利用細胞代謝組學探究TRPA1在胃癌中的影響作用

鄧 蕊, 余蘇云，吳媛媛，李曉曼，陳文星,2，王愛云,2，陸 茵,2

(南京中醫藥大學 1. 藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2. 江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇 南京 210023)

胃癌已成為全球范圍內第五大常見癌癥及第三大癌癥相關死亡原因[1]，近2/3的患者最終面臨死亡。目前癌癥的診斷技術及治療手段雖在不斷發展，但胃癌患者的預后狀況并沒有得到顯著改善，手術切除仍是胃癌患者預后最好的治療方式[2]。此外，靶向治療藥物的開發也取得了一定的成效，如靶向人表皮生長因子受體2(HER2)的曲妥珠單抗(trastuzumab)及靶向血管內皮生長因子(VEGF)的雷莫蘆單抗(ramucirumab)，對實現精準治療及個性化醫療意義重大。然而，這些療法的治療效果有限且對患者的生活質量有較大影響。因此，新型胃癌治療靶點仍是目前研究的焦點。

近年來，瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)通道蛋白成為腫瘤治療領域的一類“明星”治療靶點[3]。生理情況下，TRP作為多種細胞內、外界環境信號的感受器，通過被溫度或相應的配體激活后，介導Ca2+等陽離子進入細胞內調節生理活動。病理狀態，包括在惡性腫瘤發展過程中，TRP蛋白存在異常表達現象，而這往往與腫瘤的發展進程有著密不可分的關系[4]。

TRPA1作為目前TRPA(ankyrin)亞家族中的唯一成員，能夠被大蒜素(allicin)、肉桂醛(cinnamaldehyde)等化合物所激活。近年來研究證實，TRPA1的激活在前列腺癌、鼻咽癌的增殖、生長及轉移過程起重要作用[5-6]。同時，Takahashi等[7]證明了TRPA1在浸潤性導管乳腺癌組織中存在異常表達情況，其通過Ca2+依賴的抗凋亡途徑促進腫瘤細胞的化療耐受性。但關于TRPA1與胃癌發展進程的文章較為缺乏，因此，本研究從TRPA1表達情況與胃癌進程的相關性入手，初步探討其在胃癌轉移過程中的具體作用，并對其可能作用機制及潛在治療藥物進行探尋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞 實驗所用細胞株均為南京中醫藥大學中藥藥效與安全性評價重點實驗室自存。所有細胞均由1640培養基(含10%FBS)培養基放置于恒溫培養箱中進行培養。

1.1.2實驗藥品與試劑 RPMI 1640基礎培養基粉末購于Gibco公司(貨號：31800022)；胎牛血清(fetal calf serum，FBS)購于Gibco公司(貨號：10100-147)；胰酶購于Amresco公司(貨號：R223-01)；Transwell小室購于Corning公司(貨號：3422)；結晶紫購于源葉生物科技有限公司(貨號：B26890)；CCK-8購于APExbio公司(貨號：K1018)；小豆蔻明(Cardaomin)購于源葉生物科技有限公司(CAS：19309-14-9, 貨號：B21380)；HC030031購于MCE公司(貨號：HY-15064)；TRPA1抗體購于愛博泰克生物科技有限公司(貨號：A8568)。

1.1.3實驗儀器 多功能酶標儀(Biotek, Synergy2)；長時間細胞動態成像及數據分析系統(Essen, IncuCyte Zoom)；電泳儀(Bio-Rad, 型號Mini protean 3 cell)；凝膠成像系統(Bio-Rad, 型號ChemiDoc XRS+)；梯度PCR儀(Applied Biosystems, 型號Cycler)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, 型號7500)；熒光倒置顯微鏡(Zeiss, 型號AX10)

1.2 實驗方法

1.2.1Kaplan-Meier plotter數據庫的應用 ① 打開Kaplan-Meier plotter在線數據庫(https://kmplot.com/analysis/); ②進入胃癌患者相關生存曲線分析界面；③在“Affy id/ Gene symbol”欄輸入“TRPA1”，選擇Affmetrix ID為208349_at的樣本進行分析；④點擊“Draw Kaplan-Meier plot”，獲取TRPA1基因表達水平與胃癌患者生存期的相關性信息。

1.2.2CCK-8檢測MKN-45細胞活力 將MKN-45細胞培養至細胞融合度90%左右，以每孔7×103個的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔，培養24 h。設計溶劑對照組、小豆蔻明(1、2、4、8、16、32、64、128 μmol·L-1)，繼續培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，之后利用酶標儀在450 nm處測量吸光度值，實驗重復3次。

