對(duì)香豆酸改善嗅球切除小鼠抑郁樣行為及其AMPA受體機(jī)制

肖煦暉，李惠蓉，肖志勇，李金成，肖楚麗

(1. 邵陽(yáng)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2. 湘西南中藥開(kāi)發(fā)利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽(yáng) 422000；3. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

抑郁癥是一種常見(jiàn)的神經(jīng)精神疾病，約25%的人在其一生的某個(gè)時(shí)期遭受抑郁癥的困擾[1]。一線(xiàn)抗抑郁藥物存在起效慢、有效率低、毒副作用強(qiáng)等缺點(diǎn)，因此亟需開(kāi)發(fā)低毒有效的抗抑郁藥物。

α-氨-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPA受體)是一種離子型谷氨酸受體，通過(guò)快鈉離子通道的激活和失活介導(dǎo)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性谷氨酸的快速傳遞。研究表明，AMPA受體與突觸可塑性密切相關(guān)，并且參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[2]。NBQX是選擇性AMPA受體拮抗劑，可競(jìng)爭(zhēng)性與AMPA受體結(jié)合，進(jìn)而阻斷多種藥物的抗抑郁樣作用；CX546是AMPA受體選擇性激動(dòng)劑，可增強(qiáng)抗抑郁藥物的作用，這些證據(jù)表明AMPA受體參與多種藥物的抗抑郁樣作用[3-4]。

對(duì)香豆酸(p-coumaric acid，p-CA)是一種衍生自芳香族氨基酸的苯丙酸，具有抗氧化、抗瘧原蟲(chóng)和抗炎免疫作用[5-7]。越來(lái)越多的研究報(bào)道p-CA可改善腦缺血和記憶障礙[8-9],然而p-CA對(duì)抑郁癥中的作用卻研究甚少，特別地，在嗅球切除抑郁模型中的作用未見(jiàn)報(bào)道。該文擬建立嗅球切除(OBX)小鼠抑郁模型研究p-CA的抗抑郁作用，此外，考慮到p-CA可上調(diào)AMPA受體介導(dǎo)的場(chǎng)電位[10]，因此我們應(yīng)用AMPA受體拮抗劑NBQX和AMPA受體激動(dòng)劑CX546，進(jìn)一步研究其對(duì)p-CA抗抑郁樣作用的影響，以及明確AMPA受體對(duì)p-CA的抗抑郁樣行為有無(wú)關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6W ICR小鼠，♂，許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。(23±2) ℃，明暗周期12 h(其中7 ∶00-17 ∶00為明)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，自由攝食和飲水。

1.2 主要藥物對(duì)香豆酸，購(gòu)于阿拉丁公司，濃度為75 mg·kg-1[6]；NBQX購(gòu)于Selleck公司，濃度為0.5 mg·kg[6]；CX546購(gòu)于MCE公司，溶于生理鹽水中，劑量1 mg·kg-1,藥物和溶媒的注射體積為10 mL·kg-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1實(shí)驗(yàn)1 p-CA對(duì)OBX小鼠抑郁樣行為的影響。小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(Control)，假手術(shù)組(SHAM)，嗅球切除組(OBX)和嗅球切除+p-CA組(OBX+ p-CA)，每組9只，其中嗅球切除小鼠進(jìn)行嗅球摘除手術(shù)，假手術(shù)組小鼠除不摘除嗅球外其它手術(shù)過(guò)程相同，而對(duì)照組小鼠不進(jìn)行手術(shù)，手術(shù)后各組小鼠恢復(fù)21 d。d 22-24小鼠每天腹腔注射溶媒(10%吐溫80)或p-CA(75 mg·kg-1)，共3次，最后一次注射后1 h進(jìn)行曠場(chǎng)測(cè)試(OFT)，注射后3 h強(qiáng)迫游泳測(cè)試(FST)，藥物注射后24 h進(jìn)行懸尾測(cè)試。觀(guān)察小鼠在行為測(cè)試中的表現(xiàn)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)2 NBQX對(duì)p-CA改善OBX小鼠抑郁行為的影響。小鼠隨機(jī)分成嗅球切除組(OBX)，嗅球切除+NBQX組(OBX+NBQX)，嗅球切除+p-CA組(OBX+ p-CA)，嗅球切除+NBQX+ p-CA組(OBX+ NBQX+ p-CA)，每組9只，各組小鼠進(jìn)行嗅球摘除手術(shù)后小鼠恢復(fù)21 d。d 22-24 d小鼠每天腹腔注射溶媒1(10%吐溫80)或p-CA(75 mg·kg-1)，共3次，最后一次注射溶媒1或p-CA前30 min注射N(xiāo)BQX或溶媒2。P-CA注射后1 h進(jìn)行曠場(chǎng)測(cè)試(OFT)，注射后3 h強(qiáng)迫游泳測(cè)試(FST)，藥物注射后24 h進(jìn)行懸尾測(cè)試。觀(guān)察小鼠在行為測(cè)試中的表現(xiàn)。

