eNOS/PKG-1通路在L-精氨酸抗野百合堿所致大鼠右心室重構中的作用

任星橋，李曉彤，林小英，曾凡群，李葉麗，楊丹莉

(遵義醫科大學藥學院，基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563099)

右心室重構導致的心力衰竭是肺動脈高壓患者死亡的主要原因之一[1]。目前認為右心室重構主要涉及心肌細胞肥大、凋亡、炎癥、氧化應激及一氧化氮(nitric oxide，NO)缺乏等方面[2]。其中，內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化L-精氨酸(L-Arginine，L-arg)生成NO，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑NG-硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)可阻斷上述反應。L-NAME是NOS的抑制劑，能夠降低細胞內NO含量，誘導大鼠左心室肥厚[3]。eNOS的表達降低可引起NO生成減少，下游蛋白激酶G1(protein kinase G1，PKG-1)表達降低，使細胞內游離Ca2+濃度升高，導致血管收縮，心肌細胞肥大，促進心室重構的發生。PKG又稱環磷酸鳥苷依賴型蛋白激酶，有PKG-1和PKG-2兩種類型[4]，其中PKG-1主要分布于血管平滑肌細胞、心肌細胞的細胞質中，PKG-1可使肌球蛋白輕鏈去磷酸化，細胞內游離Ca2+濃度降低，產生舒張血管、抑制心肌細胞肥大等作用。野百合堿(monocrotaline，MCT)所致大鼠右心室重構模型，是目前常用于研究右心室重構的病理模型[5]。目前PKG-1在L-arg改善MCT所致右心室重構中的作用鮮有報道。本研究旨在借助工具藥L-NAME，探討eNOS/PKG-1通路在L-arg干預MCT所致大鼠右心室重構的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1藥品 MCT(產品編號：C2401-1G，Sigma公司)；L-精氨酸(產品編號：HY-N0455，MCT公司)；L-NAME(產品編號：HY-18729A，MCT公司)。

1.1.2試劑 cTnI兔單克隆抗體(產品編號：ab209809，abcam公司)；eNOS小鼠單克隆抗體(產品編號：ab76198，abcam公司)；PKG-1兔單克隆抗體(產品編號：#3248，Cell Signaling公司)；GAPDH兔多克隆抗體(產品編號：10494-1-AP，Proteintech公司)；β-actin兔多克隆抗體(產品編號：AF7018，Affinity公司)；HRP標記山羊抗兔IgG(產品編號：S0001，Affinity公司)；HRP標記山羊抗小鼠IgG(產品編號：SA00001-1，Proteintech公司)。

1.2 儀器PowerLab/8SP生物監測儀(澳大利亞AD instruments公司)；BX43+DP2b正置顯微鏡及照相系統(日本Olympus公司)；5417R離心機(德國Eppendorf公司)；Supply Mini-Protean 3電泳儀(美國BIO-RAD公司)；Mini Trans-Blot轉移系統(美國BIO-RAD公司)；ChemiDoc成像系統(美國BIO-RAD公司)。

1.3 實驗動物及分組體質量(180-220) g，♂SD(Sprague Dawley，SD)大鼠20只，無特定病原體(specific pathogen-free animal)SPF級，購買于長沙天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。適應性喂養1周，飼養條件：室溫19℃-25℃，相對濕度40%-70%，將所有SD大鼠隨機分為正常對照組(Control組)、模型組(MCT組)、L-精氨酸組(L-arg組，200 mg·kg-1)和L-精氨酸+L-NAME組(L-arg+L-NAME組，200、20 mg·kg-1)。除Control組，其余各組大鼠均采用頸背部一次性皮下注射MCT(55 mg·kg-1)，建立右心室重構模型，Control組大鼠頸背部一次性皮下注射等體積生理鹽水作對照。造模14 d后開始給藥，L-arg組和L-arg+L-NAME組大鼠每日腹腔注射L-arg，其中L-arg+L-NAME組大鼠每日灌胃L-NAME，Control組和MCT組大鼠每日灌胃等體積雙蒸水，持續14 d。

1.4 血流動力學檢測給藥14 d后，采用右心導管術檢測大鼠右心室壓。大鼠稱質量，剪開頸部右側皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，游離頸外右靜脈。將連接壓力傳感器的導管慢慢推入右側頸外靜脈，經右心房插入右心室，記錄右心室壓力波形變化。

1.5 大鼠右心室質量指數的測定血流動力學檢測后摘取心臟，迅速置于預冷的生理鹽水中清洗，于冰上分離右心室游離壁，濾紙蘸干水分，稱質量記錄，計算右心室質量指數=右心室質量/體質量。

