基于網絡藥理學和細胞實驗探討Hispolon抗結腸癌的作用機制

李俊峰，吳力超，王 進，孫騰飛，趙俊慧，張婷婷，劉文洪

(浙江中醫藥大學 1.基礎醫學院、2.研究生院，浙江 杭州 310053)

結腸癌是一種常見且致命的人類消化道惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤中的發病率和死亡率均位居前列[1]，嚴重威脅人類健康。目前臨床主要治療手段是手術切除聯合化療，但對長期健康產生各種不良影響，包括腸功能障礙、膀胱功能障礙和性功能障礙[2]。因此，迫切需要開發具有低副作用的高效藥物。

中藥及其提取物在內的天然活性產物，以其資源豐富、作用溫和、毒副作用小而用于治療結腸癌，逐漸成為研究的熱點[3]。Hispolon是從藥用真菌桑黃中提取分離的一種酚類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種活性[4-6]。目前已證實在前列腺癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、腎癌等多種癌細胞中表現出抗腫瘤作用，而且Hispolon類似物能顯著抑制結腸癌細胞的增殖[7]，但其作用機制尚未闡明。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，融合了生物信息學和藥理學的概念和方法，探索中藥或化合物與疾病的相互作用，指導新藥研發[8]。網絡藥理學強調對信號通路的多途徑調節，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗的成功率。本研究擬通過網絡藥理學篩選出Hispolon治療結腸癌的作用靶點，研究藥物、靶點、通路之間的網絡關系，并通過細胞實驗驗證部分關鍵靶點，為揭示Hispolon的作用機制提供理論參考，為開發抗結腸癌藥物提供一定的科學依據。本研究流程圖見Fig 1。

Fig 1 Workflow of Hispolon in treatment of colon cancer

1 材料與方法

1.1 數據庫PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss ADME網站(http://www.swissadme.ch/index.php)；Swiss Target Prediction網站(http://www.swisstargetprediction.ch/)；Genecard數據庫(https://www.genecards.org/)；OMIM數據庫(https://omim.org/)；Draw Venn Diagram網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/venn/)；STRING11.0數據庫(https://string-db.org/)；Metascape數據庫(http://metascape.org)。

1.2 Hispolon的ADME相關特征Swiss ADME(http://www.swissadme.ch/index.php)包含每種化合物的吸收、分布、代謝和排泄(absorption, distribution, metabolism and excretion, ADME)特征的信息，用于評估小分子的理化性質，如相對分子質量(MW)、氫鍵供體數(hdon)、氫鍵受體數(hacc)、脂水分配系數(LogPo/w)、溶解度(solubility)等；評估藥代動力學，如胃腸道吸收(gastrointestinal absorption)；評估類藥性，如生物利用度得分(bioavailability score)；評估藥物化學友好性，如開發成藥物的綜合可能性(synthetic accessibility)。

1.3 Hispolon潛在靶點獲取利用Hispolon的CAS號(173933-40-9)從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得Hispolon的2D結構(Fig 2)及SDF文件，將SDF文件導入SwissTargetPrediction網站(http://www.swisstargetprediction.ch/)，設置屬性為“Homo sapiens”，篩選Probability>0進行靶點預測，獲取Hispolon的潛在靶點。

Fig 2 Structure of Hispolon (CAS: 173933-40-9)

1.4 結腸癌相關靶點收集以“結腸癌(colon cancer)”為關鍵詞輸入Genecard數據庫(https://www.genecards.org/)，選取Relevance score>6.25的靶點；輸入OMIM數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man, https://omim.org/)，收集驗證過的靶點，均設置屬性為“Homo sapiens”，將檢索結果合并篩重得到結腸癌相關靶點。

1.5 藥物與疾病共同靶點篩選及互作網絡構建使用Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/venn/)對結腸癌靶點和Hispolon潛在靶點比對取交集，獲取藥物與疾病的共同靶點，繪制韋恩圖(Venn)，這些共同靶點代表Hispolon治療結腸癌的潛在作用靶點。

利用STRING 11.0數據庫(https://string-db.org/)構建共同靶點蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，將生物種類設定為“Homo sapiens”，其余均為默認設置。采用Cytoscape 3.7.2軟件以大于節點度值(Degree)的中位數兩倍為拓撲指標，對PPI網絡進行拓撲可視化分析，篩選對該網絡起主要調控作用的重要靶點。

