淫羊藿苷通過調控α-SMA和MMPs/TIMP的表達改善異丙腎上腺素所誘導的心肌纖維化

林小英，任星橋，曾凡群，黃 波，李葉麗，楊丹莉

(遵義醫科大學藥學院，基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563099)

心肌纖維化可以降低心臟的順應性，抑制心臟功能，引發心源性猝死[1]。由心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化而導致心肌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)代謝失衡是引發心肌纖維化的重要原因[2]。α平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)是成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的重要標志[3]?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是調控心肌ECM合成與降解的重要酶系，其相互作用與ECM的動態平衡密切相關[4- 5]。

淫羊藿苷(icariin，ICA)是中藥淫羊藿的主要活性成分，具有改善高血壓、抗動脈粥樣硬化和抗心肌缺血等作用[6]。本課題組前期研究發現，ICA可以調控MMP-9和TIMP-1的mRNA表達，抑制自發性高血壓大鼠的心室重構[7]。異丙腎上腺素(ISO)是公認的制備左心室重構、心肌纖維化動物模型的工具藥[8, 9]。但ICA對ISO誘導的心肌纖維化的干預鮮有報道。本研究借助造模工具藥ISO，觀察ICA對C57BL/6小鼠左心室心肌纖維化的干預作用，并基于α-SMA，MMP-2/9、TIMP-1探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物及試劑C57BL/6小鼠，♂，7周齡，SPF級，購自長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0014。ISO(貨號：HY-B0468，MCE公司)；ICA(純度≥98%，批號：FY17420615，購于江蘇省南京澤朗醫藥有限公司)；氯沙坦(貨號：HY-17512A，MCE公司)；Masson三色染色液(貨號：G1345，Solarbio公司)；α-SMA兔抗小鼠抗體(貨號：55135-1-AP，Proteintech公司)；MMP-2兔抗小鼠抗體(貨號：D261446，BBI Life Sciences公司)；MMP-9兔抗小鼠抗體(貨號：10375-2-AP，Proteintech公司)；TIMP-1兔抗小鼠抗體(貨號：bs-0415R，北京博奧森生物技術有限公司)；GAPDH兔抗小鼠抗體(貨號：10494-1-AP，Proteintech公司)；HRP標記山羊抗兔抗體(貨號：S0001，Affinity公司)；ECL化學發光劑(貨號：180-501，Tanon公司)

1.2 儀器Vevo 2100小動物超聲檢測儀(加拿大VisualSonics公司)；RM2245組織切片機(德國LeicaBiosystems公司)；BX43顯微鏡(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R離心機(德國Eppendorf公司)；Supply Mini-Protean3電泳儀、Mini Trans-Blot轉移系統、ChemiDoc成像系統(美國BIO-RAD公司)。

1.3 實驗動物分組、造模和給藥60只♂ C57BL/6小鼠，于SPF級動物實驗室適應性喂養1周，隨機分為空白組(Control)、模型組(ISO)、ICA低劑量組(15 mg·kg-1，ICA-L)、ICA中劑量組(30 mg·kg-1，ICA-M)、ICA高劑量組(60 mg·kg-1，ICA-H)和氯沙坦組(9 mg·kg-1，LOS)，每組各10只。ISO組、ICA組和LOS組于頸背部皮下注射異丙腎上腺素(5 mg·kg-1)誘導心肌纖維化小鼠模型，Control組注射等體積生理鹽水。ICA組按劑量灌胃ICA，LOS組灌胃氯沙坦，Control組和ISO組灌胃等體積雙蒸水。造模和給藥每日1次，持續14 d。

1.4 檢測小鼠左心室功能造模及給藥14 d后，禁食12 h，稱小鼠體質量，常規性麻醉后剃除小鼠胸毛，將其固定在小動物超聲檢測臺，在胸腔上涂抹適量超聲耦合劑，將MS400探頭置于小鼠左胸前，采用Vevo2100系統檢測小鼠左心室射血分數(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)。

1.5 計算小鼠心臟質量指數打開小鼠胸腔，取出心臟，用預冷的生理鹽水洗凈殘留血液，濾紙吸干后稱重，計算小鼠心臟質量指數(HMI)，HMI=心臟質量(mg)/體質量(g)。