1.2.3長時間細胞動態成像及數據分析 以每孔7×103個細胞的密度將MKN-45細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后，給予不同濃度HC030031(0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol·L-1)，設置空白對照及溶劑對照，每組設置6個復孔，隨后將培養板放至長時間動態成像系統中，每隔1 h進行全板掃描，共掃描72次，成像結束后利用系統進行圖像處理。

1.2.4Transwell檢測MKN-45細胞遷移能力 利用無血清1640培養基處理MKN-45細胞過夜后，用胰酶消化并分別使用含不同濃度小豆蔻明(2、4、8 μmol·L-1)及等體積含DMSO的培養基對細胞進行重懸，以每孔1×105個細胞密度接種100 μL于上室，下室加入800 μL含30%FBS培養基，繼續培養24 h，取出小室，用4%多聚甲醛固定10 min，再用0.1%結晶紫染色15 min，PBS清洗干凈并風干后拍照。

1.2.5化合物3D結構下載 登錄美國國家生物技術信息中心 (NCBI) 數據庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在下拉菜單中選擇PubChem Compound，以cardamonin為關鍵詞進行檢索，選擇CID號為641785的化合物進行下載，并以SDF格式保存。

1.2.6蛋白質3D結構下載 登錄Protein Data Bank蛋白質結構數據庫RCSB PDB (http://www1.rcsb.org/)，以TRPA1為關鍵詞進行檢索，選擇PDB號為6PQO的蛋白質進行下載，以PDB格式進行保存。

1.2.7成分-靶點分子對接 將已下載的TRPA1蛋白質結構導入SYBYL-X 2.0，使用Automatic模式尋找蛋白中的最佳結合口袋。隨后導入cardamonin結構，并勾選“Perform CScore Calulations”項，使用Total Score及CScore進行評價，篩選出CScore≥4且Total Score最高的結合模式。

1.2.8Western blot檢測TRPA1蛋白水平表達情況

1.2.8.1檢測胃癌細胞與正常胃上皮細胞中TRPA1表達情況 將細胞分別接種于六孔板中，細胞生長至融合度到80%-90%時，提取蛋白，將蛋白統一至25 μg依次上樣，電泳、轉印等步驟后，一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，二抗室溫孵育1.5 h，1× TBST洗滌3次。最后用化學發光法在凝膠系統中進行曝光顯影，對結果進行半定量分析，實驗重復3次。

1.2.8.2檢測小豆蔻明對MKN-45細胞TRPA1蛋白表達水平影響 將人源胃癌細胞株MKN-45接種于6孔板中，細胞生長至融合度至70%左右時，每孔分別加入不同濃度的小豆蔻明(2、4、8 μmol·L-1)及等體積含DMSO的培養基孵育24 h，隨后按“1.2.8.1”所述操作進行檢測。

1.2.9GC-MS代謝產物分析

1.2.9.1色譜條件 色譜柱：HP-5毛細管色譜柱(30 m x 0.25 mm，0.25 μm, Agilent公司)；載氣：高純氦氣；流量：1.0 mL·min-1；分流比：20 ∶1；進樣量：1 μL；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：280 ℃；升溫程序：初始溫度為60 ℃，保持1 min，隨后以20 ℃·min-1升溫至320 ℃，維持5 min。

1.2.9.2質譜條件 離子源：電子電離源(EI)；電離能量：70 eV；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：300 ℃；質譜掃描范圍：m/z50-550。

1.2.9.3樣本收集 胃癌細胞與正常胃上皮細胞代謝差異分析：取對數生長期、生長狀態良好的GES-1，AGS，BGC-823，MGC-803和MKN-45細胞，以PBS洗滌細胞3次后，用刮刀刮取培養皿中的細胞，4 ℃離心(1 200 r·min-1，10 min)，收集細胞沉淀，保存于液氮中，用于細胞內代謝組學分析。每種樣本平行6份。

1.2.9.4樣品前處理 按照參考文獻[8]方法處理細胞，凍干的細胞裂解物加60 μL的0.1%甲酸水溶液，使其復溶，4 ℃離心(13 000 r·min-1，10 min)，取上清于液相小瓶中。以混合各自等分試樣的樣品為質控樣本，空白為提取溶劑。

