三七總皂苷對雄激素性脫發小鼠的改善作用及機制研究

胡 俊 張敬芳 候圣祥 姚依韜 馮振國 李小溪 潘夢佳 魏 強 陳天禹

長沙醫學院臨床學院，湖南長沙，410219

雄激素性脫發(androgenetic alopecia，AGA)又稱為脂溢性脫發，通常在20～35歲的男性中發病率較高。據統計，全世界范圍內25歲前發病的男性患者在整個男性人群中的占比為60%，而30歲前發病的男性患者在整個男性人群中的占比為83.9%[1]，而60歲女性禿頭的發病率達50%[2]。近年來，患有AGA的人數越來越多，而且發病人群的年齡越來越小，對患者的日常生活和思想情緒等方面產生了較為嚴重的影響[3]。目前認為遺傳、雄激素途徑、細胞因子等是其主要的誘因，但發病機制尚不清楚[4]。與頭皮其他部位的健康毛囊產生的較為結實的終毛相比，受AGA影響的毛囊會通過更小的基質轉運放大細胞隔室而發生微型化改變，從而產生更細、色素更少的毳毛，并且逐漸發展成為永久性的，不可逆的毛囊丟失[5]。

三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是從三七草藥加工提取得到的一種化學成分，包含了多種不同單體，例如：Rg1、Re和三七皂苷R1等[6]，具有改善心肌缺血[7]、消腫止痛、抗氧化應激、促進機體血液供應[8]、抗抑郁、抗焦慮等多種功效[9]。藥理研究表明，在PNS的作用下VEGF及其特異性受體的表達得到上調，并能有效促進血管產生[10]。有學者發現，VEGF的表達通常在人毛囊真皮乳頭細胞和真皮鞘細胞中發生，能夠促進毛發的生長和變粗，而對于患有AGA的患者而言，局部頭皮內VEGF的水平明顯低于正常，甚至消失[11]。提示PNS可能通過促進VEGF表達從而對AGA起到一定的改善作用。真皮乳頭細胞分泌的TGF-β1，對毛發循環的退行期扮演著重要角色，可引起毛囊基質細胞凋亡，繼而引發毛囊微型化和脫發的發生，源自AGA病變部位毛乳頭細胞的雄激素誘導型TGF-β1是AGA中雄激素誘導的毛發生長抑制的原因[12]，當TGF-β1表達水平較高時，毛發生長將會受到影響，進而引發脫發，這是雄激素性脫發出現的一個非常重要的因素[13]。到目前為止暫未發現三七總皂苷對雄激素性脫發改善作用的研究。本課題組通過建立AGA小鼠模型，觀察三七總皂苷改善C57BL/6小鼠雄激素性脫發模型效果，探究其對AGA小鼠模型脫發區毛囊、終毛、毳毛的數目、終毛/毳毛的比值、組織中VEGF、TGF-β1表達以及血清激素、VEGF含量的影響，對其作用機制進行研究。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 試驗選取40只雄性小鼠為研究對象，這些小鼠的體重數值控制在25～27 g的范圍內、而生長周期基本都在10周齡左右。將小鼠放到長沙醫學院動物實驗中心進行為期2周的適應性喂養，環境溫度為24℃，濕度數值為53%，人工飼料飼喂，不限食水。

1.2 主要藥品與試劑 丙酸睪酮注射液：杭州動物藥品廠，規格：25 mg/mL，批號：190711。非那雄胺：杭州默沙東制藥公司，批號：J01305A。三七總皂苷：湖南湘雅制藥公司，批號：1905117。睪酮ELISA試劑盒：湖南歐賽德生物科技公司，批號：011A20。VEGF(批號：2155151180220)、TGF-β1(批號：229151231220)試劑盒：武漢博士德生物公司。

1.3 主要儀器 高清顯微鏡:日本奧林巴斯公司，恒溫箱：上海精宏公司，PW-812洗板機：深圳市匯松公司，SH01D離心機：上海知信實驗儀器公司，XH-C漩渦混合器：江蘇大唐公司，移液槍、Multiskan FC酶標儀：Thermo公司。

