祖師麻治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

武 旭，賀素容，王 晶,2，祁春艷，趙重博,2

(1. 陜西中醫(yī)藥大學，2. 陜西省中藥飲片工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712046)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性、侵蝕性、進行性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎及血管翳為病理特征，臨床表現(xiàn)為以小關(guān)節(jié)受累為主的對稱性多關(guān)節(jié)炎，常以發(fā)作期、緩解期交替出現(xiàn)為臨床特點，病情反復難以遏制，致殘率高，嚴重影響生活質(zhì)量，其發(fā)病原因及發(fā)病機制至今尚不能完全明確[1]。現(xiàn)臨床常用的慢作用抗風濕藥(slow-acting antirheu matic drugs，SAARDs)、非甾體類抗炎藥(non-steroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs)、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等均能有效控制RA病情，緩解疼痛，但同時會導致胃腸道反應、肝腎功能損害及骨髓抑制等[2]。自古醫(yī)案記載及現(xiàn)代研究表明，中醫(yī)外治法作為重要的輔助手段，在緩解RA關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、晨僵方面療效顯著，經(jīng)皮給藥劑型可避免因胃腸道吸收而導致的不良反應，具有起效快、作用直接、增強療效等優(yōu)勢[3]。

祖師麻(CortexDaphnes)，這一名稱最早記載于《陜西中藥志》，為瑞香科(Thymelaeaceae)植物黃瑞香(DaphnegiraldiiNitsche)、唐古特瑞香(DaphnetanguticaMaxim)及凹葉瑞香(DaphneretusaHemsl)的干燥莖皮及根皮，同科屬的結(jié)香也作祖師麻入藥，性溫，味辛苦，有小毒，具有祛風除濕，散瘀止痛之功效。《中國藥典》(1977年版)收載“祖師麻來源為瑞香科植物黃瑞香、陜甘瑞香、凹葉瑞香的干燥莖皮及根皮，其性溫、味辛苦，具有祛風濕，活血止痛之功效。”《湖北中草藥》記載，金腰帶這一草藥來源為唐古特瑞香和尖瓣瑞香，并且記錄了唐古特瑞香又稱祖師麻、夜夢花。有舒筋通絡(luò)，活血止痛的功效。用于胃痛、風濕疼痛、腰疼、跌打損傷、骨折等癥[4]。

雖然祖師麻治療RA的療效比較明確，但其具體的分子機制仍需進一步研究，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，對祖師麻治療RA的通路進行預測，并應用分子對接技術(shù)驗證預測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 祖師麻活性成分獲取通過TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫，篩選條件OB(口服生物利用度)≥30%,且DL(類藥性)≥0.18和TCMIP(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm.)等數(shù)據(jù)庫篩選、結(jié)合PubMed進行相關(guān)文獻檢索，確定其活性成分。

1.2 祖師麻化學成分靶點的獲取將文獻中整理補充的活性成分在Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，獲得成分的SMILES結(jié)構(gòu)式，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)，篩選成分對應的靶基因并與數(shù)據(jù)庫中篩選的靶點基因整理去重后作為祖師麻有效成分的靶點，供后續(xù)分析。

1.3 風濕關(guān)節(jié)痛疾病靶點預測在GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中，用“rheumatoid arthritis”作為關(guān)鍵詞，檢索與RA相關(guān)的疾病靶點，將數(shù)據(jù)整合即得。

1.4 藥物-疾病基因交集將祖師麻活性成分的靶點與RA的靶點取交集，并繪制venny圖，可以清晰的得到藥物與疾病靶點的交集靶點。交集顯示出的靶點則為祖師麻活性成分作用于RA的靶點。

1.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)是一個可以檢索已知蛋白之間和預測靶點蛋白質(zhì)之間互相作用的系統(tǒng)。將1.4項下得到的交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，以Homo sapiens為分析條件，得到活性成分治療RA相關(guān)靶點的互作關(guān)系。