1.2.9.5數據處理與分析 將采集的GC-MS原始數據文件導入MS-DIAL軟件中進行色譜峰提取和物質鑒定，得到包含代謝物名稱、保留時間、質荷比及峰高三維信息數據集，歸一化后數據導入SIMCA-P 13.0軟件進行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，以VIP值>1，P值<0.05為條件，篩選正常人胃粘膜上皮細胞(GES-1)與四種不同胃癌細胞(AGS，BGC-823，MGC-803，MKN-45)的差異性代謝物。運用MetaboAnalyst 4.0(http://www.metaboanalyst.ca/)網站進行代謝通路分析。

2 結果

2.1 TRPA1表達水平與胃癌患者生存期呈負相關對TRPA1與胃癌患者生存期相關性進行分析(Fig 1A-C)，結果發現，胃癌患者總生存期(overall survival，OS)，首次進展生存期(first progression，FP)，再進展生存期(post progression survival，PPS)均與TRPA1表達呈負相關生存曲線，由此提示我們，TRPA1與胃癌進程密切相關，其表達水平升高可能對胃癌發生發展起促進作用。

Fig 1 The mRNA expression of TRPA1 in gastric cancer patients significantly negatively correlated with their survival

2.2 TRPA1在胃癌細胞中異常高表達基于上述數據庫統計結果，進一步通過體外實驗對胃正常上皮細胞(GES-1)及多株胃癌細胞(MGC-803、MKN-45、BGC-823、AGS)TRPA1表達水平進行檢測(Fig 2)。由于TRPA1是一種瞬時離子通道蛋白，其蛋白層次表達水平指示著蛋白功能的發揮。因此，我們使用Western blot 對不同細胞間TRPA1蛋白水平的表達進行了檢測。結果顯示，與正常胃上皮細胞相比，胃癌細胞TRPA1的表達水平明顯更高。其中，MKN-45細胞TRPA1蛋白表達水平最高。

Fig 2 TRPA1 overexpressed in gastric cancer cells

2.3 HC-030031抑制胃癌細胞遷移作為一類瞬時離子通道蛋白，TRPA1的激活能夠介導以Ca2+為主的一系列陽離子流入細胞，進而產生一系列下游的生理及病理效應。同時，上述研究結果均表明，胃癌中存在TRPA1異常高表達現象，那么這種異常表達現象是否與胃癌發展進程存在一定相關性？于是，我們利用選擇性TRPA1抑制劑HC-030031，對TRPA1與胃癌轉移之間的相關性進行探索。首先，我們利用長時間動態活細胞成像設備在無需標記及不影響細胞活動的狀態下對MKN-45細胞進行長時間觀察成像(Fig 3A，B)，選擇不影響MKN-45細胞增殖活力的4、8 μmol·L-1進行體外驗證。利用Transwell從垂直角度驗證TRPA1與胃癌遷移的關系，如Fig 3C所示，使用HC-030031處理細胞后，細胞的垂直遷移能力受到了明顯抑制，且與給藥劑量存在劑量依賴性。

2.4 小豆蔻明與TRPA1的結合潛力為進一步從抗腫瘤中藥中篩選能夠有效抑制TRPA1的化合物，我們利用虛擬篩選對TRPA1的潛在抑制劑進行尋找。文獻檢索過程中發現，小豆蔻明能夠選擇性抑制TRPA1介導的Ca2+內流，并具有濃度依賴性[9]。進而，我們利用分子對接技術對小豆蔻明與TRPA1的結合能力進行研究，對接結果如Fig 4所示，小豆蔻明能夠有效地嵌入TRPA1蛋白的活性腔結合口袋中，且CSCORE評分為滿分5分，表明該對接結果一致性良好。由此，小豆蔻明與TRPA1蛋白的結合能力較強，并可能抑制TRPA1功能的發揮。

2.5 小豆蔻明減少胃癌細胞TRPA1蛋白表達為探究小豆蔻明對胃癌細胞中TRPA1表達的影響，我們選用TRPA1表達水平相對最高的MKN-45細胞進行驗證。給予MKN-45細胞不同濃度的小豆蔻明(2、4、8 μmol·L-1)刺激24 h后，對細胞總蛋白進行提取，并對細胞TRPA1蛋白表達進行檢測。結果顯示(Fig 5)，一定濃度范圍內，小豆蔻明能夠劑量依賴性抑制TRPA1蛋白表達。說明小豆蔻明在抑制TRPA1功能發揮的同時，具有抑制TRPA1功能蛋白表達的作用。

