其自組裝過程分為成核期（吸光度增加緩慢）、生長期（吸光度快速增加）和平衡期（吸光度不變）3 個階段[12，23]。20 ℃條件下膠原蛋白肽成核時間（18.5 min）明顯長于其他溫度條件下的成核時間，且隨著溫度的升高（20～52 ℃），自組裝所需成核時間逐漸縮短，生長期斜率增大，組裝效率增加;這是由于膠原蛋白肽是一種兩親性分子，在氫鍵作用下分子表面形成水合層，當溫度較低時，分子間運動遲緩，水分子無法突破氫鍵的作用，水合層阻隔了膠原蛋白肽分子間的聚集，從而抑制自組裝的進行[24]，而升溫可提升分子運動能力，增大分子碰撞幾率，導致水層破壞，使得更多活性基團暴露，從而促進膠原蛋白肽分子間的自組裝[25]。

但當溫度超過膠原蛋白肽變性溫度（32 ℃）時[26]，

平衡期吸光度出現降低，42 ℃處理的膠原蛋白肽最大吸光度為1.912，明顯低于非變性溫度下的吸光度，且其吸光度持續下降，而52 ℃處理的膠原蛋白肽最大吸光度為0.977，在超過變性溫度條件下仍存在吸光度升高的現象，這可能是在升溫（5～52 ℃）過程中，膠原蛋白肽分子發生變性需要一定的時間，故樣品仍出現短時間的自組裝聚集現象?？梢姡瑸貅k魚皮膠原蛋白肽擁有較低的變性溫度，當超過變性溫度時，吸光度雖然仍在增加，但纖維生長的同時帶來纖維的崩解，當纖維崩解速率大于纖維生長速率時，吸光度降低。

2.3 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體微觀結構的影響

A. 20 ℃;B. 25 ℃;C. 30 ℃;D. 37 ℃;E. 42 ℃;F. 52 ℃。

由圖3可知，不同溫度條件對烏鱧魚皮膠原蛋白肽三維網絡的結構形貌影響不同。當溫度為20 ℃時，膠原蛋白肽自組裝緩慢，形成凝膠程度不高，凝膠纖維直徑及密度較后期組裝的凝膠纖維相對較小，這是由于溫度過低，膠原蛋白肽分子運動速率較低，自組裝動力不足導致。隨著溫度的升高（20～30 ℃），膠原蛋白肽三維網絡結構得到明顯的改善，其表面變得平滑、均勻，孔隙變小，三維網絡結構變得更為有序和致密。但隨著溫度的繼續升高（30～37 ℃），有序纖維結構向無序轉變，這是由于烏鱧魚皮膠原蛋白肽到達變性溫度所導致，而Liu Wentao等[26]測得烏鱧魚皮膠原蛋白溶液的變性溫度為32 ℃，說明膠原纖維聚集，逐漸靠攏，以抵抗高溫帶來的蛋白變性。當溫度繼續升高至42 ℃，纖維結構孔隙增大，表層纖維由于高溫發生溶解，纖維直徑變細，未溶解纖維靠攏，無序結構增多;當溫度達到52 ℃，纖維結構逐步崩潰，大部分纖維溶解及形成絮狀結構，該現象與高昕等[27]關于刺參膠原纖維在變性溫度條件下出現的現象基本一致，這是由于高溫部分破壞了膠原纖維的三螺旋結構，纖維間的共價鍵遭到破壞，纖維變性收縮發生聚集，膠原蛋白肽凝膠網絡被破壞。該結構變化與吸光度變化規律相符，蛋白質纖維的形成有其最適溫度，如乳清蛋白纖維形成的最適溫度為178 ℃[28]，膠原蛋白肽自組裝最適溫度應為30 ℃，適宜的溫度條件下可以增強膠原蛋白肽分子的運動能力，使其突破水合層，有助于纖維間氫鍵、二硫鍵等次級結構的進一步形成，提高組裝效率的同時，還能提高結構的緊密性，而過低溫度會抑制膠原蛋白肽纖維的形成，過高的溫度則會導致蛋白質的變性。

2.4 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽凝膠強度的影響

凝膠強度是用于表征蛋白質凝膠特性的重要指標，凝膠強度的大小可反映蛋白凝膠網絡結構的質量，與蛋白聚集程度及蛋白聚集體大小緊密相關[29]。由于烏鱧膠原蛋白肽自組裝形成的凝膠具有一定的彈韌性，可以承受一定的外部壓力，可根據凝膠所能承受的極限壓力測定其凝膠強度大小[30]。

