鈴鐺刺花提取物急性毒性及抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用分析

謝麗媛

（寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院公共教學(xué)部 浙江·寧波 315800）

0 前言

在早前研究學(xué)者的研究文獻(xiàn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對于鈴鐺刺的種系發(fā)育與細(xì)胞學(xué)的研究相對較少，對于其營養(yǎng)成分和生物活性的研究更是幾乎沒有，對此對鈴鐺刺的成分進(jìn)行相關(guān)研究，分析其具體的抗疲勞作用具有一定意義。本文為了更好的分析研究鈴鐺刺的化學(xué)營養(yǎng)成分以及相關(guān)生物活性的具體情況，選擇了小鼠作為研究對象，進(jìn)行了急性毒性研究，測定出小鼠的最大鈴鐺刺的給藥量，并且進(jìn)行了一系列其他的實(shí)驗(yàn)研究，對于鈴鐺刺的用藥的安全性以及抗體力疲勞功能進(jìn)行細(xì)致評估與分析。從而為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新資源食品奠定基礎(chǔ)，并且為后續(xù)生產(chǎn)鈴鐺刺及其下游產(chǎn)品做出了有效且科學(xué)的基礎(chǔ)以及相應(yīng)科學(xué)依據(jù)，具體內(nèi)容如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本實(shí)驗(yàn)研究所選用的小鼠均為昆明種小鼠SPF級別。

1.2 方法

1.2.1 鈴鐺刺花的提取液的制備方法

選用鈴鐺刺花提取物作為樣品，提取物為浸膏，樣品的氣味清香，顏色呈棕褐色，液體為粘稠狀。將選用的樣品進(jìn)行一定濃度的稀釋，稀釋液選擇蒸餾水即可，稀釋濃度為2g/ml，確保樣品不會(huì)對灌胃針造成堵塞，將其放置到4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鈴鐺刺花提取液毒性實(shí)驗(yàn)研究

（1）急性毒性實(shí)驗(yàn)。

選用周齡在6-8周的小鼠30只做研究對象，30只鼠內(nèi)雌雄各15只，體重要控制在18g到22g范圍內(nèi)。將所有研究小鼠平均分成A、B、C3組，每一組各10只，其中A組一天給藥2次，兩次給藥之間時(shí)間間隔為8h。B組每天給藥3次，同樣兩次給藥之間時(shí)間間隔為8h。C組每天給藥4次，時(shí)間間隔縮短到間 6h。三組小鼠的每次灌胃鈴鐺刺提取液的濃度為0.02mL·g。另外，要特別注意，在采取小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程中，對小鼠禁食、禁水大約12h-16h之間。對于小鼠的飼喂過程是正常進(jìn)行，最后再注射提取液后密切觀察小鼠外觀、行為活動(dòng)、呼吸、分泌物、排便、死亡等多種情況的變化情況，根據(jù)小鼠的死亡率判斷提取液劑量更改，死亡數(shù)大于百分之三十時(shí)，需要換半數(shù)致死量（LD50）再次測定，當(dāng)發(fā)展提取液不會(huì)引起小鼠死亡，需要測定小鼠對于提取液的最大耐受量，連續(xù)觀察小鼠各項(xiàng)情況變化7周。

（2）小鼠的最大耐受劑量（MTD）測量。

最大耐受劑量測量方法試用與提取液的毒性極微弱，同時(shí)未毒性的受試樣品。在給小鼠注射最大濃度以及最大灌胃容量的提取液后，小鼠動(dòng)物仍然沒有出現(xiàn)死亡。隨后給予健康小鼠20只進(jìn)行研究，規(guī)定小鼠重量需達(dá)到18-22kg范圍內(nèi)，雌雄各一半。同樣實(shí)驗(yàn)前小鼠需要禁食大約12h，不需要禁水。要求受試樣品采用灌胃方式注射，灌胃容量設(shè)置為0.02mL/g BW，一天內(nèi)要進(jìn)行3次灌胃操作。灌胃結(jié)束，密切觀察小鼠的中毒表現(xiàn)以及死亡情況，連續(xù)觀察半個(gè)月。同時(shí)需要對于兩組小鼠的其他情況進(jìn)行密切觀察，記錄小鼠體重變化、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況等，待小鼠出現(xiàn)中毒癥狀后需要立即記錄小鼠的反應(yīng)癥狀、中毒嚴(yán)重程度、中毒開始與結(jié)束時(shí)間、維持時(shí)間以及恢復(fù)時(shí)間等。最后通過觀察小鼠各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算出小鼠一天之內(nèi)的最大給藥劑量，通過此數(shù)據(jù)可以推算出小鼠在臨床上的用藥倍數(shù)。

1.2.3 鈴鐺刺花提取液抗疲勞作用

第一，進(jìn)行小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)：選擇40只小鼠作為研究對象，小鼠雌雄各占一半，適應(yīng)性喂養(yǎng)三天，隨后將所有小鼠隨機(jī)分成4組，分別是空白組，鈴鐺刺花提取液高劑量、中劑量、低劑量組，三組提取液的量分別設(shè)定為4 g/kg、2g/kg和3 g/kg，規(guī)定四組小鼠數(shù)量一致，各自10只。同樣采取灌胃的方式對不同劑量組小鼠灌入鈴鐺刺花提取液，每天灌胃一次即可，劑量為0.2mg/10g小鼠，對于空白組小鼠灌胃同樣劑量的生理鹽水作對照，連續(xù)灌胃10天。要求在進(jìn)行試驗(yàn)前，需要對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，要求讓小鼠學(xué)會(huì)爬桿。在十天灌胃結(jié)末半小時(shí)后，將小鼠放置在放25 cm長、直徑為1 cm的有機(jī)玻璃竿上，要求玻璃竿表面光滑上，讓小鼠的肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，隨后記錄小鼠因?yàn)榧∪馄趶牟ＡО舾蜕系袈涞木唧w時(shí)間，連續(xù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，最后一次跌落時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，累計(jì)三次的時(shí)間作為爬桿時(shí)間。延長率＝（給藥組跌落時(shí)間－空白對照組跌落時(shí)間／空白對照組跌落時(shí)間×100%。