1.6 GO富集和KEGG通路分析對篩選好的交集靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析和KEGG通路分析。通過GO富集分析可以粗略了解差異基因富集在哪些生物學功能、途徑或者細胞定位[5]。得到生物過程、細胞組分、分子功能、KEGG通路富集分析并繪制氣泡圖，其中，節(jié)點的大小和顏色表示富集到的靶點數(shù)量。

1.7 祖師麻活性成分-RA-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建把“1.4”項下中獲取的交集靶點，在Excel中分別建立活性成分-靶點、疾病-靶點之間的對應關(guān)系[6]。以及通過KEGG通路富集得到的主要通路-靶點，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件中，制作出祖師麻成分-疾病-靶點-通路的信息網(wǎng)絡(luò)[7]，在網(wǎng)絡(luò)中風濕關(guān)節(jié)炎、祖師麻有效成分、蛋白靶點和通路由節(jié)點表示。節(jié)點之間的相互關(guān)系用邊表示。

1.8 活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接驗證分子對接是通過匹配原則，計算并預測配體與受體的相互作用模式，常用于病毒表位蛋白設(shè)計及現(xiàn)代疫苗和藥物開發(fā)中[8]。將篩選出的祖師麻活性成分采用Chem Draw19.0畫出化合物的結(jié)構(gòu)，然后用Chem 3D 19.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并使用MM2力場進行優(yōu)化，輸出mol2結(jié)構(gòu)，通過Atoudocktool-1.5.6軟件轉(zhuǎn)變?yōu)?pdbqt格式。在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)，下載具有蛋白質(zhì)-配體復合物的晶體，通過Atoudocktool-1.5.6及其附帶的激動劑化合物確定作用位點的三維坐標。在Atoudocking vina 1.1.2軟件中進行分子對接[9]。選取結(jié)合自由能最小的構(gòu)象用Discovery Studio 2016 Client進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 祖師麻活性成分的獲取通過篩選整理，祖師麻活性成分22個。分別為7-8-二羥基香豆素(7-8-dihydroxycoumarin)、2,4,6-三羥基苯甲酸乙酯(2,4,6-trihydroxybenzoic acid ethyl ester)、4-甲基-7-羥基香豆素(4-methyl-7-hydroxycoumarin)、7-8-二甲氧基香豆素(7-8-dimethoxycoumarin)、7-羥基-8甲氧基香豆素(7-hydroxy-8-methoxycoumarin)、7-羥基香豆素(7-hydroxycoumarin)、β-谷甾醇(β - sitosterol)、白樺酸(betulinic acid)、刺五加苷E(eleutheroside E)、大黃素甲醚(Physcion)、丁香樹脂酚(syringaresinol)、對羥基苯甲酸(P-hydroxybe)、胡蘿卜苷(carotene)、木犀草素(luteolin)、齊墩果酸(oleanolic acid)、芹菜素(apigenin)、瑞香苷(daphnin)、山奈酚(kaempferol)、雙白瑞香素(daphnoretin)、櫻花苷(sakuranin)、芫花素(genkwanin)、芫花烯(genkwadaphnin)等。

2.2 祖師麻活性成分靶點的獲取將篩選出的活性成分導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中，獲取各活性成分的靶點基因427個。

2.3 疾病靶點的預測結(jié)果在GeneCards數(shù)據(jù)庫中將疾病的靶點進行整理，最終獲取4 329個與RA有關(guān)的疾病相關(guān)靶點。

2.4 藥物-疾病交集結(jié)果將427個活性成分靶點與4 329個疾病靶點取交集，結(jié)果顯示，交集靶基因共有273個。并制作韋恩圖，發(fā)現(xiàn)祖師麻對RA的靶點基因映射率為6.1%，提示祖師麻對治療RA有一定的特異性治療，見Fig 1。

Fig 1 Wayne diagram of active components of Zushima and targets of rheumatoid arthritis

