羥基紅花黃色素A對缺血再灌注腦損傷小鼠皮層COX-2/PGD2/DPs途徑的影響

王 瓊，劉茂竹，陳夢園，劉 霞，魯 懿，楊俊卿

(重慶醫科大學藥學院藥理學教研室，重慶 400016)

中風具有較高的發病率和死亡率，可分為出血性中風和缺血性中風，其中缺血性中風約占中風總發生率的87%[1]。缺血性中風主要是由于腦組織局部血液供應減少或中斷而引起的腦血管意外[2]，其臨床上治療策略主要是再通/復氧。但是，這又必然會導致腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)[3]。目前，由于CIRI的病理生理機制并不完全清楚，因此缺乏有效治療策略和有效的干預藥物。因此，深入研究CIRI的病理生理機制，尋找有效降低CIRI的藥物具有重要的醫學意義和社會價值。

研究表明，炎癥反應在腦缺血再灌注損傷的發病機理中起關鍵作用[4]。因此，抑制由腦缺血性中風引起的炎癥反應可能成為中風治療的一種新策略。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)是紅花黃色素中含量最高、藥理功效最強的水溶性成分，有研究發現HSYA具有保護心血管系統[5]、抗氧化[6]、抗腦缺血再灌注損傷[7]等作用，但是其機制尚不明確。研究發現，炎癥反應及其相關的環氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)及其下游通路前列環素(prostacyclin，PGI2)參與了CIRI的機制[8]，但是HSYA對CIRI作用機制是否涉及COX-2/PGD2/DPs途徑，尚未見報道。

本實驗擬通過大腦中動脈栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)小鼠模型，進一步驗證HSYA對缺血再灌注腦損傷小鼠的保護作用。同時觀察小鼠皮層COX2、DP1、DP2mRNA和蛋白的表達改變，以及炎癥相關因子TNF-α、IL-1β、PGD2含量的變化，以期從炎癥反應的調節通路之一的COX-2/PGD2/DPs途徑，初步探討HSYA對缺血再灌注腦損傷小鼠的保護作用機制，為HSYA廣泛用于臨床治療急性缺血性腦卒中提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器C57BL/6J小鼠，60只，雄性，體質量(18-22)g，SPF級，購于重慶醫科大學實驗動物中心，許可證號SYXK(渝)2018-0003。HSYA(批號：CAS#78281-02-4)購于寶雞市辰光生物科技有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride solution，TTC)(批號：17779)購于美國Sigma公司；蛋白印跡相關試劑購自江蘇碧云天生物技術有限公司；COX-2抗體(批號：GR3267180-1)和DP1抗體(批號：GR79858-8)購于英國abcam公司，DP2抗體(批號：73b0750)購于艾菲公司；COX-2、DP1、DP2引物由上海生物生工公司合成；低溫離心機(美國賽默飛公司)；濕式轉膜儀和垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；凝膠成像系統、qPCR儀(美國Bio-Rad公司)；正置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1I/R模型建立 采用線栓法建立小鼠MCAO/R模型[9]。腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉小鼠，將其仰臥固定，在頸部切口，在顯微鏡下分離出右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)，結扎頸總動脈和頸外動脈，頸內動脈用動脈夾夾緊。在頸總動脈遠心端插入頂端硅膠包被的線栓，線栓經頸總動脈進入大腦前動脈(anterior cerebral artery，ACA)的起始部，直到線栓黑色標處到達頸內與頸外的分叉處。插栓1 h后，緩慢拔出線栓，再灌注24 h。假手術組除不插栓外，其余處理與模型組相同。造模過程中小鼠體溫維持在37 ℃左右。

1.2.2分組與給藥 小鼠隨機分成3組：假手術組(Sham組)、模型組(Model組)、HSYA處理組(HSYA 20 mg·kg-1組)，每組20只小鼠。HSYA溶于生理鹽水中備用。小鼠在每次給藥前稱體質量，尾靜脈注射HSYA (20 mg·kg-1)0.2 mL，每天1次，d5給藥后立即造模。MCAO/R造模后存活率約為60%(假手術組除外)，假手術組造模后為20只，模型組造模后剩余12只，HSYA處理組造模后剩余13只。死亡小鼠尸檢發現可能是由于線栓戳到蛛網膜下腔導致腦出血致死。HSYA臨床建議成人有效劑量約為2 mg·kg-1，一般情況下每天1次[10]。且已有研究發現頸總動脈注射16 mg·kg-1HSYA可顯著改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷[11]。因此，本實驗結合病人臨床給藥劑量以及已有動物實驗的有效劑量，換算到小鼠劑量約為20 mg·kg-1，并且我們預試驗發現給藥5 d對小鼠腦缺血再灌注損傷有明顯預防性保護效果，因此在正式實驗中采用劑量為小鼠靜脈注射HSYA 20 mg·kg-1。

