恒溫微流控系統檢測及鑒定結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌的應用價值

王泉 馬瑞瑛 楊婷 張亞麗 許苗 撒玉玲 陳清波

結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)與非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)臨床上引起的疾病難以區別，在無菌種鑒定情況下NTM病經常被誤診為結核病，而兩者治療方案明顯不同[1-2]。因此，快速準確地鑒定MTBC與NTM對結核病的早期診斷、早期治療，以及對疾病防控均具有重要意義。傳統的區分MTBC與NTM方法主要依靠培養法結合對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)生長試驗，但培養法耗時較長。恒溫微流控芯片檢測系統集等溫擴增與產物檢測一體化，具有操作簡單、耗時短等優勢；且其多樣本和多重檢測等功能可極大簡化操作流程，降低了對實驗人員要求，適于基層地區開展[3-4]。筆者利用恒溫微流控芯片技術檢測痰液標本中MTBC與NTM，并與分枝桿菌傳統培養法和PNB/TCH生長試驗進行對比，以評價其應用價值。

材料和方法

一、菌株來源

采用前瞻性研究方法，收集新疆醫科大學第八附屬醫院2018年9月至2019年12月間經抗酸染色鏡檢陽性的痰液標本，共624份。

二、儀器和試劑

1.儀器：恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀、MTB-NTM微流控芯片由廣州迪澳生物科技有限公司提供，設備可進行4塊芯片反應，每塊芯片可同時進行4份樣本的MTB與NTM區分鑒定。

2.試劑：萋-尼染色液、酸性改良羅氏培養基(珠海貝索生物技術有限公司)；DNA提取液(廣州迪澳生物科技有限公司)。

三、實驗方法

1.羅氏固體培養和PNB/TCH生長試驗菌種鑒定：將收集合格的3 ml痰液標本中加入2倍體積4%的氫氧化鈉溶液后渦旋振蕩混勻，靜置15 min。以無菌吸管吸取處理后的痰標本(約1 ml)均勻接種至酸性改良羅氏培養基斜面上，每支培養基接種2滴(0.1～0.15 ml)。將接種后的培養基連同斜面培養架置于恒溫培養箱內，(36±1) ℃孵育。24 h后再擰緊培養管螺旋蓋放置于直立的培養架上，(36±1) ℃繼續孵育。將PNB用二甲基甲酰胺溶解稀釋后加入未凝固的改良羅氏培養基中，最終濃度控制在0.5 mg/ml；TCH用滅菌蒸餾水溶解，培養基中最終濃度為5 μg/ml。PNB/TCH生長試驗按照《結核病實驗室檢驗規程》進行。

2.核酸模板提取：另取1 ml液化后痰標本加入離心管，10 000×g離心5 min，棄上清液，加入100 μl的DNA提取液，100 ℃加熱10 min冷卻至室溫，10 000×g離心2 min，將上清液轉移至新的離心管中備用。

3. 恒溫微流控系統檢測：分別針對分枝桿菌復合群(16S rRNA)及MTBC(IS6110)特異性核酸片段設計恒溫引物，并采用引物預包埋技術將其固定至微流控芯片。將提取上清液及恒溫反應液5 μl(按照每個反應腔室0.2 μl上清液及2.3 μl恒溫反應液混合)均分至各反應腔，芯片置于核酸恒溫分析儀中，63 ℃反應45 min。采用實時熒光曲線對結果進行判讀，當呈現“S”型擴增曲線時該反應腔室核酸檢測結果為陽性，無“S”型擴增曲線則結果為陰性。若16S rRNA和IS6110檢測結果均為陽性，則鑒定結果為MTB；若16S rRNA檢測結果為陽性，IS6110檢測結果為陰性，則鑒定為NTM；若16S rRNA和IS6110檢測結果均為陰性，則鑒定結果為非分枝桿菌。

4. 二代測序技術：對于微流控檢測系統和PNB及TCH實驗檢測結果不一致的標本，將樣本核酸交給深圳華大基因公司進行DNA序列測定，使用華大基因研制的專利產品試劑盒中的引物作為測序上下游引物，測序儀器型號為BGISEQ-500。

四、統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計數資料以“百分率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。以羅氏固體培養和PNB/TCH生長試驗菌種鑒定結果為參照，評價恒溫微流控系統檢測分枝桿菌和鑒定菌種的效能，各指標計算公式如下：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；一致率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%。各方法間的一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75，說明一致性較好；0.4≤Kappa值<0.75，說明一致性一般；Kappa值<0.4，說明一致性較差。

結 果

一、分枝桿菌檢測結果

624份痰標本中，經羅氏固體培養法檢測陽性612份(98.1%)，其中，515份(82.5%，515/624)經PNB/TCH生長試驗菌種鑒定為MTB，97份(15.5%，97/624)鑒定為NTM。恒溫微流控系統檢測陽性607份(97.3%)，其中，513份(82.2%，513/624)鑒定為MTB，94份(15.1%)鑒定為NTM。恒溫微流控系統和傳統培養法分枝桿菌陽性檢出率比較，差異無統計學意義(χ2=0.021，P=0.950)。

