北盤江光唇裂腹魚種群基因組DNA遺傳多樣性的AFLP分析

楊 偉，代應貴，2，安丹丹，韓虎峰

（1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州大學特種水產研究所，貴陽 550025）

光唇裂腹魚（Schizothorax lissolabiatus），隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）裂腹魚亞科（Schizothoracinae）裂腹魚屬，分布于元江、瀾滄江、怒江和珠江水系南北盤江等地［1－2］，為產地名優野生經濟魚類。近年來，光唇裂腹魚棲息地遭到破壞，人類活動對其造成了不利影響［3］。

遺傳多樣性通常是指種內的遺傳多樣性，即種內個體之間或一個群體內不同個體遺傳變異的總和［4］。遺傳多樣性是評價物種資源狀況的一個重要指標，是物種適應周圍環境變化、維持生存和進化的物質基礎［5］。以DNA為模板的分子標記技術，通過對物種基因的掃描，能夠直接反映DNA序列的差異（多態性），具有穩定、高效和準確等優點而被廣泛用于物種資源評價、遺傳變異規律分析、輔助育種等［6－8］。AFLP分子標記結合了RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性，多態性強，分辨率高，獲得信息量大，用較少的引物組合即可獲得準確的遺傳信息，尤其適用于研究背景模糊、材料來源廣泛等物種遺傳資源的標記分析［8］。該技術現已被廣泛應用于動植物的遺傳圖譜構建、種質鑒定、遺傳多樣性分析等研究［8－10］。

北盤江是珠江水系西江上源紅水河的主要支流。目前，光唇裂腹魚在北盤江僅見于上游可渡河［3］。本研究通過對北盤江光唇裂腹魚種群全基因組DNA進行AFLP分析，以期揭示該種群遺傳結構及遺傳多樣性的現狀，為開展其野生資源保護和種質資源開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

本研究所用試驗魚于2010年7月采自珠江水系北盤江可渡河自楊柳至都格河段，用刺網每隔7 km捕撈7～8尾光唇裂腹魚，共計30尾魚。試驗魚體長108～258 mm，體質量23.6～273.0 g。取魚體背部肌肉用無水乙醇保存并帶回實驗室備用。

1.2 模板DNA的提取

1.3 AFLP分析

1.3.1 引物接頭與引物組合信息

本次實驗所用的引物組合由作者自行設計并委托上海生物工程技術服務有限公司合成，經過初篩，選用8個引物組合對北盤江光唇裂腹魚種群全基因組DNA進行AFLP分析（表1）。

表1 北盤江光唇裂腹魚種群AFLP分析所用引物組合Tab.1 Primer pairs used in AFLP analysis for Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

1.3.2 AFLP分析

反應體系中所用的內切酶為EcoRI和MseI。酶切與連接反應同時進行。預擴增反應體系共計25μL，包括模板DNA 2μL，Pre-ampmix 1μL，dNTPs 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 18μL，PCR反應程序：94℃2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃80 s（30個循環）；72℃5 min。將預擴增產物1∶20稀釋后作為選擇性擴增模板，選擇性擴增反應體系共計25μL，包括2μL稀釋后的預擴增產物，雙蒸水17.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，EcoRI引物1μL，MseI引物1μL，dNTPs 0.5μL和Taq DNA聚合酶0.5μL，PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，50～60℃退火45 s，72℃延伸1 min，32個循環；72℃終延伸10 min，12℃冷卻10 min。PCR產物4℃保存。

采用貝克曼庫爾特公司CEQ8000遺傳分析系統，運用熒光標記技術和毛細管電泳分離技術，將PCR產物在毛細管中電泳分離，以激光激發熒光采集數據，電泳結果通過軟件自動統計分析并轉換成“0、1”矩陣，保存于EXCEL表格供數據處理。