1.2.3神經功能評分 本實驗采用經典的Longa 5分法進行神經功能缺損評定[12]。小鼠正常運動，0分；小鼠的左前肢不能完全伸展，1分；小鼠行走時向對側轉圈，2分；小鼠行走時向對側傾斜，3分；小鼠不能自發行走并且意識喪失，記為4分；死亡小鼠不納入統計范圍。假手術組、模型組、HSYA處理組每組取12只小鼠進行神經功能評分。神經功能評分后各組小鼠再進行后續實驗。

1.2.4腦梗死體積測定 再灌注24 h后，小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后處死，斷頭取腦，-20 ℃冰箱中速凍全腦30 min，待全腦凍硬后置于冰盒上連續均勻切片5片。將腦切片置于1% TTC染液中，放入37 ℃恒溫水浴鍋中避光孵育，正反面各15 min。觀察腦組織變化，正常組織為紅色，缺血組織為白色。拍照后用ImageJ圖像分析軟件計算每片腦片梗死體積和腦片體積。假手術組、模型組、HSYA處理組每組各4只小鼠。

1.2.5皮層組織病理學觀察 再灌注24 h后，小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，打開小鼠胸腔，剪碎右心耳作為灌流液出口，灌注針從左心尖插入，先緩慢推注20 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)進行沖洗，再推注10 mL多聚甲醛進行內固定。推注完成后，斷頭取腦后4%多聚甲醛溶液固定3 d，然后石蠟包埋并切片，進行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。顯微鏡下觀察小鼠皮層神經元組織病理學變化。假手術組、模型組、HSYA處理組每組各3只小鼠。

1.2.6Western blot法檢測皮層蛋白的表達 收集假手術組、模型組、HSYA處理組小鼠右腦皮層組織(梗死區和半暗帶混合)，每組剩余5只，隨機取4只小鼠進行后續Western blot、qRT-PCR、ELISA檢測實驗。加入蛋白裂解液(RIPA-PMSF 100 ∶1)到裝有小鼠組織的勻漿器中，均勻研磨，裂解組織蛋白，等量蛋白用濕法經12% SDS-PAGE進行電泳分離后轉移至0.45 μm PVDF膜上，5%胎牛血清蛋白室溫封閉2.5 h后，加入一抗COX-2(稀釋比例1 ∶1 000)、DP1(稀釋比例1 ∶1 000)、DP2(稀釋比例1 ∶500)、Tublin(稀釋比例1 ∶5 000)。4 ℃孵育過夜。次日再加二抗(1 ∶5 000)孵育1 h，最后顯影成像，Image Lab軟件對結果圖片進行灰度分析。

1.2.7定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測mRNA表達 用TRIzol試劑盒提取小鼠右腦皮層總RNA，采用SYBR預混料，在10 μL體系內進行實時定量聚合酶鏈反應。反應條件：在95 ℃下循環30 s，然后在95 ℃下循環50 s，60 ℃下循環30 s。引物由上海生物生工公司合成。引物序列見Tab 1。

Tab 1 List of primers used in qPCR analysis

1.2.8ELISA檢測細胞因子 用ELISA試劑盒(江蘇酶標生物科技公司)檢測小鼠右腦組織皮層中的PGD2、IL-1β、TNF-α水平。該試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附實驗。往預先包被捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品含量呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定光密度值，計算樣品濃度。

Fig 1 Effects of HSYA on neurological function score and cerebral infarction volume in MCAO/R-treated mice

2 結果

2.1 HSYA對缺血再灌注小鼠神經行為學評分和腦梗死體積的影響TTC染色和神經功能評分結果顯示，與假手術組相比，模型組梗死體積和術后神經功能評分明顯增加。與模型組相比，HSYA預處理可以明顯減少MCAO/R小鼠損傷側腦梗死體積且明顯降低了小鼠術后神經功能評分。

2.2 HSYA對缺血再灌注腦損傷小鼠皮層組織病理形態學的影響HE染色結果顯示，與假手術組相比，模型組細胞排序紊亂且核固縮明顯，核深染且空泡較多，死亡細胞數約占細胞總數90%。與模型組相比，HSYA組的細胞核仁較為清晰，排列整齊，少量細胞死亡，死亡細胞數約占細胞總數30%。