1.3.3實(shí)驗(yàn)3 CX546對(duì)p-CA改善OBX小鼠抑郁行為的影響。小鼠隨機(jī)分成嗅球切除組(OBX)，嗅球切除+CX546組(OBX+CX546)，嗅球切除+p-CA組(OBX+p-CA)，嗅球切除+CX546+p-CA組(OBX+ CX546+ p-CA)，每組9只，各組小鼠進(jìn)行嗅球摘除手術(shù)后小鼠恢復(fù)21 d。d 22-24小鼠每天腹腔注射溶媒1(10%吐溫80)或p-CA(75mg/kg)，共3次，最后一次注射溶媒1或p-CA前30 min注射CX546或溶媒2。P-CA注射后1 h進(jìn)行曠場(chǎng)測(cè)試(OFT)，注射后3 h強(qiáng)迫游泳測(cè)試(FST)，藥物注射后24 h進(jìn)行懸尾測(cè)試。觀(guān)察小鼠在行為測(cè)試中的表現(xiàn)。

1.4 嗅球切除(OBX)小鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，剪毛后切開(kāi)顱骨上皮膚，用雙氧水腐蝕并呈現(xiàn)前囟點(diǎn)，以前囟點(diǎn)為原點(diǎn)向前5 mm，左右旁開(kāi)各1 mm，用直徑為2 mm顱骨鉆鉆孔，并搗碎嗅球，用真空泵吸出。用明膠海綿填塞孔，縫合皮膚并涂碘酒消毒。腹腔注射青霉素鈉，連續(xù)3 d以防止感染。OBX術(shù)后恢復(fù)時(shí)間各異，多數(shù)選擇14、21、30 d或45 d。當(dāng)前研究選擇術(shù)后恢復(fù)21 d。

1.5 曠場(chǎng)測(cè)試(OFT)[11]曠場(chǎng)測(cè)試在長(zhǎng)50 cm，寬50 cm，高60 cm的隔音箱中進(jìn)行，LED燈提供50 LUX的光強(qiáng)，排風(fēng)扇提供30 Hz的背景噪音。將小鼠輕輕地放入隔音箱中10 min，通過(guò)行為分析軟件Anymaze 6.10統(tǒng)計(jì)小鼠10 min的運(yùn)動(dòng)距離。每次測(cè)試前，使用75%的乙醇溶液清潔隔音箱內(nèi)壁及底部[12]。

1.6 懸尾測(cè)試(TST)懸尾測(cè)試在隔音箱中進(jìn)行，將小鼠鼠尾(在距尾尖1 cm處)用膠帶固定于細(xì)繩上并懸掛于隔音箱頂部6 min，小鼠頭部距箱底50 cm。攝像頭錄制該測(cè)試視頻并由實(shí)驗(yàn)者雙盲離線(xiàn)分析后4 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間。

1.7 強(qiáng)迫游泳測(cè)試(FST)測(cè)試時(shí)將小鼠放于水深15 cm、水溫(25±1)℃的透明玻璃桶(15 cm×20 cm)內(nèi)被迫游泳6 min，每結(jié)束一次實(shí)驗(yàn)，換水。攝像頭錄制該測(cè)試視頻并由實(shí)驗(yàn)者雙盲離線(xiàn)分析后4 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 p-CA改善OBX誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為Fig 1結(jié)果顯示，在FST中(Fig 1B)，與對(duì)照組相比，SHAM組小鼠不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)顯著性(P>0.05)，而與SHAM組相比，OBX組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.01)，此外，與OBX組相比，p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯降低(P<0.05)。在TST中(Fig 1C), 與對(duì)照組相比，SHAM組小鼠不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)顯著性(P>0.05)，而與SHAM組相比，OBX組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.05)，此外，與OBX組相比，p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯降低(P<0.05)。在OFT中(Fig 1A)，與對(duì)照組相比，SHAM組小鼠移動(dòng)距離差異無(wú)顯著性(P>0.05)，而與SHAM組相比，OBX組小鼠移動(dòng)距離明顯增加(P<0.01)，此外，與OBX組相比，p-CA組小鼠移動(dòng)距離明顯降低(P<0.01)。這些結(jié)果表明，p-CA能有效改善小鼠抑郁樣行為。