1.6 核心靶點分析使用Cytoscape3.7.2軟件的插件Cytohubba和MCODE挖掘Hispolon作用于結腸癌的PPI網絡的核心靶點[9]。

CytoHubba是Cytoscape軟件中尋找核心靶點的一個插件，用于發現復雜網絡中的關鍵目標。利用Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/venn/)對Cytohubba得出的結果進行分析，得到的重疊靶點即為核心靶點。MCODE可以將基因網絡中的關鍵靶點模塊提取出來，發現PPI網絡中相互作用的密集區域，即各聚集的模塊，選擇得分最高的模塊作為分析對象，從而找出核心靶點。CytoHubba和MCODE的參數均為默認設置。

1.7 GO和KEGG富集分析利用Metascape數據庫(http://metascape.org)將獲取的Hispolon治療結腸癌的所有潛在靶點進行生物信息學在線分析，包括基因本體(gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析，以P<0.05為標準，篩選出顯著性GO富集項目及靶點參與的關鍵通路信息。應用R語言軟件對以上分析結果可視化。同時將藥物、相關靶點、通路信息導入Cytoscape3.7.2軟件，構建Hispolon治療結腸癌的“藥物-靶點-通路”網絡。

1.8 細胞實驗驗證

1.8.1材料 人結腸癌SW480細胞購自上海吉凱基因化學技術有限公司；Hispolon(純度98%以上)由浙江中醫藥大學病原生物與免疫學教研室提供。RPMI 1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素、二甲基亞砜均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司；BCL-2L1、mTOR抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗均購自英國abcam公司。

1.8.2細胞培養和分組 SW480細胞培養于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養液中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度下，細胞生長對數期進行傳代、備用。分別設置空白組、對照組(即Hispolon 0 μmol·L-1)、Hispolon實驗組(25、50、100 μmol·L-1)，用藥處理時間為24 h。

1.8.3CCK-8檢測結腸癌SW480細胞增殖情況 取對數期細胞以5×104個/孔接種于96孔板，培養24 h后，實驗組加入對應的含藥培養液，對照組為含細胞等量培養液，并設置不含細胞的空白組，每組設5個復孔。繼續培養24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃孵育2 h，用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度(A)值，根據公式計算細胞存活率。

細胞存活率/%=(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)×100%

1.8.4Western blot檢測SW480細胞中部分關鍵靶點的表達 收集細胞，加細胞裂解液100 μL，冰上充分裂解30 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，收集上清液，采用BCA試劑盒定量蛋白濃度，10% SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，冰上轉膜120 min。轉膜結束，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗BCL-2L1(1 ∶1 000)、mTOR(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1000)，4 ℃孵育過夜。除去一抗后，加入酶標二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h。最后ECL化學發光顯影，采集圖像并分析灰度值。

2 結果

2.1 Hispolon的ADME特征通過Swiss ADME對Hispolon的ADME特征進行了深入研究，如理化性質(包括MW、hdon、hacc、LogPo/w、solubility等)、藥代動力學(如gastrointestinal absorption)、類藥性(如bioavailability score)和藥物化學友好性(如synthetic accessibility)，結果顯示，Hispolon可溶、胃腸道吸收程度高、生物利用度好，開發成藥物的綜合可能性高(Tab 1)。

Tab 1 Pharmacological and molecular properties of Hispolon

2.2 Hispolon和結腸癌潛在靶點獲取利用Swiss Target Prediction網站對Hispolon進行靶點預測，共獲得107個潛在靶點(Fig 3)。通過Genecard數據庫與OMIM數據庫檢索，分別得到2 675、499個與結腸癌相關的疾病靶點，通過數據庫整合，去除重復靶點，最終獲得結腸癌疾病相關靶點3 019個。

Fig 3 Potential target genes related to Hispolon

2.3 共同靶點PPI網絡構建繪制Venn圖的結果顯示，通過匹配107個藥物靶點和3 019個疾病靶點，篩選出69個共同靶點(Fig 4)，這69個共同靶點即是Hispolon抗結腸癌的潛在靶點。

Fig 4 Potential targets of Hispolon against colon cancer

基于STRING 11.0數據庫得到共同靶點的PPI網絡，互作網絡中有69個節點和326條邊，節點代表Hispolon與結腸癌的共同靶點，邊代表靶點間的互作關系。Degree常用于說明網絡節點的重要性，值越大，說明該節點在網絡中越重要。將PPI網絡中Degree中位數的兩倍即16作為拓撲指標，篩選得到10個重要靶點包括EGFR、MTOR、MMP9、AR、BCL-2L1、MMP2、EP300、TLR4、CDK1、CDK4。

