白藜蘆醇對核桃細菌性黑斑病菌的抑制作用

李峰 陳雯雯 鄧江麗 毛清黎 權文利 毛雅慧

（1. 湖北工程學院 特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室/生命科學技術學院，孝感 432000；2. 武漢生物工程學院食品科技學院， 武漢 430415）

植物能產生多種具有抗菌活性的次生代謝產物，植物源殺菌劑正是利用植物體內的這些抗菌活性物質或通過誘導植物產生防衛素，從而起到殺死或有效抑制某些病原微生物生長的作用。由于植物源抑菌劑具有來源廣泛，靶標性強，作用廣譜，無毒易降解等優點，成為開發新型農藥的首選［1］。中藥虎杖具有利濕退黃，清熱解毒，散瘀止痛，止咳化痰功效，主用于治療跌打損傷，肺熱咳嗽［2-3］，白藜蘆醇為其主要活性成分之一。

白藜蘆醇化學名稱為3，5，4’-三羥基-1，2-二苯乙烯（化學式為C14H12O3），是一種非黃酮類多酚化合物，也是一種“植物抗毒素”［4］。大量動物實驗均表明，白藜蘆醇有抗氧化［5］、抗炎癥、抗癌［6］、抗糖尿病［7］及心血管保護［8-9］等多種藥理作用［10］，在臨床醫學領域收到廣泛關注。作為一種“植物抗毒素”，科研工作者也逐漸對其抗菌活性產生了興趣，吳翠霞等［11］研究表明白藜蘆醇及其衍生物對6種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發具有一定抑制作用；李永軍等［12］通過體外抗菌實驗，證明了白藜蘆醇對Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus（MSSA）、Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）和Coagulase Negative Staphylococci（CONS）等葡萄球菌具有較強的抗菌效果；另外，白藜蘆醇對綠膿桿菌、福氏痢疾桿菌、肺炎雙球菌和雷極普羅維登斯菌等均有良好的抗菌作用［13］。從收集的相關文獻看，目前白藜蘆醇在農業領域的研究甚少，盡管已證實白藜蘆醇能夠抑制葡萄上的灰霉菌和根霉菌的生長，從而有利于抑制水果儲藏過程中微生物的滋生［14］，但目前暫未明確其對植物病原菌的抑菌譜及相應的抑菌機制，且其能否開發成為新型植物源殺菌劑，仍然需要更多研究佐證。

核桃細菌性黑斑病，是世界性核桃病害，嚴重影響了核桃的產量和品質［15］。目前，國內外防治核桃細菌性黑斑病主要是使用以波爾多液為主的保護性銅制劑［16］，配合用甲基托布津、代森錳鋅、農用鏈霉素、青霉素鉀鹽等藥劑進行綜合防治［17］，化學農藥的使用將導致農藥殘留、食品安全及生態平衡破壞等問題。本文以引起核桃細菌性黑斑病的主要病原物Xanthomonas arboricola pv. juglandis DW3F3（Xaj DW3F3）為供試菌株，測定了白藜蘆醇對該細菌的最低抑菌濃度（MIC）以及最低殺菌濃度（MBC），并在亞抑菌濃度下，通過生物化學方法對病原細菌的群體運動性、胞外酶分泌能力、胞外多糖分泌能力及生物被膜形成能力進行了檢測，旨在為核桃細菌性黑斑病天然殺菌劑的開發提供理論依據，同時也豐富白藜蘆醇的抑菌譜，為其在農林作物病害防治上的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 樹生黃單胞核桃致病變種Xanthomonas arboricola pv. juglandis DW3F3（Xaj DW3F3），為從丹江口核桃園內采集的病變核桃果上分離出的病原物，保藏于湖北工程學院特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室。

1.1.2 培養基 （1）YPG培養基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，pH 7.0；（2）YPGA培養基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，瓊脂15.0，pH 7.0；（2）胞外蛋白酶檢測培養基：YPGA中含1%（W/V）的脫脂奶粉；（3）胞外淀粉酶檢測培養基：YPGA中含0.1%（W/V）的可溶性淀粉；（4）胞外纖維素酶檢測培養基：YPGA中含有0.5%（W/V）的羧甲基纖維素（CMC）；（5）運動性檢測培養基（swarming平板）：YPG中含0.5%瓊脂糖。

1.1.3 主要試劑和儀器 白藜蘆醇（虎杖提取物），純度≥98%，由國家植物功能成分利用工程技術研究中心惠贈；頭孢氨芐（Cef），工作濃度為30 μg/mL，購于上海生工生物工程有限公司；剛果紅、結晶紫購于上海生工生物公司；其他化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）。主要儀器如下：超凈工作臺SW-CJ-2G（蘇州凈化設備有限公司），恒溫培養箱（北京中興偉業儀器有限公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-75KBS（上海申安醫療器械廠），雙光束紫外-可見分光光度計UV-6100S（上海美譜達），恒溫震蕩式搖床ZQTY-50NS （上海知楚）。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇抑菌活性的初步鑒定 利用K-B濾紙片法檢測白藜蘆醇對Xaj DW3F3的抑菌效果。將白藜蘆醇溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，配制成濃度為30 mg/mL的母液備用。準備好Xaj菌懸液，用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于YPG固體平板上，將已滅菌并干燥好的直徑為5 mm圓形濾紙片放置于涂布有菌液的培養基表面，每皿3片，再將配制好的白藜蘆醇母液滴加于濾紙片上，同時以溶劑DMSO作陰性對照，將平板晾干后置于28℃培養箱培養2 d，觀察結果并記錄，實驗設置3個重復。

