雞大腸桿菌與葡萄球菌的防治研究

林松泉，莊若飛，鄒文政

（1.廈門惠盈動物科技有限公司，福建 廈門 361023；2.集美大學水產學院，福建 廈門 361021）

禽流感、新城疫等疾病的發生，不同程度影響著我國養雞業的正常發展[1]。某養雞場雞群突發疾病，其主要癥狀為：嘴巴常張開，體溫升高，精神沉郁，食欲降低或停食，拉灰白色稀便，且傳染快、發病急、病程短、死亡率高。分別從頭、肺、肝、脾臟等4種器官通過分離純化病菌，得到兩株病原菌，經鑒定分別為大腸桿菌（Escherichia coLi）與雞葡萄球菌（StaphyLococcus gaLLinarum）。

關于雞大腸桿菌與葡萄球菌感染防治的報道很多[2-9]，但涉及的葡萄球菌主要是金黃色葡萄球菌(Staphy Lococcus aureus)，而雞葡萄球菌（Staphy Lococcus gaLLinarum）的感染未見相關報道。如ELsaid[10]從多個農場雞體內分離出700多株致病菌，其中葡萄球菌占45.5%。此外，關于雞疾病的治療基本以抗生素藥物為主導，然而，對于經常使用大量抗生素治療病菌引起的疾病，往往會產生多種負面影響，如導致病原菌耐藥性提高、免疫機能下降、藥物殘留與破壞生態環境等[11]。人們食用含抗生素的畜禽產品則會對人體健康產生危害[12-13]，而隨著農業部提倡限抗減抗的要求與益生菌產品的開發研究，多數益生菌產品可以有效抑制病原菌，起到防治病原菌的作用。因此，其越來越受到人們的廣泛關注。

本研究從市場獲得10個含抗生素產品，涉及硫氰酸紅霉素、酒石酸泰樂菌素、替米考星、阿莫西林、氟苯尼考、鹽酸多西環素及延胡索酸泰妙菌素7種常用抗生素，分別對分離的兩株菌進行藥敏試驗，能有效抑制這兩種菌的抗生素產品僅為鹽酸多西環素。通過使用實驗室益生菌對這兩株病原菌進行抑菌篩選試驗，其中植物乳桿菌（LactobaciLLus pLantarum）、干酪乳桿菌（LactobaciLLus casei）、鼠李糖乳桿菌(LactobaciLLus rhamnosus)與酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）對這兩株菌均有抑制作用，這為雞病的防治提供了新的方向，也為益生菌產品的開發奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

病樣由某雞養殖場提供，共5組平行樣，每組平行樣中分別包括頭、肺、肝及脾臟（見圖1）。

圖1 病雞組織器官

供試藥物。市場上得到的10個含抗生素產品，酒石酸泰樂菌素(A公司)（規格：5000萬單位）、酒石酸泰樂菌素(B公司)（規格：2000萬單位）、替米考星（規格：10%）、硫氰酸紅霉素可溶性粉(A公司)（規格：500萬單位）、硫氰酸紅霉素可溶性粉(B公司)（規格：500萬單位）、硫氰酸紅霉素（C公司）（規格500萬單位）、延胡索酸泰妙菌素（規格：45%）、阿莫西林（規格：10%）、氟苯尼考（規格：10%）、鹽酸多西環素（規格：10%），共涉及7種抗生素。

供試益生菌。解淀粉芽孢桿菌（BaciLLus amyLoLiquefaciens）（BNCC 185324）、納豆芽孢桿菌（BaciLLus natto）（BNCC 336388） 購買于北納創聯生物技術有限公司；枯草芽孢桿菌（BaciLLus subtiLis）、地衣芽孢桿菌（BacLicusLincheniformis）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas paLustris）、啤酒酵母菌（S.cerevisiae）、植物乳桿菌（L.pLantarum）、干酪乳桿菌（L.casei）與鼠李糖乳桿菌(LactobaciLLus rhamnosus)均為本實驗室分離保存。

1.2 病原菌分離與鑒定

從5組平行樣病樣中隨機選取3組在超凈工作臺上操作，用灼熱的刀片燙死表面雜菌，再通過無菌操作將病雞的組織采用平板劃線法分離病原菌，頭、肺、肝及脾臟各1個平板，共使用12個平板，倒置于37℃培養箱中隔夜培養，長出單菌落后再劃線純化培養。將純化后的菌株采用16S rRNA細菌通用引物[14]進行擴增，正向引物為27F：5'-GAGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'，由北京睿博興科生物技術有限公司完成。所得序列經NCBI（美國生物技術信息中心）數據庫的BLAST進行在線同源性比對。