2.3 HSYA對缺血再灌注腦損傷小鼠皮層COX-2、DP1、DP2蛋白和mRNA表達影響從qRT-PCR和Western blot結果可知，與假手術組相比，模型組COX-2、DP1、DP2的mRNA和蛋白表達明顯增加。與模型組相比，HSYA 20 mg·kg-1組COX-2、DP1、DP2的mRNA和蛋白表達水平明顯降低。

Fig 2 Effects of HSYA on cortical tissue cells of MCAO/R-treated mice (n=3)

2.4 HSYA對缺血再灌注腦損傷小鼠皮層炎癥因子水平的影響從ELISA結果得知，與假手術組相比，模型組小鼠皮層炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGD2水平增加。與模型組相比，HSYA(20 mg·kg-1)預處理后，炎癥因子TNF-α、IL-1β、PGD2水平明顯下降。

3 討論

在腦缺血數小時后，促炎因子會作用于血管內皮細胞激發一系列炎癥反應，一方面會造成缺血區域血腦屏障通透性改變和神經元的死亡；另一方面會招募中性粒細胞、小膠質細胞等遷移到缺血性病變區，導致創傷后過度炎癥反應與繼發性腦損傷[13]。因此，抑制由腦缺血性中風引起的炎癥反應對于腦卒中治療至關重要。

Fig 3 Effect of HSYA on expression of COX-2, DP1, DP2 mRNA and protein in cortex of mice subjected to ischemia-reperfusion injury n=4)

Fig 4 Effects of HSYA on IL-1β, PGD2 and TNF-α in cortex of mice subjected to ischemia reperfusion injury n=4)

COX-2是一種誘導酶，在正常組織細胞中一般不表達或者低表達，但在細胞內外多種刺激(如促炎因子、細胞因子、機械性刺激等)下高表達，并在炎癥等病理情況下起主導作用。COX-2參與免疫調節、血管功能和突觸信號的傳遞，是神經炎癥的重要介質之一[14]。近年來研究發現， HSYA有抗腦缺血再灌注損傷的作用[7]。但是HSYA對CIRI作用的病生機制是否涉及COX-2/PGD2/DPs途徑并不清楚。本研究發現，HSYA 20 mg·kg-1可顯著降低造模后小鼠皮層組織中COX-2蛋白和mRNA的表達，且COX-2的下游信號通路PGD2/DPs也有明顯改變。PGD2是COX-2的下游產物，是腦中富含最豐富的前列腺素。已有研究發現，在腦缺血/再灌注模型中PGD2的有害作用，主要是通過DP2受體發揮作用[15]。DP2是PGD2的特異性受體，類屬7次跨膜G蛋白受體，與Gi型G蛋白偶聯，抑制cAMP(cyclic adenosine monophosphate)產生而誘導cGMP(cyclic guanosine monophosphate)產生，導致細胞內Ca2+上調，促進炎癥因子IL-2、IL-4等釋放[16]。與模型組相比，HSYA預處理組中小鼠皮層組織PGD2和DP2表達明顯下調，這提示HSYA降低了COX-2、PGD2、DP2的表達從而保護小鼠腦缺血再灌注損傷。DP1類屬視紫紅質型G蛋白受體，與Gs型G蛋白相偶聯，激動后細胞內cAMP含量增加并促進Ca2+釋放，能夠增強內皮細胞屏障功能以及保護神經元[16]。已有研究發現激活DP1受體可明顯改善小鼠腦缺血再灌注損傷[16]。在本實驗中，造模后小鼠皮層DP1表達升高，推測這是一種小鼠造模損傷后自身應激反應保護性的升高，但HSYA預處理后小鼠皮層DP1表達降低，可能是由于上游COX-2的表達減少，因此導致下游的產物減少。但總體來說，HSYA降低了COX-2以及其下游通路PGD2/DPs的表達從而減緩了腦缺血再灌注小鼠的炎癥反應。

綜上所述，HSYA能夠降低小鼠腦梗死率，減輕腦細胞病理損傷，改善神經功能，減輕炎癥反應。更為重要的是，本研究發現HSYA可降低腦缺血再灌注小鼠皮層組織中COX-2、DP1、DP2mRNA和蛋白的表達，這提示HSYA可能通過COX-2/PGD2/DPs途徑保護小鼠腦缺血再灌注損傷。