1.6 右心室形態學觀察取大鼠右心室組織置于4%甲醛溶液中，固定48 h。脫水、石蠟包埋、制備組織切片，厚度約為3 μm，進行HE染色，中性樹脂封片。自然晾干后，于Olympus正置顯微鏡下觀察右心室病理學變化并拍照。

1.7 Western blot檢測大鼠右心室cTnI、eNOS和PKG-1蛋白的表達稱取大鼠右心室組織約50 mg剪碎，加入0.5 mL裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF溶液 ∶蛋白磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)，使用眼科剪置于冰上剪碎，冰上靜置裂解30 min后配平離心，條件：4 ℃、12 000 r·min-1、15 min，吸取上清液于-80 ℃冰箱保存。BCA法測定上清液的蛋白含量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠(上層5%濃縮膠，下層12%或8%分離膠)，蛋白樣品經電泳分離后，使用半干轉印槽轉移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，7%脫脂牛奶搖床室溫封閉約3 h，TBST洗去牛奶(每次10 min，共3次)，4 ℃過夜孵育一抗(>16 h)：cTnI(1 ∶2 500)、eNOS(1 ∶1 000)、PKG-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)、β-actin(1 ∶5 000)，TBST洗膜，室溫孵育二抗(1 ∶5 000)約40 min、TBST洗膜后使用化學發光試劑(ECL)，于成像系統獲取圖像進行分析。

2 結果

2.1 L-arg對大鼠右心室最大壓的影響給藥14 d后，與Control組相比，MCT組大鼠右心室最大壓明顯升高(P<0.05)是Control組的1.74倍；與MCT組相比，L-arg組大鼠右心室最大壓降低35.95%(P<0.05)；與L-arg組相比，L-arg+L-NAME組大鼠右心室最大壓明顯升高(P<0.05)，是L-arg組1.51倍。

Fig 1 Effect of L-arg on right ventricular max pressure in rats n=5)

2.2 L-arg對大鼠一般狀況、體質量、右心室質量指數的影響給藥14 d后觀察，Control組大鼠毛色光澤、呼吸平穩、體質量逐漸增加；MCT組大鼠毛色發暗、呼吸急促、活動和進食減少、體質量逐漸減輕；L-arg組大鼠毛色較為光滑、呼吸較為平穩；L-arg+L-NAME組大鼠一般狀況與MCT組大鼠一致。與Control組相比，MCT組大鼠體質量明顯降低(P<0.05)，右心室質量指數明顯升高(P<0.05)；與MCT組相比，L-arg組大鼠體質量明顯增加(P<0.05)，右心室質量指數明顯下降(P<0.05)；L-arg+L-NAME組大鼠相較于L-arg組右心室質量指數明顯升高(P<0.05)，體質量明顯下降(P<0.05)。

2.3 L-arg對大鼠右心室病理學的影響HE染色發現，Control組大鼠右心室無明顯病理學損傷，其心肌細胞排列有序，細胞形態正常；MCT組大鼠右心室心肌細胞明顯肥大且排列紊亂，伴隨炎性細胞浸潤；L-arg組大鼠右心室心肌細胞排列較為整齊，心肌細胞肥大有所改善；L-arg+L-NAME組大鼠右心室心肌細胞肥大，且排列紊亂，細胞間質出現腫脹，伴有炎性細胞浸潤。

Tab 1 Effect of L-arg on body weight and right ventricular mass index in rats n=5)

Fig 2 Effect of L-arg on right ventricular morphology in ratsA：Control；B：MCT；C：L-arg；D：L-arg+L-NAME

2.4 L-arg對大鼠右心室cTnI蛋白表達的影響Western blot結果發現，與Control組相比，MCT組大鼠右心室cTnI蛋白表達明顯上調，是Control組的1.15倍(P<0.05)。與MCT組相比，L-arg組大鼠右心室cTnI蛋白表達下調36.16%(P<0.05)，L-arg+L-NAME組大鼠右心室cTnI蛋白的表達與L-arg組相比上調36.44%(P<0.05)。

Fig 3 Effect of L-arg on the protein expression of cTnI in right ventricle of rats n=3)

2.5 L-arg對大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表達的影響Western blot結果發現，與Control組相比，MCT組大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表達分別下調41.83%、45.16%(P<0.05)。與MCT組相比，L-arg組大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表達分別上調73.42%、56.56%(P<0.05)，L-arg+L-NAME組大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白的表達與L-arg組相比分別下調38.25%、40.97%(P<0.05)。