2.6 小豆蔻明抑制胃癌細胞遷移CCK-8結果顯示 (Fig 6A)，小豆蔻明在一定濃度范圍內(1-16 μmol·L-1)對MKN-45細胞的增殖活力沒有影響。由此，選擇2、4、8 μmol·L-1的小豆蔻明進行Transwell實驗，探究小豆蔻明對MKN-45細胞遷移能力的影響。結果顯示 (Fig 6B, C)，使用小豆蔻明對細胞進行處理后，與TRPA1抑制劑HC-030031相似，細胞的遷移能力被明顯抑制了，且這種抑制作用存在劑量依賴性。

Fig 3 Metastasis of MKN-45 cells in vitro inhibited by HC-030031

Fig 4 Docking analysis of TRPA1 and cardamonin

2.7 細胞代謝輪廓的分析為進一步探究小豆蔻明抑制胃癌細胞轉移的內在機制，GC-MS技術被用于探究正常細胞與胃癌細胞代謝產物差異，以及小豆蔻明對差異代謝物的影響。從細胞樣本中共鑒定得到45個小分子代謝物，以計算各代謝物在QC樣本中峰面積的RSD值，超過90%的化合物RSD值小于30%，表明實驗操作及儀器穩定，數據可靠。結果見Fig 7A。利用SIMCA-P 13.0軟件構建PLS-DA模型。得分圖如Fig 7B所示，模型參數為R2X=0.921，R2Y=0.907，Q2=0.829，表明所建模型穩定可靠。結果顯示，GES-1樣本與4種胃癌細胞樣本區別明顯，且相隔較遠，表明其正常胃上皮細胞與胃癌細胞中代謝物存在明顯差異。

Fig 5 Expression of TRPA1 protein inhibited by cardamonin

2.8 細胞代謝差異產物的鑒定將正常人胃粘膜上皮細胞 (GES-1) 分別與4種胃癌細胞兩兩比較，對篩選出的差異代謝物進行鑒定，分別得到10種(GES-1 vs AGS)，7種(GES-1 vs BGC-823)，3種(GES-1 vs MGC-803)和7種(GES-1 vs MKN-45)代謝物。對上述代謝物數據歸一化處理后進行聚類分析，結果表明正常細胞與胃癌細胞的代謝產物差異較大，見Fig 8。對差異代謝產物進行分析發現，正常細胞與4種胃癌細胞有2個共有差異代謝物：天冬酰胺 (L-Asparagine) 和肌醇 (myo-inositol),且胃癌細胞中天冬酰胺含量均增加，肌醇含量均出現減少。由此，與天冬酰胺及肌醇相關代謝途徑可能在誘導胃癌進程中起著重要作用。

Fig 6 Metastasis of MKN-45 cells in vitro inhibited by cardamonin

Fig 7 Analysis of differential metabolites after cardamonin treatment

Fig 8 Heatmap visualization of different metabolites of GES-1 and gastric cancer cells

2.9 小豆蔻明對共有細胞代謝差異產物的影響提取正常細胞 (GES-1)、胃癌細胞 (MKN-45)以及給藥后胃癌細胞(MKN-45)中天冬酰胺(L-Asparagine)和肌醇(myo-inositol)的峰面積。以正常細胞代謝水平為基準，給以8 μmol·L-1小豆蔻明后，天冬酰胺和肌醇的代謝物水平均有所回調。見Fig 9。

Fig 9 Relative levels of L-asparagine and myo-inositol between GES-1, MKN-45 and MKN-45-CAR-8 μmol·L-1

2.10 相關代謝通路富集分析將上述鑒定得到的差異代謝產物導入MetaboAnalyst 4.0網站中進行代謝通路富集分析，以影響值>0.1為條件，篩選得到9條相關代謝通路，見Fig 10。包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝；苯丙氨酸代謝；甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；氨酰基-tRNA的生物合成；酪氨酸代謝；磷酸肌醇代謝；精氨酸生物合成等代謝通路，其中圓點大小表示該代謝通路的重要程度。

Fig 10 Metabolic pathway enrichment of different metabolites of GES-1 and gastric cancer cells

