山西芝麻種質資源SSR遺傳多樣性及群體結構分析

呂 偉 韓俊梅 任果香 文 飛 王若鵬 劉文萍

(山西農業大學經濟作物研究所，山西 太原 030031)

芝麻(SesamumindicumL. )隸屬胡麻科(Pedaliaceaie)胡麻屬(Sesamum)[1]，是我國六大特色油料作物之一[2-5]。芝麻種子含油量達55%以上，亞油酸含量達40%以上，素有油中“皇后”之美譽，因含有豐富的營養物質，廣泛應用于食品、醫藥、美容等領域[6-8]。此外，芝麻具有耐貧瘠、耐旱、適應性強等特性，在我國種植歷史悠久，多數省份均有種植[9-10]。山西是我國西北地區芝麻主產省，但近年來芝麻種植面積逐年下降，單產低而不穩，嚴重影響山西芝麻產業的發展，其主要原因在于育成品種的親本遺傳基礎狹窄、抗逆性較差。因此，分析和研究芝麻種質資源及其遺傳多樣性對有效利用種質資源，拓寬育種親本的遺傳基礎，培育高產、優質、抗逆芝麻新品種具有重要意義。

種質資源遺傳多樣性的分析方法主要包括表型性狀和分子標記，利用表型性狀開展種質資源遺傳多樣性研究的方法最為普遍[11]，具有簡單、直觀、易觀察記載的特點[12]，但由于表型性狀易受環境因素影響，對種質資源鑒定具有一定的局限性[13]。隨著分子生物學技術的發展，DNA分子標記已廣泛應用于作物的遺傳多樣性研究。簡單重復序列標記 (simple sequence repeat，SSR)具有多態性高、重復性好、呈共顯性、分布廣等優點[14-17]，已成為理想的遺傳標記技術。目前，國內外學者利用SSR分子標記已對玉米[18]、黑麥[19]、大豆[20]、水稻[21-22]、花生[23-24]、豌豆[25]、藜麥[26]、綠豆[27]、小麥[28]等多種作物進行了遺傳多樣性研究。在芝麻上，Kim等[29]利用14對SSR引物對來自韓國和其他國家的75份芝麻資源進行了遺傳多樣性分析；孫建等[30]利用SSR分子標記對我國20份黑芝麻進行遺傳多樣性分析；劉文萍等[9]研究發現山西芝麻種質資源與我國其他主產區種質資源的遺傳關系較遠。但利用SSR分子標記對山西芝麻種質資源遺傳多樣性的研究鮮見報道。因此，本研究以71份山西芝麻種質資源為研究材料，通過SSR分子標記對其進行遺傳多樣性分析及群體結構分析，以期探明山西芝麻種質資源的遺傳變異特性，為山西芝麻育種親本選擇、品種改良和優異基因發掘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試芝麻材料 山西芝麻種質資源共計71份(表1)，由山西農業大學經濟作物研究所提供。

表1 參試芝麻種質資源名稱及編號

1.1.2 SSR標記引物 30對多態性較好的SSR標記引物，由中國農業科學院油料作物研究所提供，引物序列信息見表2。

表2 30對SSR引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取與質量檢測 將參試芝麻材料在室內培養，取其幼嫩葉片，采用CTAB改良法[31]提取基因組DNA，利用NANODROP 2000紫外分光光度核酸測定儀(Thermo，美國)檢測其質量和濃度，將其稀釋至20 ng·μL-1，放置-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 PCR擴增 PCR反應體系(10 μL)： DNA 2.5 μL、10×buffer 1 μL、Taq DNA聚合酶0.16 μL、dNTP 0.2 μL、正反引物各0.16 μL、ddH2O 5.82 μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共32次循環；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物經6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后拍照記錄。

1.3 SSR分子標記統計與數據分析

記錄清晰的SSR擴增條帶，有條帶賦值為“1”，無條帶賦值為“0”，利用Microsoft Office Excel 2010軟件統計整理數據。利用POPGENE 1.31軟件計算每對引物的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Shannon指數(Ⅰ)、Nei′s遺傳多樣性指數(H)。利用LITTLE PROGRAME軟件計算每對引物的多態性信息含量(polymorphism information content，PIC)。利用NTSYS-pc 2.1軟件按照非加權配對算術平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)對參試材料進行聚類分析。利用STRUCTURE 2.3.1軟件對參試材料進行遺傳結構分析，設置分析群體數K值范圍為1～10，將MCMC(markor chain monte carlo)開始時的不作數迭代設為100 000次，再將不作數迭代后的MCMC設為100 000次，迭代次數設置為5。

