鞣花酸通過內質網應激和線粒體損傷途徑促進人宮頸癌細胞凋亡

周 瑤，李 晶

(1. 湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100; 2. 湖州師范學院醫學院，浙江 湖州 313000)

宮頸癌是全球女性中第四大常見癌癥[1]，也是很多國家女性腫瘤患者死亡的第三大原因。目前宮頸癌的治療手段包括手術、放療和化療，效果有限，復發率高，各種副作用大。據報道，鞣花酸是一種多酚類物質[2]，是沒食子酸的二聚體衍生物，具有反式沒食子酸的單寧結構，具有各種活性，包括抗炎、抗氧化、抗病毒和抗癌活性[3]，但鞣花酸對宮頸癌細胞的殺傷作用及其機制目前報道尚少。我們推測鞣花酸可抑制人宮頸癌細胞探討鞣花酸對宮頸癌細胞的作用及分子機制，探索新的潛在治療方法對于加強宮頸癌的防治具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 GRP78(#3177)、CHOP(#2895)、PERK(#5683)、pPERK(#3179)、Bcl-2(#15071)、Bax(#5023)、cleaved caspase-3(#9661)、β-actin(#3700)抗體購自美國CST公司；IRE1(ab37073)、p-IRE1(ab124945)抗體購自美國Abcam公司；鞣花酸(#E2250)購自美國Sigma公司；DMEM培養基，購自美國HyClone公司；BCA蛋白定量試劑盒，購自VazymE公司。

1.1.2儀器 凝膠成像系統(上海嘉鵬科技有限公司)；電泳槽、電轉膜儀(伯樂生命醫學產品有限公司)；多功能酶標儀(北京楠華科技開發有限公司)；超凈工作臺(吳江市偉峰凈化設備有限公司)；恒溫空氣浴搖床(上海晶壇儀器制造有限公司)；細胞CO2培養箱(Thermo公司)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1鞣花酸的配制 用DMSO溶解鞣花酸，使其達到100 mmol·L-1作為母液，用DMEM稀釋成工作液，渦旋混勻后使用。

1.2.2細胞培養 Hela細胞株購自中國科學院上海細胞庫(中國上海)。細胞是在Dulbecco改良的Eagle培養基(Invitrogen)中添加10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素培養于37 ℃、5% CO2的濕化培養箱中。

1.2.3實驗分組 1)MTT實驗分組：①鞣花酸濃度梯度: control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、鞣花酸(1、5、30、100 μmol·L-1)刺激24 h組。②鞣花酸時間梯度: control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、鞣花酸(30 μmol·L-1)刺激0、12、24、48 h組。

2)流式細胞及熒光顯微鏡檢測：control組(同等體積的PBS)、鞣花酸(1、5、30、100 μmol·L-1)刺激24 h組。

3)免疫印跡法：①鞣花酸濃度梯度: control組(同等體積的PBS)、鞣花酸(1、5、30、100 μmol·L-1)刺激24 h組。②抑制劑干擾試驗: control組(同等體積的PBS)、鞣花酸(30 μmol·L-1)刺激24 h組、鞣花酸 30 μmol·L-1+4-phenylbutyric acid(4-PBA)20 μmol·L-1組。

1.2.4MTT檢測細胞增殖 采用MTT法測定鞣花酸對Hela細胞生存率的影響。在96孔板中培養1×104個細胞，在37 ℃條件下用不同濃度的鞣花酸刺激細胞24 h；另一組實驗中，用10 μmol·L-1鞣花酸刺激細胞0、12、24、48 h。然后，取出培養基，加入MTT，37 ℃下孵育4 h，加入150 μL DMSO，在570 nm處用micro-plate reader(Thermo Fisher Scientific, Inc.)讀取吸光度。

1.2.5TUNEL(TdT-mediated dUTP nick-end labeling)染色檢測細胞凋亡 細胞在玻片上培養，暴露于橙皮素中24 h。載玻片在4%多聚甲醛溶液中固定30 min，0.2% Triton X-100處理5 min，PBS洗滌兩次，末端脫氧核苷轉移酶熒光素標記。隨后，細胞在室溫環境下用DAPI(4′,6-Diamidino-2-Phenylindole，Dihydrochloride)染色3 min。所有圖像均使用模型DMi8(徠卡微系統有限公司，德國)獲取。

1.2.6免疫印跡法檢測蛋白表達 細胞裂解30 min后，13 000×g離心20 min。上清蛋白采用BCA試劑盒定量，進行SDS-PAGE電泳。然后使用半干轉移裝置或濕轉移裝置將蛋白從凝膠轉移到PVDF膜上。膜被封閉在5%的牛奶中1 h，用抗體孵育，使用增強化學發光的化學顯微鏡微型成像系統進行可視化處理。條帶使用ImageJ軟件分析。

2 結果

2.1 鞣花酸對人宮頸癌細胞生存率的影響體外培養人宮頸癌Hela細胞，分組處理不同濃度鞣花酸24 h。如Fig 1A所示，隨著鞣花酸濃度的增加，細胞生存率呈現濃度依賴性下降趨勢，尤其鞣花酸濃度在30 μmol·L-1時，細胞生存率開始出現明顯降低(P<0.05)。Fig 1B結果顯示，30 μmol·L-1的鞣花酸刺激細胞0、12、24、48 h后，細胞生存率呈現時間依賴性下降趨勢，尤其在24 h時，細胞生存率開始出現明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Effect of ellagic acid on survival rate of human cervical cancer cells