1.4 數據處理

利用POPGENE3.2軟件統計位點總數、多態位點數、多態位點比例（P），并計算觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei遺傳多樣性指數（H）、Shannon信息指數（I）。用NTSYS2.10軟件計算30尾個體間遺傳相似性系數（S），根據NEI和LI［11］的方法計算遺傳距離：D＝1－S。基于個體間遺傳距離矩陣，采用Mega6軟件構建種群個體的UPGMA、NJ系統樹。用Excel表統計顯性位點數據，進行顯現基因型頻率構圖分析。

2 結果與分析

2.1 AFLP擴增結果

北盤江30尾光唇裂腹魚中，每個引物組合擴增片段數在8～73之間，擴增片段長度為69～500 bp（圖1），個體基因型數為28～30個、平均29.5個（表2）。

圖1 引物組合8擴增的北盤江光唇裂腹魚種群DNA指紋圖譜Fig.1 Electrophoretogram of PCR products by AFLP primer pair 8 in Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

2.2 種群遺傳多樣性

北盤江30尾光唇裂腹魚總計擴增出975個有效位點，其中多態位點數897個，多態位點占總位點數的比例為92.00%（表3）。每個引物組合總擴增位點數為98～151個，平均121.88個；擴增多態位點為93～140個，多態位點比例為79.67%～95.76%，每個引物組合平均多態位點比例為91.23%。8個引物組合擴增共有位點數為5～25個，平均10.88個。

3.流程設計缺乏嚴謹性。內部控制體系的核心設計師流程設計，企業根據在運營過程中所遇到的風險，制定科學合理有效的控制活動，這有利于企業設計合理的可以預防風險的業務流程。但是，目前我國公立醫院的運營現狀來看，醫院內部各部門之間權責不明、權責一體化。公立醫院為了方便業務的執行，使得各部門之間未能相互制約，導致醫院在業務執行過程中工作人員有徇私舞弊的現象出現。所以，醫院在經營發展過程中要完善流程設計，根據實際所遇到的風險制定科學有效的控制活動。

基于8個引物組合的擴增結果，北盤江光唇裂腹魚種群觀測等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Nei遺傳多樣性指數（H）和Shannon信息指數（I）平均值分別為1.912 3、1.369 0、0.227 1和0.357 5（表3）。

表3 光唇裂腹魚遺傳多樣性參數Tab.3 Genetic diversity of Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

根據8對擴增引物組合擴增出的975個位點，將30尾光唇裂腹魚擴增位點的顯性基因型頻率以10%為單位劃分為10個區間：1%～9%、10%～19%、20%～29%、30%～39%、40%～49%、50%～59%、60%～69%、70%～79%、80%～89%、90%～99%和0、1兩個關鍵點（圖2）。在關鍵點0擴增位點數出現峰值，在60%～69%區間擴增位點數呈現最低值。

圖2 擴增位點數在不同顯性基因頻率區間內的分布Fig.2 Number of AFLP amplified locus in different intervals of occurency frequency of locus in Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

2.3 遺傳距離和系統樹

北盤江光唇裂腹魚種群30尾個體間遺傳距離為0.214 7～0.410 9，平均為0.304 0。

基于個體間遺傳距離對北盤江30尾光唇裂腹魚進行聚類分析，結果顯示采用UPGMA法和NJ法構建的系統樹具有相似的拓撲結構，即30尾光唇裂腹魚均聚為兩支（圖3，圖4）。在UPGMA系統樹中，一支由25個個體組成，另一支由5個個體組成；在NJ系統樹中，一支代表24個個體，另一支代表6個個體。

圖3 30尾光唇裂腹魚UPGMA系統樹Fig.3 UPGMA phylogenetic tree of 30 individuals of Schizothorax lissolabiatus from the Beipan River

圖4 30尾光唇裂腹魚NJ系統樹Fig.4 NJ phylogenetic tree of 30 individuals of Schizothorax lissolabiatus from the Beipan River

表2 8個AFLP引物組合的擴增結果Tab.2 AFLP amplification results by 8 primer pairs in Schizothorax lissolabiatus population from the Beipan River