小寫字母不同，表示不同溫度條件下

同一指標間差異顯著（P<0.05）。圖6同。

由圖4可知，烏鱧魚皮膠原蛋白肽凝膠破斷力、破斷距離及凝膠強度隨著溫度的持續升高均呈現先升高后降低的趨勢，隨著溫度的升高（20～30 ℃），聚集體凝膠強度從50.23 g/cm2顯著升高至212.55 g/cm2（P<0.05），由于溫度的升高有助于膠原蛋白肽分子間的運動，增加了膠原蛋白肽分子的碰撞幾率，促進了膠原蛋白肽分子間的二硫鍵、氫鍵等次級結構的形成，從而促進膠原蛋白肽的自組裝，未聚集的膠原蛋白肽分子聚集率增加，凝膠化程度增加。隨著溫度的繼續升高（30～52 ℃），膠原蛋白肽凝膠強度從212.55 g/cm2顯著降至4.52 g/cm2（P<0.05），而膠原蛋白肽聚集體的破斷力也出現相同的變化趨勢，這也說明膠原蛋白肽凝膠網絡結構在超過變性溫度32 ℃[26]情況下，內部出現了部分坍塌[31-32]。膠原蛋白肽在30 ℃條件下凝膠強度最高，該條件更有助于膠原蛋白肽的自組裝。處理溫度決定了膠原蛋白肽的變性程度和熱聚集體含量，影響參與凝膠網絡結構的膠原蛋白肽分子的數量，從而影響膠原蛋白肽聚集體的凝膠強度[33]。

2.5 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽黏度的影響

由圖5可知，不同溫度處理條件下烏鱧魚皮膠原蛋白肽均呈現出剪切變稀現象，表現為典型非牛頓流體的假塑性流動行為，與前人研究[34-35]結果一致。低剪切速率下，膠原蛋白肽聚集體的剪切黏度均出現了短暫升高，這是由于膠原蛋白肽自組裝形成纖維空間網絡結構在受力形變前產生的阻力作用，從而導致黏度出現短暫增加[36]。當剪切力達到一定程度時，纖維網絡結構逐步潰散，黏度降低，從而表現為剪切稀釋。

不同溫度下自組裝膠原蛋白肽聚集體的黏度存在一定差異。隨著溫度的升高，聚集體的初始黏度與最大黏度均呈現出先升后降的趨勢，導致其黏度增大的原因是溫度升高促進分子間運動，分子間碰撞加劇，水化層的破壞使得更多的疏水基團結合，膠原蛋白肽分子相互纏結，形成更為穩定的聚集體[37]，而膠原蛋白肽微觀纖維網絡緊密性和穩定性的改變決定了宏觀黏度的變化[38]，30 ℃條件下的膠原蛋白肽黏度較大，說明其聚集程度較高，與微觀結構及凝膠強度的測定結果相互印證，由于膠原蛋白肽自組裝有其最適溫度，故在30 ℃左右的條件下，膠原蛋白肽聚集體纖維緊密性最高，在剪切力作用下，其產生的黏度更高。而繼續升溫黏度降低是由于高溫導致膠原蛋白肽變性，從微觀結構可以看出，纖維結構發生解聚或溶解，三維網絡結構的緊密性降低，使得膠原蛋白肽的剪切阻力下降，最終導致黏度降低。

2.6 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽粒徑的影響

顆粒的粒徑大小反映了膠原蛋白肽的聚集程度。由圖6可知，溫度對膠原蛋白肽自組裝聚合物粒徑大小具有一定的影響，隨著溫度的升高（20～52 ℃），膠原蛋白肽自組裝顆粒粒徑呈先增加（由112.56 ?m增加至184.52 ?m）后降低（由184.52 ?m降低至99.34 ?m）的趨勢，在30 ℃時，膠原蛋白肽聚集體的平均粒徑達到最大值184.52 ?m，說明膠原蛋白肽在該溫度條件下形成的聚集體結構最為穩定，該變化趨勢與王艷[39]對不同溫度草魚皮膠原蛋白粒徑變化的研究相符，但其測得最適溫度為35 ℃，這可能是由于膠原蛋白的種類不同導致。在30～52 ℃溫度范圍內，膠原蛋白肽聚集體的粒徑逐漸減小，這是由于膠原蛋白肽變性溫度條件下，形成自組裝聚集體結構的共價鍵及非共價鍵因高溫遭到破壞，膠原蛋白肽纖維結構發生解聚，維持膠原蛋白肽三螺旋結構的非共價鍵也遭到破壞，聚集結構溶解，膠原蛋白肽聚集體粒徑隨之降低[40-41]。因此，適宜的處理溫度有利于形成更為穩定且凝膠強度更好的聚集體。膠原蛋白肽自組裝有其較為適宜的溫度，過低的溫度會影響膠原蛋白肽自組裝速率或導致組裝停滯，而過高溫度可使膠原蛋白肽變性，從而導致膠原蛋白肽聚集程度降低，顆粒粒徑下降。

2.7 溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體二級結構的影響

A. 4 ℃;B. 20 ℃;C. 25 ℃;D. 30 ℃;E. 37 ℃;F. 42 ℃;G. 52 ℃。

圖7為不同溫度條件下烏鱧膠原蛋白肽自組裝聚集體的紅外圖譜。蛋白質中的C=O、N-H和C-N的振動方式與其二級結構有關，多個紅外波段可用于反映鍵振動方式，其中，酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）