1.4 小鼠雄激素性脫發模型建立及分組給藥 將試驗小鼠均等分成4組，分別是空白組、模型組、陽性組和三七皂苷組。空白組之外的3組小鼠，將5 mg/(kg·d)丙酸睪酮稀釋溶液平行于脊柱背部皮下注射，空白組實施同等劑量的注射油。同時實施對應的用藥，陽性藥物組給予非那雄胺片0.65 mg/(kg·d)，三七總皂苷組的用藥標準為100 mg/(kg·d)，空白組和模型組選擇等體積的蒸餾水，試驗持續60天。

1.5 觀察指標及測定

1.5.1 小鼠一般狀態及背部毛發生長情況觀察 觀察每個時間段各組小鼠的一般狀態包括體重、活動度等，拍照記錄小鼠肉眼觀毛發脫落情況。

1.5.2 毛囊組織病理學觀察 實驗第60天取小鼠脫毛區域皮膚組織約2 cm×2 cm，用硬質塑料板固定，防止卷曲收縮，4%多聚甲醛固定，進行切片制作。在100倍高清顯微鏡進行圖像數據采集，包含毛囊、終毛和毳毛的生長數量。毳毛毛干短，稀薄，細小，通常沒有發髓且沒有立毛肌，延伸的深度不超過上層真皮，產生的軸不超過其內根鞘。與毳毛相比終毛毛干更粗，更長，色素深[14]。每個切片選取三個沒有重疊的視野，取其平均值進行統計分析。

1.5.3 小鼠血清VEGF、睪酮含量的測定 持續用藥60天后，從試驗小鼠的眼球部位采血，將采集到的血液放到高速離心機中按照轉動速度3000 r/min進行10 min的離心操作，將血液中的血清完全分離出來，之后使用試劑盒完成血清中睪酮和VEGF的濃度數據檢測。

1.5.4 皮膚組織VEGF、TGF-β含量測定 給藥60天后，選取小鼠脫毛部位的皮膚，將剩余的毛發處理干凈，將其制成濃度為10%的組織勻漿，使用試劑盒完成其中VEGF、TGF-β1的濃度檢測。

1.6 統計學方法 Excel錄入數據，使用Graphpad 9.0處理分析，用單因素方差分析檢驗顯著性，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠一般狀態及脫發情況的觀察結果 實驗過程中所有的小鼠正常攝入食物和水分，除空白組外，其余各組體重在正常范圍內稍有下降。在小鼠背部皮下注射丙酸睪酮后，出現明顯的廝打現象。實驗第25天左右毛發失去原有的光澤，35天左右毛發逐漸脫落。用藥60天后，繼續觀察小鼠背部脫毛區，未見表皮的局限性淺表缺損、水腫等異常表現(圖1)。模型組小鼠背部毛發脫落減少，毛發稀疏，背部脫發區域廣呈灰白色；空白組毛發有光澤、覆蓋完全；陽性組脫發區域毛發覆蓋較完全，基本呈黑色接近于空白組；三七總皂苷組較模型組脫發區縮小域呈灰黑色，可見大量新生毛發，其作用趨勢開始逐步接近陽性組。

2.2 三七總皂苷對小鼠背部毛囊數量及終毛/毳毛比值的影響 病理切片、毛囊計數結果表明，空白組毛囊分布均勻，可見大量毛干粗毛干色素深的終毛；模型組毛囊少分布稀疏，且多為毛干細毛干色素淺的毳毛；陽性組毛囊數目多接近正常組；三七總皂苷組毛囊較模型組毛囊數目增多，且多為毛干粗毛干色素深的終毛。相比空白組的小鼠，模型組皮膚總毛囊、終毛數量都有了很大程度的降低(P<0.01)，終毛/毳毛占比數值大幅度減小(P<0.01)，這表明試驗的模型是成立的。相比模型組而言，陽性組小鼠皮膚毛囊數目、終毛毛囊數目以及終毛/毳毛比值顯著增加(P<0.01)；三七總皂苷組小鼠皮膚毛囊數目、終毛毛囊數目明顯增加(P<0.01)，終毛/毳毛比值也有所增加(P<0.05)，說明這兩種藥物能增加小鼠毛囊的數量，來達到改善小鼠雄激素性脫發的效果。三七總皂苷組毛囊數目較陽性組有一定差距，但是有逐漸接近的趨勢(圖2、3)。