3 討論

3.1 北盤江光唇裂腹魚種群的遺傳多樣性與保護

一個群體（或物種）遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，表明其對環境變化的適應能力越強，越容易擴展其分布范圍和開拓新的環境［5］。群體遺傳多樣性每損失10%，就會對其繁殖能力、存活率、生長等重要生理性狀產生極大的負面影響［12］。因此，對遺傳多樣性的研究，不僅可以了解物種的進化歷史，也可以為分析物種的進化潛力和預測物種發展方向提供重要依據。

多態位點比例（P）和Nei遺傳多樣性指數（H）是評價物種遺傳多樣性的重要指標［13］。本研究中，北盤江光唇裂腹魚種群的多態位點比例（P）、觀測等位基因數（Na）、Nei遺傳多樣性指數（H）、Shannon信息指數（I）分別為91.23%、1.912 3、0.227 1和0.357 5（表3），高于同屬的齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）大渡河種群、雅礱江種群、青衣江雅安多營種群和寶興種群（P＝67.95%～77.94%）［14］、昆 明 裂 腹 魚（Schizothorax grahami）六沖河群體（P＝60.63%）［15］，略低于瀾滄江中上游光唇裂腹魚4個地理群體（Na＝2，H＝0.286 8～0.324 8，I＝0.426 9～0.481 1）［16］，而與已被證實遺傳多樣性較高的烏江四川裂腹魚（Schizothorax kolzovi）群體（P＝92.99%，H＝0.212 2）［17］處于同一水平。可見，北盤江光唇裂腹魚種群具有較為豐富的遺傳多樣性，種質資源較佳。

然而，韓虎峰和代應貴［3］基于線粒體DNA控制區序列分析表明，珠江水系光唇裂腹魚種群遺傳多樣性較貧乏，本文研究的結果與之相反。類似地，基于RAPD［18］、線粒體控制區［19］、Cyt b基因［20］及AFLP［21］等不同分子標記，對大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）群體遺傳多樣性的研究也得出了相反的結論，推測這可能是因為不同標記的DNA分子大小、進化速率及多態位點信息等存在差異的結果。本研究中，珠江水系北盤江光唇裂腹魚種群采用AFLP檢測顯示了較高的遺傳多樣性，而韓虎峰和代應貴［3］采用線粒體DNA控制區測序方法檢測卻表明該群體遺傳多樣性貧乏。其原因可能是由于本研究檢測的是種群全基因組DNA的變異水平，而韓虎峰和代應貴［3］則僅僅檢測了該種群線粒體DNA控制區部分序列（481 bp）的變異結果，顯然本文的研究結果更為可信。

有效等位基因數（Ne）是衡量群體遺傳變異程度的指標。有效等位基因數（Ne）與觀測等位基因數（Na）之間的差異，能說明某等位基因在群體內分布的均勻程度。Ne與Na之間的差異越小，表明該等位基因在群體內分布的均勻度越高［7］。本研究中，8個引物組合Ne的范圍為1.269 5～1.425 1、平均為1.369 0，Na的范圍1.796 7～1.957 6、平均為1.912 3（表3），顯示兩者之間差異較大，表明該群體中等位基因分布的均勻度較低，可能存在著等位基因丟失的現象，也表明北盤江光唇裂腹魚群體個體間基因交流較弱。Shannon信息指數（I）是反映群體離散程度的一個重要指標，Shannon信息指數的變化范圍通常在1.5～3.5［7］。本研究中，北盤江光唇裂腹魚群體Shannon信息指數（I）的平均值為0.357 5（表3），顯著低于正常值范圍，說明光唇裂腹魚北盤江種群遺傳變異離散程度較低。

光唇裂腹魚為偏r-型物種［22］，這類魚類種群結構簡單，世代交替快，更新能力強；但易受環境影響，資源穩定性較差［23］。多年來，北盤江干流梯級水電開發建壩［24］，使河流變成了靜水或緩流，阻斷了魚類的洄游通道，從而對適應于流水洄游生活的光唇裂腹魚產生了不利影響。韓虎峰和代應貴［3］研究表明，光唇裂腹魚在北盤江干流因支流革香河洗煤污水匯入而僅見于上游可渡河，種群數量減少?？梢姡|污染是破壞北盤江光唇裂腹魚資源的重要因素。同時，北盤江沿岸漁民的酷漁濫捕也嚴重影響了該河流的野生魚類資源，導致其魚類種群個體明顯小型化［25］，進而對河流中光唇裂腹魚種群造成了威脅。