2 結果與分析

2.1 SSR標記對芝麻種質資源的遺傳多樣性分析

利用多態性較好的30對SSR分子標記對71份山西芝麻種質資源進行遺傳多樣性分析(圖1)，由表3可知，30對SSR標記共檢測到144個等位基因位數(Na)，變幅為2～10個，平均每個SSR標記4.800 個等位基因，等位基因數在5～10之間的有15對，占參試的50.0%，其中ZMM1494引物檢測到的等位基因數最多，為10個，其次為ZMM1832、ZMM1935引物，分別檢測到8個等位基因數。有效等位基因數(Ne)在1.058 ～5.149 之間，平均2.805 個，其中ZMM1832引物引物檢測到的有效等位基因數最多，為5.149 個，其次為ZMM1550，為5.128 個，ZMM1542、ZMM2313引物的有效等位基因數最少，均為1.058 個。

表3 30對SSR分子標記在71份芝麻種質檢測到的遺傳變異參數

圖1 SSR引物ZMM2540和ZMM2313對編號1～12芝麻種質擴增產物的電泳圖

30對SSR引物的Shannon指數(Ⅰ)變幅為0.128 ～1.813，平均為1.096，其中ZMM1832的Shannon指數最高，ZMM1542的Shannon指數最低，Shannon指數在1.5以上的有ZMM1550(1.698)、ZMM2133(1.590)、ZMM1935(1.648)、ZMM4097(1.563)、ZMM1832(1.813)、ZMM1851(1.646)、ZMM2350(1.545)。Nei′s遺傳多樣性指數(H)變幅為0.055 ～0.806，平均為0.558，其中ZMM1832的Nei′s遺傳多樣性指數最高，ZMM1550次之，ZMM1542和ZMM2313的Nei′s遺傳多樣性指數最低，Nei′s遺傳多樣性指數在0.7以上的有ZMM1522(0.704)、ZMM1550(0.805)、ZMM1632(0.735)、ZMM2345(0.742)、ZMM2133(0.767)、ZMM2276(0.733)、ZMM1935(0.748)、ZMM4097(0.764)、ZMM1832(0.806)、ZMM1851(0.770)、ZMM2350(0.734)。PIC變幅為0.053 ～0.783，平均為0.515，其中ZMM1832的PIC最高，ZMM1542和ZMM2313的PIC最低，PIC在0.7以上的有ZMM1550(0.776)、ZMM2133(0.734)、ZMM1935(0.714)、ZMM4097(0.729)、ZMM1832(0.783)、ZMM1851(0.738)。

2.2 SSR標記對芝麻種質資源的聚類分析

采用NTSYS-pc 2.1軟件按照UPGMA法對參試材料進行聚類分析，并制作聚類樹狀圖。由圖2可知，71份山西芝麻種質資源的遺傳相似系數范圍為0.21～0.67，在遺傳相似系數0.27處將參試材料分為六大類，第Ⅰ類包括2份芝麻種質，分別為太谷芝麻1號、運城芝麻3號；第Ⅱ類包括4份芝麻種質，分別為見喜芝麻1號-1、四棱芝麻-1、雜F11-6、絳縣澮南-1；第Ⅲ類包括4份芝麻種質，分別為吳堡楊家溝芝麻、晉芝十號、吉縣芝麻、絳縣大交-1；第Ⅳ類包括51份芝麻種質，以遺傳相似系數0.3為閾值，將第Ⅳ類分為Ⅳ-A、Ⅳ-B、Ⅳ-C三亞群，其中Ⅳ-A由5份芝麻種質組成(太谷芝麻2號-1、臨縣芝麻5號-1、柳林芝麻3號、吳堡郭家墕-1、早熟-3)，Ⅳ-B由33份芝麻種質組成，基本為汾陽芝麻種質，Ⅳ-C由13份芝麻種質組成(臨縣芝麻2號、臨縣芝麻3號、臨縣芝麻4號、2012-43-02、柳林芝麻1號-1、吳堡丁家灣芝麻、定襄芝麻1號-1、吳堡大棗灣芝麻、吳堡高尚墕芝麻、吳堡劉家里-1、柳林石西-1、吳堡赤木峪芝麻、不抗-9)；第Ⅴ類包括9份芝麻種質，分別為吳堡任家莊-1、2012雜F3-4、82030、2012-48-01、2012-47-01、吉縣南耀芝麻、g14、吉縣底貼芝麻、選4-1；第Ⅵ類包括1份芝麻種質，為柳林芝麻2號-1。在所有的參試材料中，63號(g46)、65號(2000g65)、71號(g15)這3份芝麻種質間的遺傳相似性系數以及67號(g60)、70號(g67)這2份芝麻種質間的遺傳相似性系數最高，均為0.67；1號(太谷芝麻1號)、27號(吉縣芝麻)、10號(柳林芝麻2號-1)、28號(絳縣大交-1)、3號(運城芝麻3號)這5份芝麻種質的遺傳相似系數的平均值較低，分別為0.195、0.200、0.207、0.211、0.218。