1.3 藥物敏感性試驗

采用試管二倍稀釋法進行操作。以藥物標注的使用濃度為參考，設為第一濃度梯度（最低濃度），往后按二倍梯度提高濃度，設置6個稀釋度梯度。即往第1支無菌的小試管（15×100）中加入1 mL營養肉湯培養基，再加入1 mL產品母液，混勻，從第1支試管吸取1 mL混合物到第2支含1 mL營養肉湯培養基試管，以此類推，直到第6支試管，并從第6支試管吸取1 mL液體棄去。然后分別向試管中加入0.1 mL菌液（108CFU·mL-1），于 37 ℃培養箱中培養 24 h（對照組為1 mL營養肉湯培養基加0.1 mL菌液），觀察是否長菌。

1.4 益生菌抑菌試驗

采用管碟法[15-16]并稍加改進。取1 mL病原菌懸液加入50℃ 100 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基中搖勻（菌終濃為 105CFU·mL-1），倒入培養皿中（厚度約為3 mm），待冷卻凝固后將牛津杯置于平板中，向牛津杯中加入0.25 mL益生菌菌液 （濃度為108CFU·mL-1），置于37℃下培養24 h。觀察有無抑菌圈產生，并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

1.5 益生菌免疫保護試驗

將60只45日齡健康雞分成6組，每組10只，分別為對照組1、對照組2，大腸桿菌感染組1、大腸桿菌感染組2和雞葡萄球菌感染組1、雞葡萄球菌感染組2，其中組別2為益生菌保護組。感染組皮下注射分離菌 1 mL（濃度為 108CFU·mL-1）、對照組 1、對照組 2注射1 mL 0.85%生理鹽水；益生菌保護組飲水中加入酵母菌和乳酸菌等益生菌，連續觀察10 d。

2 結果

2.1 病原菌的分離

在3組平行樣的頭、肺、肝、脾臟中，只有肺平板均分離出細菌。通過菌落形態觀察，有2種不同形態的菌，一種為淺白色、半透明的菌落，一種為淡黃色、不透明的菌落（見圖2）；通過革蘭氏染色，鏡檢結果表明，淺白色的為桿菌、陰性菌（見圖3），淡黃色的為球菌、陽性菌（見圖4）。分別標注為1號菌、2號菌。

圖2 病雞肺分離菌平板

圖3 肺部分離1號菌(革蘭氏陰性桿菌)

圖4 肺部分離2號菌(革蘭氏陽性球菌)

2.2 菌種測序鑒定

將純化好的這兩株病原菌進行菌種測序鑒定，菌株基因系列如下：

1號菌株通過測序得到16S rRNA片段長度為1417 bp，具體測序系列結果為：

2號菌株通過測序得到16S rRNA片段長度為1434 bp，具體測序系列結果為：

兩個菌株基因系列通過NCBI采用BLAST軟件進行菌株同源性比對，1號菌與Escherichia coLi AH01的核苷酸序列同源性為 99.93%，2號菌與StaphyLococcus gaLLinarum LMG19119的核苷酸序列同源性為100%。

2.3 藥物敏感性試驗結果

不同濃度的10種市場藥物產品（7種藥物）對大腸桿菌和雞葡萄球菌兩株分離菌的抑菌結果分別見表1和表2。

表1 10種市場藥物產品對大腸桿菌的抑菌性

表2 10種市場藥物產品對雞葡萄球菌的抑菌性

從表1和表2可以看出，在藥品試驗濃度范圍內，酒石酸泰樂菌素、替米考星、硫氰酸紅霉素、延胡索酸泰妙菌素和氟苯尼考等5種抗生素對大腸桿菌與雞葡萄球菌無抑菌效果；阿莫西林產品用量為正常標簽用量的8倍及以上才能抑制大腸桿菌的生長，而對雞葡萄球菌則無抑制作用；鹽酸多西環素產品能有效抑制大腸桿菌生長，若對雞葡萄球菌起抑制作用則需正常標簽用量的8倍及以上。