1.6 觀察小鼠左心室膠原纖維沉積情況分離小鼠左心室，取左心室組織，使用4%甲醛溶液固定24 h后脫水，石蠟包埋，組織切片機切片，進行Masson染色，用光學顯微鏡觀察小鼠左心室膠原纖維沉積情況。每張切片隨機選取5個視野，用ImageJ軟件計算小鼠左心室心肌膠原容積分數(CVF)，取平均值。CVF/%=膠原面積/視野總面積×100%。

1.7 檢測小鼠左心室α-SMA、MMP-2、MMP-9和TIMP-1的蛋白表達取小鼠左心室組織50 mg，剪碎，加500 μL RIPA裂解液和5 μL PMSF溶液，勻漿器冰上勻漿，靜置30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液。BCA試劑盒測定上清液蛋白含量，配制8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，半干轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，8%脫脂牛奶室溫封閉2.5 h，TBST洗PVDF膜，4 ℃過夜孵育抗體：α-SMA(1 ∶2 000)、MMP-2(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶1 000)、TIMP-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，TBST洗PVDF膜，室溫孵育山羊抗兔抗體(1 ∶5 000)1 h，TBST洗PVDF膜，ECL發光劑顯色，ChemiDoc成像系統獲取圖像。

2 結果

2.1 小鼠左心室功能變化與Control組相比，ISO組小鼠LVEF降低31.8%(P<0.05)，LVFS降低48.9%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠LVEF分別升高28.2%、38.5%、40.7%(P<0.05)，LVFS分別升高42.5%、54.7%、63.8%(P<0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effects of ICA on left ventricular function

2.2 小鼠心臟質量指數變化與Control組相比，ISO組小鼠HMI升高16.2%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠HMI分別降低7.2%、10.5%、11.8%(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Effects of ICA on HMI of

2.3 小鼠左心室膠原纖維沉積情況與Control組相比，ISO組小鼠左心室細胞間質膠原纖維沉積明顯增加，CVF增大(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室細胞間質膠原纖維沉積明顯減少，CVF減小(P<0.05)。其中，以ICA-H和LOS組最為明顯，見Fig 3。

Fig 3 Effects of ICA on collagen deposition of left ventricle in

2.4 ICA對小鼠左心室α-SMA蛋白表達的影響與Control組相比，ISO組小鼠左心室α-SMA蛋白表達上調49.8%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室α-SMA蛋白表達分別下調18.9%、22.6%、29.1%(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Effects of ICA on α-SMA protein expression in left ventricle of

2.5 ICA對小鼠左心室MMP-2蛋白表達的影響與Control組相比，ISO組小鼠左心室MMP-2蛋白表達下調45.8%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室MMP-2蛋白表達分別上調52.3%、63.9%、86.5%(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 5 Effects of ICA on MMP-2 protein expression in left ventricle of

2.6 ICA對小鼠左心室MMP-9蛋白表達的影響與Control組相比，ISO組小鼠左心室MMP-9蛋白表達上調66.8%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室MMP-9蛋白表達分別下調26.6%、43.2%、59.7%(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 6 Effects of ICA on MMP-9 protein expression in left ventricle of

2.7 ICA對小鼠左心室TIMP-1蛋白表達的影響與Control組相比，ISO組小鼠左心室TIMP-1蛋白表達下調61.9%(P<0.05)；與ISO組相比，ICA-M、ICA-H及LOS組小鼠左心室TIMP-1蛋白表達分別上調99.6%、137.4%、192.9%(P<0.05)，見Fig 7。