2.4 核心靶點分析結果CytoHubba分析獲得BCL-2L1、EP300、CDK1、AR、MTOR、EGFR共6個核心靶點(Fig 5A)。MCODE分析獲得了得分最高的模塊，分數為7.067。該模塊包含了從CytoHubba分析中獲得除AR外的其余5個核心靶點，進一步證實了BCL-2L1、EP300、CDK1、MTOR和EGFR 5個核心靶點的重要性(Fig 5B)。

Fig 5 The core genes analyzed by CytoHubba and MCODE

2.5 GO富集分析結果通過Metascape數據庫對Hispolon治療結腸癌的潛在靶點進行GO分析，富集結果顯示，具有生物學過程(biological process, BP)1 140條，分子功能(molecular function, MF)61條，細胞成分(cellular component, CC)50條，根據P值大小各篩選出前10條展示(Fig 6)。由圖可知，涉及到的主要生物學過程包括對受傷的反應(response to wounding)、細胞對有機氮化合物的反應(cellular response to organonitrogen compound)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路(transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway)等，參與的分子功能主要包括蛋白激酶活性(protein kinase activity)、磷酸轉移酶活性(phosphotransferase activity, alcohol group as acceptor)、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)等，主要細胞成分有細胞質核周區域(perinuclear region of cytoplasm)、轉移酶復合體(transferase complex)、核包膜(nuclear envelope)等。

Fig 6 Go enrichment analysis for targets of Hispolon against colon cancer (TOP 10)

2.6 KEGG富集分析結果KEGG通路分析結果表明，Hispolon治療結腸癌主要集中在120條信號通路中(P<0.05)。根據P值大小篩選出前20條KEGG通路，利用R語言軟件繪制氣泡圖(Fig 7)。由圖可知，69個靶點主要富集在癌癥相關通路(pathways in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、前列腺癌相關通路(prostate cancer)、癌癥中MicroRNA相關通路(microRNAs in cancer)等，表明Hispolon可通過多條通路的協調作用發揮抗結腸癌作用。

Fig 7 The bubble chart of KEGG pathway analysis (TOP 20)

將篩選的前20條通路、相關靶點、藥物，利用Cytoscape3.7.2構建藥物-靶點-通路網絡。該網絡由1個藥物、44個靶點、20條通路組成，共有65個節點，252條邊，節點代表藥物、靶點或通路，邊代表藥物、靶點及通路之間的關系。以整個網絡Degree中位數即8，篩選出重要的節點。結果顯示，靶點節點中有11個具有高Degree，包括EGFR、MTOR、BCL-2、IGF1R、BRAF、GSK3B、IKBKB、PDPK1、BCL-2L1、CDK4、EP300；通路節點中有7條通路具有高Degree且與癌癥密切相關，分別是癌癥相關通路、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌相關通路、癌癥中microRNAs相關通路、乳腺癌相關通路、肝細胞癌相關通路、膀胱癌相關通路；其中，核心靶點BCL-2L1、EP300、MTOR和EGFR富集在重要通路包括癌癥相關通路、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌相關通路、癌癥中microRNAs相關通路等，提示Hipolon抗結腸癌呈現出多靶點、多通路協同作用的特點。

2.7 Hispolon對結腸癌SW480細胞增殖的影響不同濃度Hispolon作用SW480細胞24 h后，呈現出濃度依賴性抑制細胞增殖。與對照組相比，細胞存活率逐漸降低(Fig 8)。

Fig 8 Effect of Hispolon on viability of SW480 cells n=3)

2.8 Hispolon對結腸癌SW480細胞中部分關鍵靶點蛋白表達的影響與對照組相比，各組Hispolon能不同程度下調BCL-2L1和mTOR蛋白的表達(Fig 9)。

3 討論

近年來，隨著中醫藥的不斷發展，天然產物已成為發現重要先導藥物的主要源泉。尤其從天然產物中分離得到具有較高生物活性的單體成分成為研究熱點，對其藥理活性和作用機制研究逐漸深入。Hispolon自1996年首次分離以來，至今已報道了其對多種不同類型癌癥細胞顯示出較強的抑制活性。并且Hispolon類似物能顯著抑制結腸癌細胞的增殖[7]，具有潛在的抗結腸癌作用，但其分子機制尚不清楚。