可反映C=O的伸縮振動[42]。因此，本研究對不同溫度條件下烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝聚集體的酰胺Ⅰ帶進行分析，研究溫度對烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝聚集體二級結構的影響。其中，β-折疊所處波段為1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1，無規則卷曲為1 637～1 645 cm-1，α-螺旋為1 646～1 664 cm-1，β-轉角為1 664～1 681 cm-1[43]。

由表1可知，自組裝對烏鱧魚皮膠原蛋白肽二級結構相對含量影響顯著（P<0.05），從Fan Daidi等[44]研究可知，膠原蛋白最低自組裝溫度約為22 ℃，達到該溫度時，膠原蛋白才會發生自組裝，因此，4 ℃條件下的烏鱧魚皮膠原蛋白肽并未發生自組裝反應，但由于上述研究采用的膠原蛋白為類人膠原蛋白，與本研究不同，所以最低自組裝溫度可能存在差異。相較于4 ℃條件下的烏鱧魚皮膠原蛋白肽，20 ℃自組裝烏鱧魚皮膠原蛋白肽β-折疊相對含量無顯著變化，但無規則卷曲相對含量顯著降低22.66%（P<0.05），α-螺旋相對含量顯著增加22.08%（P<0.05），表明膠原蛋白肽在該溫度條件下可能已發生自組裝反應。研究[45-47]表明，蛋白質自組裝可促使二級結構由無序狀態向有序狀態轉變，其中大量無規則卷曲形成β-折疊，凝膠纖維網絡逐步形成。β-折疊是多肽自組裝納米纖維的重要組成部分，其相對含量的升高表明更多納米纖維的形成。隨著溫度的持續升高，β-折疊相對含量先增加后降低，這是由于非變性溫度條件下，升溫有助于更穩定的纖維結構的形成;當溫度到達37 ℃時，β-折疊相對含量出現降低，且隨著溫度的繼續升高，

β-折疊相對含量持續降低，表明膠原蛋白肽自組裝纖維結構難以抵抗變性溫度的作用，其有序的β-折疊結構逐步向無規則卷曲轉變。

2.8 烏鱧魚皮膠原蛋白肽聚集體熱變性溫度分析

由圖8可知，不同pH值條件下烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝后的DSC圖譜中存在一個明顯吸熱峰，這主要是膠原蛋白肽鏈螺旋結構分解的吸熱行為，該峰值溫度為烏鱧魚皮膠原蛋白肽的熱變性溫度（Td）[48]。pH值為4的條件下，烏鱧魚皮膠原蛋白肽Td為33.8 ℃，稍高于Liu Wentao等[26]

采用烏鱧魚皮膠原溶液測得的32 ℃，導致該情況的原因是由于本研究采用超純水溶脹不同pH值條件下自組裝的膠原蛋白肽24 h，使得膠原蛋白肽分子之間更為接近，膠原蛋白肽的熱穩定性增強。自組裝程度較高的膠原蛋白肽（pH 6～10）的熱穩定性高于自組裝程度較低的膠原蛋白肽（pH 4），這是因為pH 4條件下的膠原蛋白肽多以單分子的形式存在，化學鍵及次級結構之間的結合較少，而自組裝程度較高的膠原蛋白肽形成了有序的三維網絡纖維結構，提高了膠原蛋白肽分子間及分子內的交聯程度，對高溫帶來的變性起到一定的抵抗作用，因此pH 6～10條件下膠原蛋白肽熱穩定性更高[49]。此外，不同pH條件下膠原蛋白肽自組裝結構的變性溫度隨著pH值的增加呈現先升后降的趨勢，pH 8條件下達到最大值，變性溫度為54.1 ℃，高于其他溫度條件下自組裝的膠原蛋白肽，這是由膠原蛋白肽自組裝程度所決定，當膠原蛋白肽pH值逐漸接近8時，膠原蛋白肽更接近于等電點，電荷趨向于零，阻礙膠原蛋白肽自組裝的阻力減小，自組裝程度更高，因而膠原蛋白肽自組裝形成的聚集體結構更為穩定。

3 結 論

在20～52 ℃時，烏鱧魚皮膠原蛋白肽自組裝速率和溫度呈正相關，可通過改變溫度影響自組裝速率。然而，膠原蛋白肽聚集體三維纖維網絡緊密性隨溫度的升高先增大后降低，與其凝膠強度、粒徑、黏度和二級結構中β-折疊相對含量隨溫度的變化規律相一致，其中30 ℃條件下膠原蛋白肽自組裝聚集體各項指標達到最大值，表明該溫度條件下烏鱧膠原蛋白肽自組裝聚集體結構穩定性最強。膠原蛋白肽聚集體結構相比未組裝的膠原蛋白肽熱穩定性更強，當溫度高于膠原蛋白肽變性溫度時，其三螺旋結構發生解旋，纖維網絡結構潰散。因此，可以通過改變溫度的方式提高自組裝效率，得到聚集程度更為緊密、結構穩定性更強的膠原蛋白肽聚集體。由于膠原蛋白肽具有良好的生物相容性和低致敏性，使其在藥物緩釋方面具有一定的研究前景，可在藥物載體的應用方面開展進一步探索。

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