圖2 基于SSR標記山西芝麻種質聚類樹狀圖

同時采用NTSYS-pc軟件對71份芝麻種質進行二元主成分分析，構建主成分分析二維圖(圖3)。根據參試材料在圖中的位置分布，將71份材料分成4部分，a區域主要為類群Ⅳ-B的部分材料，b區域主要為類群Ⅳ-A、Ⅵ材料及類群Ⅳ-B的部分材料，c區域主要為類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ材料，d區域主要為類群Ⅳ-C材料。主成分分析從不同的角度更直觀地對71份山西芝麻種質資源進行了親緣關系分析，山西芝麻種質資源在主成分分析二維圖分布較為均勻，表明其遺傳多樣性較為豐富。

圖3 71份芝麻種質資源二元主成分分析

根據DNA擴增結果，對山西11個不同地理來源芝麻亞群進行分析，獲得11個亞群的遺傳一致度和遺傳距離結果。由表4可知，從遺傳距離來看，11個亞群間的遺傳距離介于0.050 ～0.325 之間，平均為0.164。從遺傳一致度來看，11個亞群間的遺傳一致度范圍為0.722 ～0.951，平均為0.850，其中柳林芝麻亞群與吳堡芝麻亞群之間遺傳距離最小，為0.050，遺傳一致度最高，為0.951，說明它們之間的遺傳交流頻率相對較高；文水芝麻亞群與運城芝麻亞群遺傳距離最大，為0.325，遺傳一致度最低，為0.722，說明它們之間的遺傳交流頻率相對較低，親緣關系較遠。對山西11個不同地理來源芝麻亞群進行聚類分析，由圖4可知，柳林、吳堡、臨縣、汾陽等山西西部地區芝麻種質間遺傳距離較近，吉縣、絳縣、定襄、文水、聞喜、運城等山西中部地區、山西南部地區芝麻種質與山西西部地區芝麻種質的遺傳距離較遠。

表4 山西11個芝麻亞群的遺傳距離(左下角)和遺傳一致度(右上角)

圖4 山西11個芝麻亞群的UPGMA聚類分析

2.3 SSR標記對芝麻種質資源的群體結構分析

基于SSR分子標記檢測結果，將分析得到的LnP(D)平均值繪制折線圖(圖5)，結果表明，在K=5時LnP(D)似然值最大。因此，將71份參試材料劃分為5個組群(圖6)。