2.2 鞣花酸對人宮頸癌細胞凋亡水平的影響如Fig 2所示，經熒光顯微鏡檢測發現，不同濃度鞣花酸刺激細胞，細胞內TUNEL標記的紅色熒光呈現濃度依賴性增強趨勢，尤其鞣花酸濃度為30 μmol·L-1時細胞內紅色熒光開始出現明顯增加(P<0.05)。如Fig 3所示，經流式細胞檢測發現，不同濃度鞣花酸刺激細胞，細胞內紅色熒光強度呈現濃度依賴性增加趨勢，尤其鞣花酸濃度在30 μmol·L-1時，細胞內紅色熒光開始出現明顯增加(P<0.05)。

Fig 2 Effect of ellagic acid on apoptosis of human cervical cancer cells detected by fluorescence microscopy (scale bar: 50 μm)

Fig 3 Effect of ellagic acid on apoptosis of human cervical cancer cells detected by flow cytometry

2.3 鞣花酸對人宮頸癌細胞中內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)-線粒體凋亡通路的影響如Fig 4A及4B所示，不同濃度鞣花酸刺激Hela細胞24 h時，ERS信號通路蛋白GRP78、CHOP、p-PERK及p-IRE1蛋白表達呈濃度依賴性升高趨勢(P<0.05)，鞣花酸給藥濃度為30 μmol·L-1時蛋白表達開始明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。如Fig 5A所示，不同濃度鞣花酸刺激Hela細胞24 h時，線粒體抗凋亡蛋白Bcl-2表達呈濃度依賴性降低趨勢(P<0.05)，線粒體促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表達呈濃度依賴性升高趨勢(P<0.05)，鞣花酸給藥濃度為30 μmol·L-1時，蛋白表達的變化開始，差異具有統計學意義(P<0.05)。如Fig 5B所示，鞣花酸給藥濃度為30 μmol·L-1時，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Bax、cleaved caspase-3等蛋白的表達明顯升高(P<0.05)。而預處理ERS抑制劑4-PBA可以明顯抵消鞣花酸的促凋亡作用(P<0.05)。

Fig 4 Effects of ellagic acid on expression of

Fig 5 Effect of ellagic acid on expression of mitochondrial apoptosis pathway related proteins in human cervical cancer cells n=3)

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一[4]，嚴重威脅著婦女的健康。宮頸癌的復發和轉移率高，死亡率也高[5-7]。因此，如何抑制腫瘤的生長、復發和轉移，降低死亡率，延長患者的無病生存，提高生活質量，是目前亟待解決的關鍵問題。

在該研究中，我們采用不同濃度的鞣花酸(1、5、30、100 μmol·L-1)分別處理宮頸癌Hela細胞24及48 h，發現Hela細胞的生存率有濃度及時間依賴性降低的趨勢，尤其用30 μmol·L-1鞣花酸刺激24 h時Hela細胞的生存率開始出現明顯的降低。這個結果提示我們，鞣花酸可以對宮頸癌細胞的生長起到明顯的抑制作用。為了進一步觀察鞣花酸對宮頸癌細胞的促凋亡作用，我們用TUNEL凋亡檢測試劑盒進行了細胞免疫熒光染色實驗，用熒光顯微鏡和流式細胞檢測儀檢測了細胞內的紅色熒光強度，從結果可以看出，鞣花酸可以明顯增加細胞內紅色熒光，呈濃度依賴性趨勢。這些結果充分地說明了鞣花酸對宮頸癌細胞的促凋亡作用。

在腫瘤發生的過程中，細胞經常會遇到缺氧、營養缺失、蛋白酶體功能障礙和蛋白質突變等問題。癌細胞由于不受控制的增殖和生長，對內質網蛋白的折疊和組裝能力要求很高，這可能導致錯誤折疊蛋白的積累，觸發ERS[9]。最近的研究通過揭示未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)對細胞轉化、炎癥、腫瘤血管生成、腫瘤侵襲性、腫瘤侵襲和轉移的影響，增加了我們對ERS與腫瘤生物學關系的了解[10]。內質網中的蛋白穩定被強調為癌癥發展和侵襲性的關鍵因素之一[11]，一些UPR成分如GRP78[12]和CHOP[13]已被報道為獨立預后的生物標志物。ERS時，從PERK、IRE1等ER跨膜蛋白GRP78解離，發生蛋白折疊，UPR通路激活[14]，上調凋亡相關轉錄因子C/EBP同源蛋白CHOP的表達，有報道也提出，CHOP上調與線粒體通路相關[15]。本研究結果提示，鞣花酸可以誘發人宮頸癌細胞內ERS相關蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1、CHOP的表達及線粒體促凋亡蛋白BAX及cleaved caspase-3的表達，同時降低線粒體抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，而預處理ERS抑制劑可以明顯逆轉鞣花酸誘發的線粒體凋亡相關蛋白的改變。這些結果表明，鞣花酸可以調控人宮頸癌細胞內ERS-線粒體凋亡信號通路，促進細胞凋亡。

綜上所述，鞣花酸能通過ERS信號通路的調控，導致線粒體功能紊亂，最終誘導線粒體介導的腫瘤細胞凋亡，發揮腫瘤細胞殺傷作用，本研究為鞣花酸的抗腫瘤應用提供了依據和理論基礎。