二、檢測效能分析

以羅氏固體培養法檢測結果作為參照標準，恒溫微流控系統檢測抗酸染色鏡檢陽性的痰液標本中分枝桿菌的敏感度和特異度分別為99.2%(607/612)和100.0%(12/12)，Kappa值為0.82，見表1。

表1 恒溫微流控系統以痰培養結果為參照標準檢測痰液標本分枝桿菌的效能

以PNB/TCH生長試驗結果作為參照標準，恒溫微流控系統檢測痰液標本中MTBC的敏感度和特異度分別為99.6%和100.0%，Kappa值為0.99，見表2。恒溫微流控系統檢測痰液標本中NTM的敏感度和特異度分別為96.9%和100.0%，Kappa值為0.98，見表3。

表2 恒溫微流控系統以PNB/TCH生長試驗鑒定結果為參照標準檢測MTBC的效能

表3 恒溫微流控系統以PNB/TCH生長試驗鑒定結果為參照標準檢測NTM的效能

三、方法間差異性分析

5份分枝桿菌培養陽性而恒溫微流控系統檢測為陰性的標本，經PNB/TCH生長試驗鑒定，2份為MTBC，3份為NTM。經測序，2份MTBC標本得到確證；3份NTM標本中1份為偶發分枝桿菌，2份為諾卡菌。

討 論

傳統的MTBC與NTM的區分采用培養法結合PNB/TCH生長試驗，耗時較長(約2～6周)[5]。恒溫微流控系統可實現對4份標本多指標同時檢測，從進樣到結果判讀僅需1 h，同傳統方法相比有效縮短了檢測和鑒定時間。另外，反應在恒溫條件下即可進行，對設備的要求相對較低；蝶式微流控芯片使用普通聚乙烯材料制作，采用離心進樣方式可有效降低檢測成本，進一步降低了患者的醫療負擔，適合于現場和基層單位應用。

本研究利用基于核酸等溫擴增技術開發的微流控芯片與設備對624份抗酸染色鏡檢陽性的痰液標本進行檢測，同時采用羅氏固體培養法和PNB/TCH生長試驗菌種鑒定進行對比，探討該技術檢測分枝桿菌和鑒定MTBC與NTM的應用價值。研究發現，培養法分枝桿菌陽性檢出率為98.1%，恒溫微流控系統陽性檢出率為97.3%，差異無統計學意義。以改良羅氏固體培養法結果為參照，恒溫微流控系統檢測分枝桿菌具有較高的敏感度(99.2%)和特異度(100.0%)，能直接區分分枝桿菌與其他呼吸道致病菌感染；Kappa值為0.82，表明該方法與培養法檢測結果一致性較好，具有較高的檢測效能，適用于臨床標本分枝桿菌感染初篩。王桂榮等[6]利用多重PCR技術檢測MTB和NTM臨床分離株的敏感度分別為99.36%和98.00%；特異度分別為99.32%和98.00%。可見，該方法具有較高的檢測敏感度和特異度，但其結果判讀采用瓊脂糖凝膠電泳，導致其臨床應用價值較低。張潔等[7]研究顯示，與傳統培養法和菌種鑒定方法相比，實時熒光PCR檢測MTBC的敏感度為99.0%，檢測NTM的敏感度為75.4%，總符合率為99.0%。本研究顯示，以PNB/TCH生長試驗菌種鑒定結果為參照，恒溫微流控系統鑒定MTBC與NTM的敏感度分別為99.6%和96.9%，Kappa值分別為0.99與0.98，說明以核酸擴增為基礎的恒溫微流控系統適用于痰液標本中MTBC與NTM的鑒定。

此外，本研究中有5份分枝桿菌培養陽性而恒溫微流控系統檢測為陰性的標本，測序結果顯示2份為MTB，1份為偶發分枝桿菌。恒溫微流控系統檢測為陰性的原因是當痰標本中分枝桿菌分布較為集中時，分配給待考評檢測體系的標本可能不含菌或含菌量低于或接近待反應體系的最低檢出限，導致其結果為陰性。2份標本經PNB/TCH生長試驗鑒定為NTM，而測序結果為諾卡菌，可能是培養過程中污染所致。王建等[5]對2175株分枝桿菌進行PNB/TCH生長試驗，初步鑒定的93株NTM有14株為假陽性，與本研究的現象類似。這說明以培養法為參照標準在鑒定NTM時存在一定不足，以核酸檢測為基礎的篩查結果相對可靠。

綜上所述，本研究結果證實，恒溫微流控系統在以抗酸染色鏡檢陽性為診斷基礎時，鑒定痰液標本中MTBC與NTM具有較好的性能。這為該方法的普及提供了有力的證據。當然，本研究也存在一定的不足：(1)無法對菌株耐藥情況進行檢測；(2)NTM 因菌種差異而導致臨床用藥也不相同，本檢測系統無法對NTM臨床分離株進行菌種鑒定。