2.4 益生菌的抑菌效果

枯草芽孢桿菌等9種益生菌對大腸桿菌和雞葡萄球菌兩株分離菌的抑菌結果分別見表3和表 4。

表3 9種益生菌對大腸桿菌的抑制效果

從表3和表4可以看出，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌等5種益生菌對大腸桿菌和雞葡萄球菌均無抑制作用；啤酒酵母菌對雞葡萄球菌具有抑制效果，但對大腸桿菌無抑制作用；植物乳桿菌、干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌能夠有效抑制大腸桿菌和雞葡萄球菌，抑菌圈非常明顯。

表4 9種益生菌對雞葡萄球菌的抑制效果

2.5 分離菌株致病性和益生菌免疫保護結果

分離菌的致病性和益生菌的保護試驗結果見表5。

表5 兩株分離菌的致病性和益生菌的保護

從表5可以看出，兩株分離菌對雞均有不同程度的致病性，其中大腸桿菌致病性較弱，在注射感染7 d內死亡率為40%，雞葡萄球菌致病性很強，在注射感染7 d內死亡率為100%。但是，在飲用水中添加益生菌后，注射感染大腸桿菌組未見雞死亡；注射感染雞葡萄球菌組死亡率明顯下降，死亡率為20%。

3 討論

在雞養殖業中由大腸桿菌引發的疾病普遍存在，且危害較為嚴重，嚴重時死亡率高達50%。如何有效防控該病的發生已經成為一種重要關鍵的技術問題[18]。經過對病樣的分離純化、菌種鑒定，初步判斷雞的死亡很有可能是由大腸桿菌與雞葡萄球菌感染導致的。國內外關于雞感染葡萄球菌的文獻[4-6]很多，但主要集中在金黃色葡萄球菌，對雞葡萄球菌的研究未見報道。

經藥敏試驗發現，市場上10個畜禽產品（涵蓋7個抗生素）替米考星、氟苯尼考等5種抗生素在試驗藥物濃度范圍內對大腸桿菌與雞葡萄球菌無抑菌效果；阿莫西林等產品需要較高劑量才有抑制作用，這表明抗生素的長期使用提高了大腸桿菌和葡萄球菌等病原菌的耐藥性[19-21]。鹽酸多西環素等產品能有效抑制大腸桿菌生長，但對雞葡萄球菌起抑制作用則需正常藥劑的8倍及以上。這表明，抗生素對病原菌的抑制作用具有一定的局限性，在用藥過程中需對因用藥，建議先做藥敏試驗，避免濫用抗生素。

益生菌是有利于宿主健康的單細胞微生物或組成明確的混合微生物[22]，能調節腸道菌群平衡，增強機體免疫力等，其中乳酸菌除了能夠調節腸道微生物群平衡，產生抗菌物質，抑制有害細菌的生長，還能定殖于腸道[24-27]。在家禽養殖中，可有效維持動物腸道菌群平衡，抑制有害細菌的產生，減少疾病的發生[28]。通過對實驗室9種益生菌菌株的篩選，得到4株可以抑制病原菌的益生菌，其中啤酒酵母菌對雞葡萄球菌具有抑制效果，但對大腸桿菌無抑制作用；植物乳桿菌、干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌對大腸桿菌和雞葡萄球菌具有明顯的體外抑制效果；益生菌保護試驗也進一步表明，在飲用水中添加酵母菌和乳酸菌能夠有效防止大腸桿菌和雞葡萄球菌的感染。有研究表明[29-30]，酵母菌與病原菌之間主要通過營養與空間的競爭而產生拮抗作用；干酪乳桿菌、植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌則通過產生抗菌肽來達到抑制病原菌[31-35]。根據這4株菌抑菌效果和相關抑菌機制，我們將進一步檢測益生菌對其他致病菌的抑制效果，同時優化菌種復配和發酵培養條件，為益生菌產品的開發奠定良好的基礎。

4 結論

從病雞肺分離得到的兩株病原菌分別為大腸桿菌與雞葡萄球菌，對市場上10個畜禽抗生素產品具有較強的耐藥性。益生菌（植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌與酵母菌）在體外對大腸桿菌與雞葡萄球菌具有良好的抑制作用。因此，在生產實際運用過程中，建議先做藥敏試驗，對癥用藥，同時使用益生菌產品代替抗生素產品，避免抗生素濫用。