Fig 7 Effects of ICA on TIMP-1 protein expression in left ventricle of

3 討論

心肌纖維化是導致心功能障礙、心源性猝死的潛在危險因素，是高血壓心臟病、缺血性心肌病等的重要病理特征[1]。減輕心肌纖維化可以有效改善心臟功能障礙。研究表明，ISO以5 mg·kg-1每日頸背部皮下注射持續14 d，可以誘導小鼠心肌纖維化，導致心室收縮和舒張功能發生障礙[9]。氯沙坦是臨床常用的AT1受體拮抗劑，具有減緩心肌纖維化的作用，在本研究中作為陽性對照藥[10]。本研究中，ISO干預14 d后，小鼠的LVEF和LVFS明顯降低，HMI明顯升高，左心室細胞間質膠原纖維沉積明顯增多，CVF增大，提示心肌纖維化模型構建成功；給予ICA(30、60 mg·kg-1)14 d后，小鼠LVEF和LVFS明顯升高，HMI明顯降低，小鼠左心室細胞間質膠原纖維沉積明顯減少，CVF減??；與氯沙坦組相比較，ICA 60 mg·kg-1組對上述指標的影響差異無統計學意義。綜上，提示ICA能夠改善ISO誘導的小鼠心肌纖維化。

心肌ECM對心臟維持正常結構和功能至關重要，心肌纖維化的發展過程也是心肌ECM的病理性重構過程[11]。心肌受損后，心肌成纖維細胞在多種細胞因子的作用下轉化為肌成纖維細胞[12]。與成纖維細胞相比，肌成纖維細胞分泌ECM的功能顯著增強[13]。ECM過度沉積會導致心肌纖維化，使心臟功能減退。α-SMA是成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的重要標志物。本研究結果顯示，ISO使小鼠左心室α-SMA蛋白表達上調；ICA(30、60 mg·kg-1)能抑制ISO所致的小鼠左心室α-SMA蛋白表達上調；與氯沙坦組相比較，ICA 60 mg·kg-1組對α-SMA蛋白表達的影響差異無統計學意義。結合ICA抑制ISO所致小鼠心肌纖維化的效應，提示ICA可能通過下調α-SMA的蛋白水平，抑制小鼠心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化。

MMPs是一類需要依賴Zn2+、Ca2+等金屬離子發揮催化活性的內源性肽鏈內切酶，能夠通過調控ECM代謝，對損傷的心肌組織進行修復和重建[4]。MMPs包括膠原酶、明膠酶、間質溶解素、基質溶解素、膜型基質金屬蛋白酶和其他酶類。明膠酶包括MMP-2和MMP-9。TIMPs可以通過抑制MMPs的活性，調控ECM的合成與降解[5]。正常情況下，心肌ECM的合成與降解處于平衡狀態。當MMPs與TIMPs表達失衡會導致ECM合成與降解異常，引起心肌纖維化。值得注意的是：一方面MMPs促使ECM中的膠原蛋白降解，繼而降解的膠原蛋白被缺乏連接結構的纖維性間質所取代，纖維膠原網絡被破壞，導致心肌纖維化[14]；另一方面，當MMPs的表達過低，ECM的合成大于降解，繼而導致ECM過量沉積，也促使心肌纖維化的發生[14]。

TIMP-1對MMP-9具有特殊的親和力，能夠抑制MMP-9的活性。Fu等[15]證實自發性高血壓大鼠左心室組織的MMP-9表達上調、TIMP-1表達下調，導致心肌纖維化。Ma等[16]發現ISO通過下調MMP-2的表達促使小鼠心肌纖維化的發生。在本研究中，ICA(30、60 mg·kg-1)可以抑制小鼠ISO所誘導的左心室MMP-2蛋白表達的下調、MMP-9蛋白表達的上調及TIMP-1蛋白表達的下調；與氯沙坦組相比較，ICA 60 mg·kg-1組對以上蛋白表達的影響差異無統計學意義。結合以上資料，提示ICA一方面可能通過調節MMP-9和TIMP-1的表達失衡，抑制心肌纖維膠原網絡被破壞，另一方面可能通過促進MMP-2的表達，抑制ECM過量沉積，改善ISO誘導的小鼠心肌纖維化。

綜上所述，ICA能夠改善ISO所誘導的小鼠心肌纖維化，其機制可能與調控α-SMA、MMPs/MMP-1的蛋白表達有關。

(致謝：本實驗在遵義醫科大學基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室完成，在此對給予幫助的李意奇和皮婷婷表示感謝！)