第二，進(jìn)行小鼠游泳實(shí)驗(yàn)：同樣選擇在小鼠最后一次灌胃結(jié)束后的半個(gè)小時(shí)這一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在小鼠的尾根部負(fù)荷小鼠體重5%的鉛塊，隨后將小鼠放入已經(jīng)自制好的水槽中進(jìn)行游泳試驗(yàn)，要求水深度大約30cm，水溫度30℃，尾部負(fù)重沙袋，對小鼠放手后開始計(jì)時(shí)，記錄小鼠游泳從開始至頭部完全沒入水面并且小鼠頭部不再上浮的整個(gè)過程的時(shí)間，該時(shí)間被認(rèn)為是小鼠負(fù)重游泳的時(shí)間。

1.2.4 小鼠游泳結(jié)束后，早晚對小鼠體內(nèi)的血清尿素氮(BUN)、血乳酸(BLA)含量進(jìn)行有效測定

同樣需要在小鼠連續(xù)灌胃鈴鐺刺花提取液的十天后，最后一次給藥結(jié)束的半個(gè)小時(shí)，需要對小鼠禁食不禁水，小鼠在自制水槽中不負(fù)重游泳90分鐘后，讓小鼠休息一小時(shí)，隨后采用眼球取血的方式取血0.5mL，即可向血液中加入肝素，保證血液不凝固，在以3000r/min的速度下離心，離心時(shí)間為一刻鐘，隨后取出上層血清，根據(jù)試劑盒所提供的方法對血清中的乳酸和尿素氮含量進(jìn)行測定。

1.2.5 小鼠游泳結(jié)束后，對小鼠體內(nèi)的肝糖原(LG)含量進(jìn)行有效測定

前期處理與1.2.4中步驟一致，游泳結(jié)束后立即處死，取小鼠肝臟，使用生理鹽水進(jìn)行漂洗，隨后用濾紙吸干肝臟表面的液體，進(jìn)行稱重，并且加入堿液對肝臟組織進(jìn)行破壞，同時(shí)達(dá)到保留糖原的目的，按樣本重量(mg)與堿液體積在1：3的條件下，將其一起加入試管中，使用保鮮膜將管口扎起，避免液體蒸發(fā)，同樣需要在保鮮膜上用針頭扎一小孔，防止試管中氣體發(fā)生熱脹冷縮的情況，放入沸水中浴煮20min，流水冷卻。按試劑盒要求將糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原檢測液，測定肝糖原含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理法

將患者臨床療效輸入spss22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理。獨(dú)立樣本t值檢驗(yàn)定量資料，由（±s）表示，卡方檢驗(yàn)定數(shù)資料，用（%）表示，組間差異經(jīng)P值表示，P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義成立。

2 結(jié)果

經(jīng)急性毒性實(shí)驗(yàn)分析后，得出小鼠對于鈴鐺刺花的最大耐受量大約120g/kg流浸膏，該數(shù)據(jù)相當(dāng)于人口服用量的300倍。

與空白對照組相比較，鈴鐺刺花提取液可以明顯提與升小鼠的爬桿時(shí)間和小鼠游泳時(shí)間，同時(shí)中、高劑量兩組的效果最為明顯，組間存在顯著差異（P＜0.01）。具體見表1：

表1：提取液對小鼠爬竿與游泳的影響情況

鈴鐺刺花提取液對于降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸和尿素氮含量有明顯作用，并且還可以顯著提高運(yùn)動(dòng)后小鼠肝糖原的含量，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），具體見表2：

表2：提取液對小鼠體內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)影響

3 討論

鈴鐺刺又被稱作鹽豆木，其主要生長地區(qū)是我國的西北部滴入，尤其在我國新疆地區(qū)的大部分鹽堿荒漠地中鈴鐺刺數(shù)量較多，鈴鐺刺屬于灌木類植物的一種，鈴鐺刺喜光照充足的環(huán)境，同時(shí)其具有抗鹽堿、抗干旱的特性，對于荒漠地區(qū)具有良好的固沙作用，并且可以有效的改善荒漠滴入的鹽堿土質(zhì)情況。在我國的西北部大部分地區(qū)都會(huì)將鈴鐺刺用作高產(chǎn)牧草，在民間人們將其又稱為“刺梅花”，它的嫩葉與花朵均可以進(jìn)行食用，并且葉與花中含有多用營養(yǎng)物質(zhì)，味道十分鮮美，具有很高的食用價(jià)值。本文研究發(fā)現(xiàn)鈴鐺花具有良好的抗疲勞作用，研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，鈴鐺刺花提取液可以明顯提與升小鼠的爬桿時(shí)間和小鼠游泳時(shí)間，同時(shí)中、高劑量兩組的效果最為明顯，組間存在顯著差異（P＜0.01）。鈴鐺刺花提取液對于降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸和尿素氮含量有明顯作用，并且還可以顯著提高運(yùn)動(dòng)后小鼠肝糖原的含量，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由此說明，鈴鐺花刺可以有效的降低運(yùn)動(dòng)后乳酸的堆積，具有良好的抗疲勞功能，可增加有氧運(yùn)動(dòng)的糖分供給，具有良好的效果。