2.3 三七總皂苷對小鼠血清睪酮，VEGF含量的影響 相比空白組而言，模型組睪酮在血清中的濃度數值顯著提升(P<0.01)，血清VEGF含量明顯下降(P<0.01)，提示造模成功。相比模型組而言，陽性組血清睪酮的濃度數值明顯減小(P<0.01)，血清VEGF的濃度數值并沒有出現較大幅度的增大(P>0.05)。三七總皂苷組小鼠血清睪酮含量較模型組無明顯變化(P>0.05)，高于陽性組。三七總皂苷組血清VEGF含量較模型組、陽性組明顯升高(P<0.01)，與空白組無統計學差異(圖4)。

1a：空白組小鼠毛發密集有光澤；1b：模型組小鼠毛發脫落，融合成片；1c：陽性組毛發覆蓋較完全；1d：三七總皂苷組較模型組小鼠毛發密集可見大量新生絨毛

2a：空白組毛囊數目多分布密集；2b：模型組毛囊數目明顯減少稀疏；2c、2d：陽性組、三七總皂苷組較模型組毛囊數目顯著增多且分布更加廣泛，可見較多的毛干色深直徑大的生長期毛囊(HE，×100)

圖3 3a～3d:三七總皂苷對小鼠總毛囊數目、終毛毛囊數目、毳毛毛囊數目、終毛/毳毛毛囊數目的影響*P<0.05,***P<0.001

圖4 4a、4b:三七總皂苷對小鼠血清睪酮、VEGF表達影響*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 圖5 5a、5b:三七總皂苷對小鼠皮膚組織中VEGF、TGF-β1表達影響*P<0.05,***P<0.001

2.4 三七總皂苷對小鼠皮膚組織中VEGF、TGF-β含量的影響 相比空白組而言，模型組皮膚組織含有的VEGF濃度數值明顯減少(P<0.01)，TGF-β1濃度數值明顯增大(P<0.01)；相比模型組而言，三七總皂苷組和陽性組對應的VEGF濃度數值明顯增大(P<0.01)，其中三七總皂苷組皮膚組織中VEGF表達量上升的幅度較陽性組更加顯著(P<0.01)。與模型組相比三七總皂苷組和陽性組皮膚組織中TGF-β1的表達量下降(P<0.01，P<0.05)，三七總皂苷與陽性組基本接近(圖5)。

3 討論

AGA也稱為男性型脫發，是一種常見的慢性皮膚疾病。通過5a-還原酶II型將睪酮轉化為二氫睪酮，以及在遺傳易感性毛囊的真皮乳頭內存在雄激素受體來介導[15]。最新研究顯示因嚴重新冠肺炎感染而住院的男性，與相同人群的預期相比，雄激素性脫發的發生率非常高[16]，可能與雄激素受體信號傳導可導致跨膜絲氨酸蛋白酶2的表達與關[17]，但其發病機制尚不明確。

AGA與各種生長因子的調節，以及局部血液循環等有關。在毛發周期的生長期毛囊周圍血管形成顯著增加，毛囊外圍的血管量增多與其外根鞘角質形成細胞VEGF表達水平增強有著較為密切的關聯。VEGF在毛囊外根鞘角質形成細胞內的表達水平過高，能夠提升毛發的生長速度以及毛囊和毛干的相關數值[18]。“發為血之余”，解決脫發的有效手段通常有兩種，一種是保證毛囊獲取更多的養分，另一種就是使其微循環環境更加理想，真皮乳頭細胞釋放出的VEGF能夠促進機體形成更多的毛細血管，保證血管量增多[19]，對毛囊起到營養作用[20]。而當微循環灌注的紊亂導致血液循環中血液灌注速度和流量的降低，從而影響到頭皮毛囊的正常氧氣供應，導致脫發[21]。經過睪酮轉化而來的二氫睪酮誘導毛乳頭細胞TGF-β1抑制毛囊上皮細胞生長[22]。當TGF-β1的表達下調時可通過維持毛囊的退行期和毛囊細胞的活力來防止脫發[23]。