2.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建結(jié)果將交集基因?qū)隨tring(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)拓撲參數(shù)分析展示Degree值較高的前十位核心靶點，見Tab 1。AKT1(RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶) 是3種AKT之一，包括新陳代謝、細胞存活和血管生成。MAPK3(絲裂原活化蛋白激酶3), MAPK/ERK級聯(lián)通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞骨架重排等多種生物學功能，調(diào)節(jié)細胞生長、黏附和分化等生物學功能。TNF(腫瘤壞死因子)主要由巨噬細胞分泌，可誘導某些腫瘤細胞死亡。VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)在血管生成和內(nèi)皮細胞生長中起著重要的作用。STAT3(信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3)通過調(diào)節(jié)初生CD4(T細胞表面糖蛋白)的分化來調(diào)節(jié)炎癥反應。

Tab 1 Core targets in PPI network construction

Tab 2 Results of GO

2.6 GO富集與KEGG通路分析將交集基因?qū)隓AVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)數(shù)據(jù)庫中進行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析共得到1 376個富集結(jié)果，如Fig 2-4所示。其中包含生物過程(biological process，BP) 1 128項，細胞組分(cellular component，CC) 89項，分子功能(molecular function，MF) 159項。根據(jù)count值由大到小排序，在BP、CC、MF中挑選出排名前10的條目。其中，生物過程主要涉及細胞表面受體連接信號轉(zhuǎn)導、細胞內(nèi)信號級聯(lián)、磷酸鹽代謝過程等。細胞組分主要涉及質(zhì)膜部分、與質(zhì)膜整合、質(zhì)膜固有等。分子功能主要涉及核苷酸結(jié)合、核苷結(jié)合、嘌呤核苷結(jié)合等。

Fig 2 Bubble diagram of cell components (TOP10)

Fig 3 Molecular function bubble diagram (TOP10)

Fig 4 Bubble diagram of biological process (TOP10)

在KEGG通路分析結(jié)果中涉及58條信號通路，去除比較廣泛的通路，挑選出排名前10的信號通路為主要生物學通路。結(jié)果如Fig 5，節(jié)點的顏色由紅色至綠色表明P值由大到小，因此綠色節(jié)點越大該條信號通路的重要性越高。主要涉及細胞的焦點黏附(focal adhesion)通路，在細胞-細胞外基質(zhì)接觸點，形成了特殊的結(jié)構(gòu)，稱為焦點黏連。黏著斑復合物(FAC)與多種炎癥性疾病的發(fā)病機制有關(guān)，包括IBD、RA和多發(fā)性硬化癥[10]。細胞基質(zhì)黏附在細胞運動、細胞增殖、細胞分化、基因表達調(diào)控和細胞存活等重要生物學過程中起著重要作用；趨化因子信號通路，炎癥性免疫反應要求在外來侵襲時將白細胞聚集到炎癥部位，而趨化因子是一種小的趨化肽，為細胞的轉(zhuǎn)運提供方向線索，因此對保護性宿主反應至關(guān)重要；MAPK信號通路，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)參與細胞的增殖、分化和遷移等多種功能，見Tab 3。

Fig 5 Bubble chart of KEGG pathway analysis (TOP10)

Tab 3 KEGG pathway analysis table (TOP10)

2.7 祖師麻活性成分-RA-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果通過Cytoscape3.7.2構(gòu)建祖師麻活性成-RA-靶點-通路的作用網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖分析可知網(wǎng)絡(luò)圖中包含節(jié)點(node)308個，節(jié)點與節(jié)點之間的作用關(guān)系用邊(edge)表示，共有633條邊。其中焦點黏附、趨化因子信號通路、MAPK信號通路 (、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、鈣信號通路等均涉及AKT1、MAPK3、MAP2K1、BRAF、MAPK8、MAPK10、JUN、EGFR等眾多基因，與祖師麻中活性成分的作用靶點高度對應，體現(xiàn)了祖師麻在治療RA的過程中多成分，多靶點的作用機制。