圖5 對數似然函數值LnP(D)的變化曲線

圖6 基于SSR標記的山西芝麻種質遺傳結構圖

當某一材料在某個組群中的Q值≥0.6時，認為該材料遺傳結構相對單一，某一材料在某個組群中的Q值<0.6時，則認為該材料擁有混合來源[32-33]，因此，為了能夠充分體現山西芝麻材料間的遺傳結構成分，分析其在不同組群的Q值分布，將Q值大于或等于0.6的46份山西芝麻種質材料(占參試材料的64.8%)劃歸到相應的5個組群中，其余25份來源于汾陽、吳堡、柳林、臨縣、絳縣、定襄、文水的芝麻種質材料(占參試材料的35.2%)遺傳結構具有復雜的混合來源，無法明確其歸屬的組群，因此將其劃歸為混合組群中(表5)。由表5可知，組群1(圖6紅色組群)的芝麻材料有7份，占參試材料的9.9%，均為來源于汾陽，分布于二元主成分分析的a區域；組群2(圖6綠色組群)的芝麻材料有7份，占參試材料的9.9%，來源于汾陽、吉縣、吳堡，分布于二元主成分分析的b、c區域；組群3(圖6藍色組群)的芝麻材料有8份，占參試材料的11.3%，來源于吳堡、臨縣、柳林，分布于二元主成分分析的d區域；組群4(圖6黃色組群)的芝麻材料有13份，占參試材料的18.3%，均為來源于汾陽，分布于二元主成分分析的b區域；組群5(圖6粉色組群)的芝麻材料有11份，占參試材料的15.5%，來源于汾陽、太谷、吉縣、絳縣、聞喜、運城、柳林、臨縣，分布于二元主成分分析的b、c區域。該群體結構的組群劃分不僅體現了參試芝麻種質間的親緣關系，且與二元主成分分析結果大致吻合。

表5 71份芝麻種質在5個不同組群的Q值

由表6可知，從遺傳距離來看，6個組群間的遺傳距離介于0.033 ～0.168 之間，平均為0. 091；從遺傳一致度來看，6個組群間的遺傳一致度范圍為0.846 ～0.968，平均為0.913。由圖7可知，組群1與組群3之間遺傳距離最大，為0.168，而遺傳一致度最低，為0.846；組群4與組群M遺傳距離最小，為0.033，而遺傳一致度最高，為0.968。

表6 6個芝麻組群的遺傳距離(左下角)和遺傳一致度(右上角)

圖7 6個芝麻組群的UPGMA聚類分析

3 討論

芝麻品種的遺傳改良主要取決于對芝麻種質資源的掌握與利用，只有掌握芝麻種質材料的遺傳變異信息，才能更有針對性選擇親本材料，從而有助于培育出雜種優勢較大的后代。DNA分子標記技術是分析植物遺傳多樣性和遺傳基礎的主要方法，大量研究表明，SSR標記以其穩定性高、易于操作、信息含量豐富等優點，成為研究芝麻種質間遺傳差異、種屬間親緣關系最重要、發展最迅速的分子標記[30]。孫建等[30]利用23對SSR分子標記對我國20個芝麻品種進行遺傳多樣性分析，每對標記檢測出3～6個等位基因位點，平均每對標記4.00個等位基因；張艷欣等[34]用20對SSR引物對216份芝麻核心種質進行檢測，每對引物檢測出2～8個等位基因位點，平均等位基因為3.95個；岳文娣等[35]利用42對SSR引物對國內外545份芝麻品種進行遺傳多樣性分析，引物的等位基因位點范圍為3～9個, 平均每對引物等位基因為3.8個，PIC平均值為0.409 2；魏利斌等[36]用27對SSR多態引物對國內外36個芝麻材料進行遺傳多樣性分析，檢測到的等位基因位點為2～7個，平均3.37個，PIC平均值為0.390。而本試驗利用30對SSR標記對71份山西芝麻種質進行遺傳多樣性分析，每對標記檢測出2～10個等位基因位點，平均每個SSR標記4.800 個等位基因，PIC平均值為0.515，均高于前人研究結果，說明本研究采用的SSR標記具有更高的多態性，參試的芝麻種質資源具有較高的遺傳多樣性。此外，PIC是核心引物篩選的重要指標，本研究中引物ZMM1494的等位基因數最多，為10個，PIC為0.626，ZMM1935、ZMM4097、ZMM2133、ZMM1851、ZMM1550、ZMM1832的等位基因數變幅為6～8個，少于ZMM1494，但其PIC較高，變幅在0.714 ～0.783 之間。這些具有較高多態性的SSR標記，不僅在分析芝麻種質親緣關系方面發揮重要作用，也為芝麻遺傳變異檢測等其他分子生物學研究提供重要標記資源。