Fig 1 Effect of p-CA on depression-like behaviors of OBX mice n=9)

2.2 NBQX阻斷了p-CA對(duì) OBX小鼠抑郁樣行為的改善作用Fig 2結(jié)果顯示，在FST中(Fig 2B)，與OBX組相比，OBX+NBQX組小鼠不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.05)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ NBQX+ p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.05)。在TST中(Fig 2C)，與OBX組相比，OBX+NBQX組小鼠不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.05)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ NBQX+ p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.05)。在OFT中(Fig 2A)，與OBX+ Vehicle組相比，OBX+NBQX組小鼠移動(dòng)距離差異無(wú)顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組小鼠移動(dòng)距離明顯減少(P<0.01)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ NBQX+ p-CA組小鼠移動(dòng)距離明顯增加(P<0.05)。以上提示，NBQX能對(duì)抗p-CA對(duì)小鼠抑郁樣行為改善作用。

Fig 2 Effect of NBQX on p-CA improved depression-like behaviors of OBX mice n=9)

如Fig 3所示，在FST中(Fig 3B)，與OBX組相比，OBX+CX546組小鼠不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.05)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ CX546+ p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯降低(P<0.05)。在TST中(Fig 3C)，與OBX組相比，OBX+CX546組小鼠不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)顯著性(P>0.05)，而OBX+ p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.05)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ CX546+ p-CA組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.05)。在OFT中(Fig 3A)，與OBX+ Vehicle組相比，OBX+CX546組小鼠移動(dòng)距離差異無(wú)顯著性(P>0.05)而OBX+ p-CA組和OBX+ CX546+ p-CA組小鼠移動(dòng)距離明顯減少(分別為：P<0.05，P<0.01)；此外，與OBX+ p-CA組相比，OBX+ CX546+ p-CA組小鼠移動(dòng)距離差異無(wú)顯著性(P>0.05)。以上表明，CX546促進(jìn)了p-CA對(duì)小鼠抑郁樣行為的改善作用。

Fig 3 Effect of CX546 on p-CA improved depression-like behaviors of OBX n=9)

3 討論

目前研究顯示，OBX小鼠抑郁樣行為增加，注射p-CA可改善OBX小鼠抑郁樣行為,并且AMPA受體拮抗劑NBQX阻斷了p-CA的抗抑郁樣作用，而AMPA受體激動(dòng)劑CX546增強(qiáng)了p-CA的抗抑郁樣作用。

之前研究分別采用50mg·kg-1、75 mg·kg-1、100mg·kg-1的p-CA在一次LPS注射前24 h腹腔給藥，并于LPS注射后2 h或6 h檢測(cè)大鼠的抑郁樣行為，結(jié)果顯示50mg·kg-1和75mg·kg-1的p-CA對(duì)一次LPS注射誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為具有預(yù)防作用[5]。為進(jìn)一步驗(yàn)證p-CA對(duì)抑郁行為的治療作用，進(jìn)行了當(dāng)前研究，OBX小鼠被注射75mg·kg-1的p-CA，連續(xù)注射3 d后檢測(cè)小鼠的抑郁樣行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，p-CA慢性給藥明顯改善OBX小鼠FST和TST中小鼠抑郁樣行為。此外，OBX小鼠常常出現(xiàn)激越行為，即曠場(chǎng)測(cè)試中活動(dòng)度增加，這種激越行為是小鼠易激惹，應(yīng)激敏感性增加的表現(xiàn)，這與抑郁癥患者的敏感性相似。鑒于此，當(dāng)前研究檢測(cè)了對(duì)各組小鼠曠場(chǎng)測(cè)試中的活動(dòng)度，結(jié)果顯示與SHAM組小鼠相比，OBX小鼠OFT中活動(dòng)度增加，而p-CA降低了這種活動(dòng)度的增加。這些結(jié)果表明p-CA慢性給藥可治療OBX小鼠的抑郁樣行為。之前研究表明，p-CA可改善小鼠氧化應(yīng)激及腦缺血/再灌注損傷，改善東莨菪堿誘導(dǎo)大鼠被動(dòng)回避和水迷宮測(cè)試中記憶障礙。當(dāng)前研究進(jìn)一步明確了p-CA對(duì)抑郁樣行為的治療作用，從而拓展了p-CA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用。