Fig 4 Effect of L-arg on the protein expression of eNOS and PKG-1 in right ventricle of rats n=3)

3 討論

L-arg是一種人工合成的強效血管擴張劑，也是體內NO的供體，上調L-arg水平時，NO的生成增多[6]。研究表明，L-arg干預可改善冠狀動脈左前降支結扎法誘導的大鼠急性心肌梗死[7]。MCT是一種吡咯烷生物堿，在肝臟內經P450單氧化酶轉化為野百合堿吡咯[8]，破壞肺血管內皮細胞，引起肺血管不可逆性損傷，導致肺動脈壓力升高，繼發右心室重構，嚴重可發展為右心衰竭甚至死亡。目前常用皮下注射或腹腔注射MCT的方法[9]，制備研究肺動脈高壓和右心室重構的病理模型。本研究借用工具藥L-NAME，探討eNOS/PKG-1通路在L-arg干預右心室重構中作用。

本研究結果顯示，與Control組相比，MCT組大鼠體質量明顯減輕；右心室最大壓和右心室質量指數明顯升高；心肌細胞出現肥大，且排列紊亂，伴有炎性細胞浸潤，說明MCT組大鼠出現右心室重構，造模成功，與文獻報道相符[10-11]。與MCT組相比，L-arg組大鼠體重明顯增加；右心室最大壓和右心室質量指數均明顯降低；心肌細胞肥大、排列紊亂、炎性浸潤均明顯減輕，說明L-arg可改善MCT所致大鼠右心室重構。與L-arg組相比，L-arg+L-NAME組大鼠在右心室最大壓、右心室質量指數、病理結果各方面變化趨勢與MCT組相較一致，提示L-NAME作為NOS的抑制劑，可以逆轉L-arg抗MCT所致右心室重構的作用。

心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)是一種心肌細胞的結構蛋白，由cTnT、cTnC和cTnI 3個亞基組成。正常情況下，胞質內游離的cTnI較少，當心肌細胞受損時，結合于心肌結構蛋白中的cTnI等亞基逐漸分解并通過受損的心肌細胞膜入血。因此，cTnI是公認的特異性心肌損傷標志物。臨床通過檢測血清中cTnI的含量以判斷心肌損傷[12]。有文獻報道，五味子醇甲通過下調心肌細胞cTnI蛋白的表達可改善去甲腎上腺素誘導的H9C2心肌細胞肥大[13]。本研究結果顯示，與Control組相比，MCT組右心室組織cTnI蛋白表達上調；L-arg能抑制MCT所致的右心室組織cTnI蛋白表達的上調；而L-NAME作為eNOS的抑制劑能抑制L-arg的上述作用。結合L-arg可以抑制MCT引起的右心室肥大等結果，提示L-arg可能通過抑制cTnI亞基從心肌結構蛋白中解離從而抑制右心室重構。

在心肌細胞內，eNOS催化L-arg生成NO，NO可以活化可溶性鳥苷酸環化酶，生成環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，繼而激活PKG-1，產生舒張血管，抑制心肌細胞肥大等多種作用。本研究結果顯示MCT組大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白的表達均下調。有研究發現在MCT誘導的大鼠右心室重構中，右心室eNOS的表達和/或PKG蛋白的表達下調[14-15]；朱鳴等[16]發現左心室重構的發生與缺乏PKG密切相關。綜合以上分析，提示eNOS和PKG-1的表達被抑制與MCT所致大鼠右心室重構相關。有文獻報道[17]，KMUP-1通過上調左心室組織eNOS蛋白的表達，使NO生成增多，繼而cGMP生成增多、PKG-1蛋白的表達升高，從而改善異丙腎上腺素所誘導的大鼠左心室重構。本研究結果顯示：L-arg作為eNOS的底物供體，能抑制MCT所致的右心室組織eNOS和PKG-1蛋白的表達下調；而L-NAME作為eNOS的抑制劑能抑制L-arg的上述作用。綜合以上分析，L-arg可能通過增加eNOS的底物而促使NO生成增加，從而激活NO-cGMP-PKG信號通路；另一方面，L-arg還通過上調eNOS的表達，激活NO-cGMP-PKG信號通路，繼而改善MCT所致的右心室重構。

綜上所述，L-arg具有改善MCT所致大鼠右心室重構的作用，其機制可能與上調eNOS/PKG-1的信號通路有關。

(致謝：本實驗在遵義醫科大學基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室完成！)