網絡藥理學使研究者從“藥物-單一靶點-單一途徑”治療疾病的傳統模式向“藥物-多靶點-多途徑-疾病”的方式轉變，挖掘出更多潛在靶點，形成新型藥物研發模式。因此，本文采用網絡藥理學來探討Hispolon治療結腸癌的潛在作用機制。首先本研究利用SwissTargetPrediction網站、Genecard數據庫、OMIM數據庫獲得Hispolon治療結腸癌的潛在作用靶點69個，Cytoscape 3.7.2軟件對作用靶點的PPI網絡圖可視化分析，發現重要靶點包括BCL-2L1、EP300、CDK1、AR、MTOR、EGFR等；其次使用Cytoscape 3.7.2軟件的Cytohubba和MCODE插件挖掘Hispolon作用于結腸癌的PPI網絡的核心靶點，共篩選出5個核心靶點，包括BCL-2L1、EP300、CDK1、MTOR、EGFR，與PPI網絡可視化分析結果一致。其中，BCL-2L1屬于Bcl-2蛋白家族，是一個重要的抗凋亡分子，通過與電壓依賴性陰離子通道結合，阻止caspase激活劑CYC1從線粒體膜中釋放，來阻止細胞凋亡，在細胞凋亡過程中起著重要作用[10]。EP300作為組蛋白乙酰轉移酶，在細胞增殖、轉化和分化中具有重要作用，細胞中缺乏EP300會增加結腸癌細胞的活動性和侵襲性，誘導上皮間質轉化[11]。CDK1是細胞周期G2/M檢查點的關鍵調節劑，被認為是癌癥治療的潛在靶標，El-Huneidi等[12]研究發現紫穗菊通過下調CDK1等使得細胞周期在G2/M期停滯，誘導乳腺癌和結腸癌細胞凋亡。mTOR是調節細胞生長、代謝和免疫的蛋白激酶(一種絲氨酸/蘇氨酸激酶)，過度激活后，mTOR信號傳導促進細胞增殖和代謝，從而促進腫瘤的發生和發展[13]。EGFR在許多癌癥尤其是乳腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌中過表達或突變，研究表明抑制結腸癌細胞中的EGFR信號傳導可調節細胞因子的分泌并防止M1至M2巨噬細胞極化，從而抑制癌細胞的生長[14]。以上結果表明，BCL-2L1、EP300、CDK1、MTOR、EGFR可能是Hispolon治療結腸癌的潛在作用靶點。

通過GO功能富集分析，發現Hispolon治療結腸癌主要涉及對受傷的反應、細胞對有機氮化合物的反應、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路等生物學過程，包括蛋白激酶活性、磷酸轉移酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子功能；KEGG通路提示Hispolon抗結腸癌可能通過調節癌癥相關通路、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌相關通路、癌癥中MicroRNAs相關通路等發揮作用，并且通路中關鍵靶點涉及BCL-2L1、EP300、CDK1、MTOR和EGFR核心靶點。GO和KEGG分析的結果與我們的預測相符，即核心靶點主要參與抗癌生物過程和信號通路。其中，核心靶點BCL-2L1和mTOR在篩選的前20條信號通路中富集程度較高。Bcl-2家族蛋白在凋亡調控中起著關鍵作用，Bax是Bcl-2家族的關鍵成員，其激活能夠促進細胞色素c的釋放和線粒體裂變，從而導致凋亡小體的形成和caspase-3的激活，進而促進細胞凋亡。據報道，BCL-2L1能夠穩定Bax的線粒體定位，同時使其保持失活狀態[15]，因此，抑制BCL-2L1的表達可能是促進凋亡的一個潛在途徑。Zhang等[16]研究發現結腸癌患者Lin28/let-7c軸發生失調，let-7c通過抑制BCL-2L1的表達來誘導結腸癌細胞凋亡。mTOR信號的激活是促進腫瘤生長的關鍵，在細胞存活、細胞骨架重排、抗凋亡以及侵襲轉移等方面起著基礎性的作用[17]。文獻報道深綠卷柏提取物通過PI3K-Akt-mTOR信號通路下調了結腸癌細胞HT29和HCT16中mTOR的表達水平，誘導結腸癌細胞凋亡[18]。因此，BCL-2L1和mTOR是參與凋亡過程中重要的治療靶點，選擇這兩個靶點的調控作用進行實驗驗證。

為了驗證網絡藥理學預測結果，最后進行了體外細胞實驗。實驗結果顯示Hispolon有效抑制SW480細胞增殖，呈劑量依賴性；Western blot驗證Hispolon可下調SW480細胞中靶點蛋白BCL-2L1和mTOR的表達，發揮促凋亡作用。這進一步驗證了網絡藥理學預測Hispolon抗結腸癌靶點的可行性和準確性。

綜上所述，通過網絡藥理學預測了Hispolon抗結腸癌的潛在分子機制，具有多靶點、多通路的特點，同時選取部分關鍵靶點進行了實驗驗證。研究結果表明，網絡藥理學是一種可靠的方法，可用于預測化合物是否具有發展為藥物的潛力。但是，預測的靶點和關鍵通路還需進一步實驗驗證。