2.8 分子對接驗證結(jié)果將篩選后祖師麻的22個活性成分作為配體分子與風濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的靶蛋白TNF、AKT1、MAPK3、VEGFA、STAT3、EGFR、SRC、CASP3、JUN、MAPK8等核心靶點作為受體蛋白進行分子對接，用配體分子與受體蛋白的對接結(jié)合能的值繪制熱圖，見Fig 6。其中，結(jié)合能<-5.0(kJ·mol-1)，則表明結(jié)合性能良好，<-7(kJ·mol-1)，則表明結(jié)合性能較好[11]。結(jié)合能越小，對接結(jié)果越好。熱圖結(jié)果顯示祖師麻中22個活性成分能均能與核心靶蛋白有較好的結(jié)合，其中雙白瑞香素、瑞香苷、大黃素甲醚等成分顯示出相對較好的對接結(jié)果。

利用Discovery Studio 2016 Client對結(jié)合性最好的雙白瑞香素與MAPK3、SRC等10個可信靶蛋白結(jié)果進行分析，由Fig 7靶點蛋白與成分的2D結(jié)構(gòu)可知，雙白瑞香素均與MAPK3、AKT1、EGFR等靶蛋白中的PHEA氨基酸的殘基有相互作用，其與MAPK3中的PHEA：346、348氨基酸殘基，AKT1中的PHEA：55，EGFR中的PHEA：795氨基酸殘基之間存在范德華力，還與EGFR中的PHEA：997氨基酸殘基形成pi-堆積作用。與MAPK3、SRC、TNF、STAT3、EGFR等靶蛋白中的THRA氨基酸的殘基有相互作用，其與MAPK3中的THRA：347，SRC中的THRA：508，EGFR中的THRA：847氨基酸殘基間形成范德華力；TNF中的THRA：77，STAT3中的THRA：440氨基酸殘基間形成氫鍵。與MAPK3、SRC、MAPK8等靶蛋白中GLNA氨基酸的殘基有相互作用，其與MAPK8中的GLNA：37，SRC中的GLNA：497氨基酸殘基間形成范德華力，與MAPK3中的GLNA：90氨基酸殘基間形成氫鍵。與SRC、VEGFA等靶蛋白中GLUA、ALAA氨基酸的殘基有相互作用,其與SRC中的GLUA：510，ALAA：514氨基酸殘基間形成pi-陽離子鍵和pi-聚酰胺烷基鍵，與VEGFA中的GLUA：67，ALAA：61、104氨基酸殘基間形成范德華力，GLUA：64氨基酸殘基間形成pi-陰離子鍵。與SRC、TNF、AKT1、EGFR等靶蛋白中的PROA氨基酸的殘基有相互作用，其與，SRC中的PROA：507，TNF中的PROA：90，EGFR中的PROA：741，AKT1中的PROA：388氨基酸殘基間形成范德華力，還與AKT1中的PROA：51間形成碳氫鍵，EGFR中的PROA：794氨基酸殘基間形成pi-σ鍵。AKT1中的ARGA:328間形成pi-陽聚酰胺烷基鍵, MAPK3中的ARGA:74間形成pi-陽離子鍵等。

Fig 6 Thermal map of molecular docking results

Fig 7 Molecular docking results

3 討論

經(jīng)過文獻挖掘，發(fā)現(xiàn)7-8-二羥基香豆素、瑞香苷、雙白瑞香素、刺五加苷E、山奈酚、β-谷甾醇等22種具有潛在抗RA的成分，其涉及到治療的機制包括細胞表面受體連接信號轉(zhuǎn)導、細胞內(nèi)信號級聯(lián)、磷酸鹽代謝過程、質(zhì)膜部分、核苷酸結(jié)合、蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)過程、細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等。