3 討論

小豆蔻明(cardamonin，CAR)為存在于姜科山姜屬植物草豆蔻(AlpiniakatsumadaiHayata)干燥近成熟種子中的一種黃酮類化合物。目前研究證實，小豆蔻明在多種疾病中的潛在治療作用已得到廣泛研究，包括疼痛，炎癥性腸炎及癌癥在內的多種疾病類型[10]。目前，Wang等[11]在胃癌細胞AGS中證實，小豆蔻明通過抑制LncRNA-PVT1的表達，下調p-STAT3水平，并阻斷STAT3的激活，以誘導AGS細胞凋亡。同時，小豆蔻明具有劑量依賴性抑制TRPA1介導的鈣內流作用。考慮到TRPA1的異常表達情況與腫瘤進程的相關性，我們提出科學假說，小豆蔻明抑制胃癌發展進程作用的發揮是否跟TRPA1有關，其具體機制又是怎樣？進一步文獻檢索后我們發現，小豆蔻明能夠通過調節腫瘤細胞代謝抑制乳腺癌進程[12]，促使我們思考，正常細胞與胃癌細胞是否存在代謝產物的差異，通過靶向這種差異是否可能逆轉腫瘤進程？

本實驗結果表明，TRPA1在胃癌細胞中存在異常高表達現象，并與胃癌患者不良預后呈正相關。體外實驗發現，相比正常胃上皮細胞，胃癌細胞中TRPA1蛋白表達水平更高，且具有促進胃癌細胞遷移能力的作用，TRPA1抑制劑的給予逆轉了TRPA1的促轉移作用。同時，分子對接結果顯示，小豆蔻明可能作為一種潛在的TRPA1抑制劑，呈現出與TRPA1抑制劑相似的抑制腫瘤轉移作用。進一步利用細胞代謝組學對不同細胞的代謝差異產物進行分析，挖掘出天冬酰胺及肌醇相關通路可能為小豆蔻明抑制TRPA1介導的胃癌轉移的重要途徑。

本研究使用GC-MS技術，對正常胃上皮細胞及多株胃癌細胞系的代謝產物進行檢測及分析，結果發現，與正常胃上皮細胞相比，胃癌細胞代謝產物出現顯著變化，且多株胃癌細胞代謝產物存在交集，即胃癌細胞中天冬酰胺的產生均增加，而肌醇的產生均出現下降趨勢。結合TRPA1在胃癌中的異常表達現象及小豆蔻明對胃癌細胞轉移的抑制作用，我們猜想，天冬酰胺及肌醇相關的代謝通路是小豆蔻明通過TRPA1發揮抑制胃癌轉移的可能途徑。

上世紀80年代，已有文章證實，急性粒細胞型白血病細胞無法合成天冬酰胺，而依賴于正常細胞中合成的天冬酰胺，為腫瘤細胞供應能量，由此，靶向循環系統中的天冬酰胺能夠有效殺死腫瘤細胞[13]。而肌肉肌醇 (myo-inositol) 是人體中含量最高的一種肌醇，占全部肌醇含量的90%以上[14]，近年來，由于其在多種疾病包括腫瘤發生發展過程中的潛在治療作用被廣泛報道，受到了人們的重視[15]。我們證實，胃癌細胞中存在肌醇水平下降而天冬酰胺水平上升的現象。說明天冬酰胺或許是腫瘤細胞與正常細胞的標志性代謝差異產物，靶向天冬酰胺藥物的開發可能對于臨床腫瘤的治療起著一定的參考意義，而肌醇水平的恢復或許也是治療腫瘤的可能途徑。進一步對給予小豆蔻明前后MKN-45細胞差異代謝產物進行檢測，發現小豆蔻明在一定程度上具有恢復肌醇水平并抑制天冬酰胺的作用。靶向天冬酰胺及肌醇或許是小豆蔻明發揮抑癌作用的重要途徑，有待進行更深入地研究。

代謝組學作為一門研究內源性代謝小分子化合物含量變化的新興技術，能夠用以分析潛在腫瘤標志物，擴充基因組學及蛋白組學的研究結果。本研究基于GC-MS代謝組學手段，對正常胃上皮細胞及胃癌細胞的差異代謝產物進行檢測，未來還可利用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)及液相色譜-質譜法等技術手段對各類惡性腫瘤的代謝產物進行代謝譜解析，構建系統精準的癌細胞代謝產物庫。此外，給予藥物刺激后再次檢測細胞內代謝產物差異，能夠更加直觀的揭示藥物對細胞內代謝網絡的調控作用[16]，對于抗腫瘤藥物的開發具有重要意義。進一步聯合蛋白組學與基因組學共同分析，并應用于腫瘤的診斷、治療甚至預防過程，有益于指導臨床構建個體化治療方案，為精準醫療的實現提供技術手段。