本研究利用NTSYS-pc軟件對71份山西芝麻種質資源進行UPGMA法聚類分析和二元主成分分析，同時利用Structure軟件對其進行遺傳結構分析，這3種聚類分析方法對參試芝麻種質的聚類結果大致吻合，但略有差異，主要是由其聚類原理和方法決定的。UPGMA法聚類是假設各類群的進化速率相同，按照順序依次將距離最小的兩個材料聚在一起，直到所有的材料都聚到一個完整的系統發生樹中[37]。而二元主成分分析則是利用降維的統計方法，把多個指標轉化為幾個綜合指標，降低觀測的空間維數來獲取最主要的信息，通過直觀圖像距離獲取材料間相關性的分析方法[38]。UPGMA法聚類分析和二元主成分分析基于參試材料的遺傳相似系數和遺傳距離對其進行群體劃分，但這種群體聚類結果時常由于人為地將平面區域位置較近者劃歸為一類，使類群間相互滲透的材料不易劃分，而群體結構分析基于哈代-溫伯格平衡和貝葉斯模型算法，避免了人為因素對群體劃分造成的偏差[32]。因此，本研究采用距離聚類與模型聚類相結合的方法分析種質資源，對充分掌握群體間和種質間的親緣關系具有重要意義。

遺傳相似系數可判斷作物種質資源親緣關系，在親緣關系研究中，遺傳相似系數越低則親緣關系越遠，說明材料之間遺傳差異越大[37]。岳文娣等[35]利用SSR引物分析中國芝麻種質資源的遺傳相似系數在0.546 2～0.981 1之間，其中東北、西北等區域的資源與黃淮、華中、華南等區域的資源親緣關系較遠；劉文萍等[9]分析98份芝麻種質資源的遺傳相似系數在0.280 ～0.996 之間，其中山西芝麻種質與我國芝麻主產區芝麻種質遺傳關系較遠，其遺傳相似系數集中在0.300 ～0.500 之間。本研究中，71份山西芝麻種質資源的遺傳相似系數為0.21～0.67，說明山西芝麻種質資源遺傳差異相對較高，遺傳基礎較廣，具有豐富的遺傳多樣性，其中太谷芝麻1號、吉縣芝麻、柳林芝麻2號-1、絳縣大交-1、運城芝麻3號的遺傳相似系數的平均值較低，表明這5份芝麻種質在整個群體的遺傳距離相對較遠，這為今后芝麻雜交育種及遺傳改良提供了材料基礎。

本研究對不同區域芝麻種質亞群進行聚類分析，從聚類結果發現柳林、吳堡、臨縣、汾陽等山西西部地區芝麻種質間遺傳距離較近，這可能是因為其芝麻種質之間交流頻繁或地理環境相近，從而導致其遺傳基礎較一致，而吉縣、絳縣、定襄、文水、聞喜、運城等山西中部地區、山西南部地區芝麻種質與山西西部地區芝麻種質的遺傳距離較遠。同時對遺傳結構分析得到的6個組群進行了聚類分析，發現組群1、組群3與組群4間的遺傳距離接近6個組群間的平均遺傳距離(0.091)，說明汾陽、吳堡、臨縣、柳林等山西西部地區芝麻種質間遺傳距離較近，而組群1、組群3與組群5間的遺傳距離較大，說明山西西部地區芝麻種質與山西中部、南部地區芝麻種質的遺傳距離較遠，這與不同區域芝麻種質亞群聚類分析結果相一致。因此，有必要加大對山西中部、南部地區芝麻種質資源的收集、發掘與利用，為今后芝麻改良育種提供理論和材料基礎。

4 結論

本研究利用30對SSR標記對山西芝麻種質資源進行遺傳多樣性分析，結果表明，每個SSR標記平均4.800 個等位基因，多態性信息含量平均為0.515，同時發掘出ZMM1935、ZMM4097、ZMM2133、ZMM1851、ZMM1550、ZMM1832等多態性較高的SSR標記，該研究結果為今后芝麻品種遺傳改良和功能分子標記開發提供了理論基礎。基于SSR標記對參試材料進行UPGMA聚類分析，發現參試材料的遺傳相似系數范圍為0.21～0.67，在遺傳相似系數0.27處將參試材料分為6個類群，同時對不同區域芝麻種質亞群進行聚類分析，發現山西西部地區芝麻種質與中部、南部地區芝麻種質的遺傳距離較遠。本研究不僅闡明了山西芝麻種質遺傳多樣性，還為今后山西芝麻種質資源的收集、發掘及利用提供了一定的理論和材料基礎。