根據(jù)KEGG通路分析得知祖師麻可能通過焦點黏著通路發(fā)揮抗RA作用，通路中的一部分信號分子參與了膜受體與肌動蛋白細胞骨架之間的結(jié)構(gòu)聯(lián)系，另一部分信號分子參與觸發(fā)信號傳導。肌動蛋白纖維束通過連接斑蛋白的多分子復合物靶向定位在整合素家族的跨膜受體上，整合素信號又依賴于FAK(黏著斑激酶)和SRC(原癌基因酪氨酸蛋白激酶)的非受體酪氨酸激酶的活化和FAK、SRC和SHC(轉(zhuǎn)化蛋白)的適配功能，從而啟動下游信號事件。這些信號事件最終導致肌動蛋白細胞骨架的重組，這是改變細胞形狀和運動能力以及基因表達的先決條件，類似的形態(tài)改變和基因表達的調(diào)控是由生長因子與其各自受體的結(jié)合引起的[12]。由此可知，細胞中的黏著復合物和生長因子介導的信號分子與祖師麻抗RA有密切的關(guān)聯(lián)。

此外，在RA發(fā)病過程中，成纖維細胞樣滑膜細胞(FLS)通過侵襲關(guān)節(jié)細胞外基質(zhì)發(fā)揮重要作用。 FAK信號通路是RA- FLS異常行為的重要因素[13]。RA-FLS表現(xiàn)為被動的促炎反應和自我導向的攻擊性反應，如促炎介質(zhì)的產(chǎn)生、細胞凋亡的減少和滑膜增厚的形成。有證據(jù)表明，Janus激酶(JAK)-信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號在被動反應中的作用，但RA-FLS的攻擊行為尚不清楚[14]。TNF基因也非常重要，TNF-α因子可以誘導負責多種生物鐘基因的表達，造成類風濕患者癥狀出現(xiàn)晝夜反復的情況[15]故以此條通路為切入點進一步尋找祖師麻治療風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制。表皮生長因子受體(EGFR)信號轉(zhuǎn)導在RA發(fā)病機制中起重要作用[16]。血管生成在RA的發(fā)展中起著重要作用，它增加了對滑膜的營養(yǎng)物質(zhì)、細胞因子和炎癥細胞的供應。在RA患者的血清中，VEGF和IL-6水平與滑膜炎嚴重程度成正比，血管生成細胞因子PlGF和VEGF代表了US評估RA滑膜炎癥的嚴重程度。在接受B-DMARD治療的患者中，血清VEGF可能比CRP更能反映治療反應[17]。

采用“1.8”項下的方法獲取核心靶蛋白的原配體，并進行分子對接。結(jié)果為TNF(-6.2 kJ·mol-1)、AKT1(-6.3 kJ·mol-1)、MAPK3(-6.2 kJ·mol-1)、STAT3(-6.2 kJ·mol-1)、EGFR(-6.3 kJ·mol-1)、SRC(-6.3 kJ·mol-1)、CASP3(-6.3 kJ·mol-1)、JUN(-6.2 kJ·mol-1)、MAPK3(-6.2 kJ·mol-1)。與本實驗得到的結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物與靶蛋白都有良好的結(jié)合能，其中雙白瑞香素、瑞香苷、大黃素甲醚、刺五加苷E等活性成分與靶蛋白的結(jié)合能都低于原配體，顯示出較好的對接結(jié)果。

本實驗分子對接驗證結(jié)果與文獻報道相符[18]。通過相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建可直觀的顯示出祖師麻治療類風濕關(guān)節(jié)痛的多成分、多靶點、多途徑等共同作用的特點。通過分子對接的方法對網(wǎng)絡(luò)藥理學靶點預測的可靠性進行驗證，為后續(xù)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。但所得出的結(jié)果只是理論上的預測，祖師麻的體內(nèi)作用機制仍需要進一步的動物實驗驗證。