目前國內治療男性雄激素性脫發的主要藥物有非那雄胺口服和米諾地爾溶液外用，有些患者因為其產生的不良反應拒絕治療[24]。而部分中藥治療脫發類疾病有確切療效，三七總皂苷能夠有效促進血流供應，有較強改善微循環的作用[8]，且口服不良反應發生率極低，主要集中在過敏反應、消化道反應，一般癥狀較輕，停藥后多數癥狀消失[25]，價格實惠等優點。因此該研究選擇中藥單體三七總皂苷作為研究對象，通過實驗研究進一步了解其臨床療效和作用機制。

本實驗選取C57BL/6小鼠為實驗對象，采用背部皮下注射丙酸睪酮溶液建立AGA鼠類模型，基本和AGA的病理現象是一致的。觀察記錄小鼠在用藥后毛發的生長狀況、各種狀態下的毛囊計數、血清中睪酮VEGF含量及皮膚組織中VEGF、TGF-β1表達量。

在實驗過程中，將C57BL/6小鼠背部皮下多點注射6周丙酸睪酮后，有明顯的毛發脫落現象，模型組小鼠體內激素水平失衡、肉眼可見的毛發減少以及皮膚病理切片顯示的毛囊數目明顯減少，說明AGA小鼠模型建立成功。模型組小鼠皮膚中TGF-β1表達量明顯升高，這與胡嘉元等[26]在實驗中的結果有所不同，分析原因可能與實驗小鼠品種等因素有關。除空白組外各組均出現了不同程度的好斗、易激惹，這可能與造模時背部皮下注射丙酸睪酮引起小鼠體內雄激素增高有關。研究結果顯示在用藥60 d后，三七總皂苷組小鼠與模型組相比，外觀上毛發更有光澤，脫發面積有所減小，脫發區域的皮膚顏色加深，組織病理學切片顯示皮膚毛囊數目、終毛毛囊數量顯著增多(P<0.01)，終毛/毳毛的占比數值也相對增大(P<0.05)，說明三七總皂苷可以改善AGA模型小鼠的微型化。三七總皂苷組相比模型組和陽性組，血清含有的VEGF濃度數值明顯增大(P<0.01)，而且皮膚組織含有的VEGF濃度數值增大(P<0.01)，可能與給予三七總皂苷后對小鼠局部組織微循環改善以及全身血液循環的促進有關。而TGF-β1含量降低(P<0.05)，所以三七皂苷對小鼠脫發起到一定的預防和改善作用。除陽性組外，其他使用藥物的小鼠血清含有的睪酮濃度數值和模型組的數值較為接近，在統計學上的差異較小，說明三七總皂苷對AGA小鼠血清睪酮濃度無明顯影響，而使用非那雄胺藥物的小鼠血清含有的睪酮濃度數值明顯要比模型組更低(P<0.01)，這和其作用機理是相同的。雖然從本實驗結果上看三七總皂苷的療效與陽性藥物組有一定差距，但是三七總皂苷組小鼠血清中VEGF含量和小鼠皮膚組織中VEGF的表達量明顯高于陽性組，因此說明三七總皂苷較非那雄胺有較強的微循環改善作用，從而對AGA起到一定的改善，加上三七總皂苷能有效降低皮膚組織中TGF-β1的表達對AGA小鼠脫發其有一定的預防作用，而且其不良反應少，發生率低，因此說明三七總皂苷可作為一種預防和改善AGA發生的藥物。我們期待三七總皂苷能否與非那雄胺等一線用藥聯合用藥來進一步提高AGA治療效果，則需要進一步設計實驗研究。

綜上所述，我們發現三七總皂苷對C57BL/6雄激素性脫發模型小鼠脫發有一定預防和改善作用，且在實驗過程中未發現明顯的毒副作用。其作用機制可能與上調小鼠皮膚組織和血液中VEGF的表達，下調小鼠皮膚組織中TGF-β1表達相關。