嗅球切除是一種經(jīng)典的嚙齒類(lèi)抑郁模型，OBX小鼠表現(xiàn)出識(shí)別記憶、恐懼記憶和空間記憶障礙，絕望、快感缺失等抑郁樣行為，此外還具有高活動(dòng)度、睡眠障礙、高攻擊性等異常行為[12-13]。此外，其可導(dǎo)致皮層和海馬神經(jīng)元退化和死亡，體積萎縮，突觸棘密度減少，突觸可塑性降低[14]。 嗅球切除抑郁模型與一次LPS注射誘導(dǎo)的抑郁模型相比在表面效度和預(yù)測(cè)效度上更具優(yōu)勢(shì)。嗅球切除抑郁模型抑郁樣行為可持續(xù)終生，而一次LPS注射誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為一般持續(xù)1-2 d。在評(píng)估藥物抗抑郁作用方面，嗅球切除抑郁模型可進(jìn)行急性或慢性給藥，而一次LPS注射誘導(dǎo)的抑郁模型，只能進(jìn)行急性給藥，無(wú)法評(píng)價(jià)藥物慢性給藥的作用。此外，鑒于一些抗炎藥物也可以改善LPS注射誘導(dǎo)的抑郁模型的抑郁樣行為，因此這種模型并無(wú)法排除一些不具有抗抑郁作用的抗炎藥物。并且LPS抑郁模型小鼠往往伴隨其他的炎癥引起的疾病行為，如體溫升高，活動(dòng)度降低，攝食攝水減少等。

AMPA受體與突觸可塑性密切相關(guān)，并參與多種藥物的抗抑郁樣作用[3-4]。在慢性溫和應(yīng)激、慢性社會(huì)挫敗等抑郁模型中均觀(guān)察到腦中AMPA受體活性降低。一些抗抑郁藥物可增加AMPA受體在突觸的表達(dá)發(fā)揮抗抑郁樣作用。并且AMPA受體拮抗劑NBQX可阻斷抗抑郁藥物的抗抑郁作用[15-16]。為明確AMPA受體是否介導(dǎo)了p-CA的抗抑郁樣作用，本實(shí)驗(yàn)探索了AMPA受體拮抗劑NBQX和AMPA受體激動(dòng)劑CX546分別對(duì)p-CA的抗抑郁樣作用的影響。結(jié)果顯示當(dāng)最后一次p-CA給藥前30min注射AMPA受體拮抗劑NBQX時(shí)，AMPA受體拮抗劑NBQX單獨(dú)給藥不影響OBX小鼠抑郁樣行為，而NBQX阻斷了p-CA對(duì)OBX小鼠抑郁樣行為的改善作用。這些結(jié)果表明p-CA改善OBX小鼠抑郁樣行為可能依賴(lài)于A(yíng)MPA受體。當(dāng)最后一次p-CA給藥前30min注射AMPA受體激動(dòng)劑CX546時(shí)，AMPA受體激動(dòng)劑CX546單獨(dú)給藥不影響OBX小鼠抑郁樣行為，而CX546增強(qiáng)了p-CA對(duì)OBX小鼠抑郁樣行為的改善作用。這些結(jié)果表明p-CA改善OBX小鼠抑郁樣行為依賴(lài)于A(yíng)MPA受體。p-CA可能通過(guò)PKA、鈣調(diào)蛋白、ERK、mTOR等促進(jìn)AMPA受體生成或磷酸化促進(jìn)其遷移上膜的過(guò)程，最終促進(jìn)突觸區(qū)域AMPA受體功能的增強(qiáng)進(jìn)而介導(dǎo)其抗抑郁樣作用[17]。

綜上，當(dāng)前研究表明p-CA改善OBX小鼠抑郁樣行為，并且其作用可能依賴(lài)于A(yíng)MPA受體。然而當(dāng)前研究，無(wú)法判斷在嗅球切除抑郁模型及p-CA處理中AMPA受體是否發(fā)生改變。因此在將來(lái)的研究中應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)海馬、內(nèi)側(cè)前額葉皮層中AMPA受體蛋白的表達(dá)情況。