綜上所述，盡管北盤江光唇裂腹魚種群目前仍具有較豐富的遺傳多樣性，但因其自身的生態類型以及梯級電站建壩、水域污染和過度捕撈等因素的影響，該種魚類在北盤江分布區已縮小，資源受到了威脅，遺傳變異離散程度較低，存在著等位基因丟失的現象。因此，需要開展北盤江水域污染治理、加強漁政執法實行禁漁、減少北盤江流域水電站的修建及設置水電站過魚通道、加大對北盤江光唇裂腹魚資源監測的力度、實施北盤江光唇裂腹魚人工增殖放流、設立北盤江光唇裂腹魚自然保護區等措施，以保護和恢復北盤江光唇裂腹魚野生資源和種群遺傳多樣性。

3.2 北盤江光唇裂腹魚種群系統樹分析

韓虎峰和代應貴［3］構建了珠江水系光唇裂腹魚可渡河種群mtDNA單倍型NJ分子系統樹，其所屬的40尾光唇裂腹魚被分為兩支，推測該群體可能源于2個母系或兩個繁殖群體。王緒禎等［26］研究表明，青藏高原特有的多倍體化裂腹魚類包含了兩個獨立起源的類群。本研究中，光唇裂腹魚為六倍體［26］，基于個體間遺傳距離構建的北盤江光唇裂腹魚種群UPGMA和NJ系統樹具有相似的拓撲結構，其所屬的30尾光唇裂腹魚聚為兩支，顯示北盤江光唇裂腹魚種群可能源于具有不同親緣關系的兩個亞群體。

3.3 本研究中AFLP標記結果的的可靠性

AFLP標記多態性條帶比例高，實驗結果較穩定，不受基因組來源和復雜程度的影響，適用于檢測親緣關系較近的生物材料之間的遺傳差異［27］。楊彥平等［28］采用AFLP技術對長江靖江段鰻鱺（Anguilla japonica）種群遺傳多樣性進行了分析，結果表明其多態位點比例高達95.06%。葉寧等［29］對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）7個群體遺傳多樣性的AFLP分析中，7個引物組合擴增出的多態位點比例為85.71%。基于AFLP方法，劉良國等［10］對洞庭湖水系五強溪水庫光澤黃顙魚（Pelteobagrus nitidus）遺傳多樣性的分析顯示，其多態位點比例為87.7%。本研究中，用8個擴增引物組合共計檢測出北盤江光唇裂腹魚種群多態位點數為897，多態位點比例為92.00%（表3）。可見，AFLP技術多態性位點檢出率高，可獲得較豐富的遺傳變異信息，是一種高效的分子標記方法，可以用于北盤江光唇裂腹魚種群遺傳多樣性及遺傳結構的研究。

據TAIJIMA［30］的DNA序列抽樣分析理論，在DNA水平上估計種群變異時，當樣本量≥10，抽樣樣本的方差便不會太大。大多數學者認為，為了避免因人為取樣對遺傳多樣性研究結果造成影響，實驗的樣本量應在30以上，由此獲得的遺傳多樣性結果才具有較高的可信度［31］。秦艷杰等［32］通過逐步增加AFLP引物組合數量進行了中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）群體遺傳多樣性的檢測，認為至少要用3個引物組合才能對其群體進行可信的遺傳學評價。沈德周等［6］研究了AFLP引物組合數量對馬纓杜鵑（Rhododendron delavayi）遺傳多樣性的影響，表明基于5個以上引物組合即可獲得較為準確的遺傳多樣性研究結果。本研究中，供檢測的北盤江光唇裂腹魚種群樣本量為30，引物組合數為8，可實現對該種群體遺傳多樣性較準確的評價。因此，本研究中獲得的北盤江光唇裂腹魚種群遺傳多樣性研究結果可信度較高。