1.2.2 最低抑菌濃度 （MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的確定 接種Xaj于YPG液體培養基中，28℃震蕩培養至平臺期，再取10 μL菌液接種至新鮮的YPG液體培養基中，并加入不同濃度的白藜蘆醇溶液，使其終濃度分別為：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 μg/mL，DMSO作為陰性對照，28℃震蕩培養2 d后，分別測定600 nm處吸光值，MIC即為白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj生長的最低濃度值；選擇大于MIC濃度的各管菌懸液，分別取20 μL涂布于YPG固體平板上，28℃培養2 d，培養基上無細菌生長的最低濃度為其MBC，每個濃度設置3個重復。

1.2.3 生物膜形成能力檢測 用結晶紫染色法檢測白藜蘆醇對Xaj生物膜形成的影響。接種Xaj于5 mL YPG液體培養基中，28℃震蕩培養至對數期，離心收集菌體，用1 mL YPG培養基重懸菌體，接種至裝有4 mL YPG培養基的玻璃指形管中，并加入終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇，DMSO作為陰性對照，置于28℃培養箱中靜置培養5 d后，倒掉培養液，無菌水洗管壁3次，烘干加入6 mL 1%的結晶紫染色30 min。倒掉染色液，用無菌水沖洗管壁，烘干指形管，觀察管壁上是否有一圈紫色物質，拍照記錄；用1 mL無水乙醇溶解管壁結晶紫，測定630 nm處吸收值并記錄，實驗設置3個重復。

1.2.4 胞外多糖形成能力檢測 利用液體搖瓶發酵法測定Xaj在終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇作用下產生EPS的量。接種Xaj于YPG液體培養基中，28℃震蕩培養至平臺期，再按1%-2%的量轉接至50 mL新鮮YPG液體培養基中，并加入終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇，DMSO作為陰性對照，28℃震蕩培養5 d后，向培養液中注入4倍體積的無水乙醇，邊注入邊攪拌，然后挑出絮狀沉淀物，置于55℃烘箱中烘干，稱重，記錄，并計算培養物形成EPS的量（g/L），實驗設置3個重復。

1.2.5 胞外酶分泌能力的檢測 本研究采用平板檢測法分別檢測了白藜蘆醇對Xaj分泌胞外蛋白酶、胞外淀粉酶及胞外纖維素酶能力的影響。

1.2.5.1 胞外蛋白酶 接種Xaj于YPG液體培養基中，28℃震蕩培養至平臺期，用移液器分別吸取2 μL菌液接種于含1%的脫脂牛奶和終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇的YPG平板上，DMSO作為陰性對照，靜止10 min。28℃培養2 d，通過比較菌落周圍水解透明圈的有無或大小判斷菌株產胞外蛋白酶的活性。

1.2.5.2 胞外淀粉酶 接種Xaj于YPG液體培養基中，28℃震蕩培養至平臺期，用移液器吸取2 μL菌液接種于含0.1%可溶性淀粉和終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇的YPG平板上，DMSO作為陰性對照，靜止10 min。28℃培養2 d后，用1∶100的I∶KI（0.08 mol/L I2，3.2 mol/L KI）溶液染色10 min，然后用70%的酒精洗平板，能產生胞外淀粉酶的菌株，其菌落生長處及周圍可形成無色透明圈，觀察并測量透明圈的大小。

1.2.5.3 胞外纖維素酶 接種Xaj于YPG液體培養基中，28℃震蕩培養至平臺期，用移液器吸取2 μL菌液接種于含有0.5%（W/V）的羧甲基纖維素（CMC）和終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇的YPG平板上，DMSO作為陰性對照，靜置10 min。28℃培養2 d后，在平板上加入約20 mL 0.1%的剛果紅（Congo Red）染色30 min，水洗兩次，再用20 mL 1 mol/L的NaCl脫色兩次，每次約20 min，能產生纖維素酶的菌株，其菌落生長處及周圍形成一透明圈，觀察并測量透明圈的大小。

實驗分別設置3個重復，計算透明圈直徑的平均值。測得的透明圈的直徑大小代表不同胞外酶活性或產量的高低，由此來比較菌株在不同環境下所產胞外酶的差異。

1.2.6 運動性檢測 接種Xaj于YPG液體培養基中，28℃震蕩培養至平臺期，用移液器吸取2 μL菌液點接于含有0.5%瓊脂糖和和終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇的半固體培養基平板上（平板使用前在超凈臺晾5-10 min），DMSO作為陰性對照，正置于超凈臺中待晾干，再置于28℃正置培養2 d，觀察菌苔的擴散情況并測量菌苔直徑，進行統計分析，實驗設置3個重復。

1.2.7 數據處理方法 采用Excel 2010進行數據處理，并采用t檢驗進行顯著性分析。P < 0.05，有統計學差異（*）；P < 0.01，差異顯著（**）；P < 0.001，差異極顯著（***）；P ＞ 0.05差異不顯著（NS）。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對Xaj抑菌活性分析

采用K-B濾紙片擴散法測定白藜蘆醇對Xaj的抑菌活性，結果如圖1-A所示，在滴加有白藜蘆醇的濾紙片周圍形成了明顯透明圈，而滴加有DMSO的對照組濾紙片周圍無透明圈，說明白藜蘆醇能有效抑制Xaj的生長。隨后采用濃度梯度稀釋法測定白藜蘆醇對Xaj的最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC），由圖1-B可見，白藜蘆醇的濃度在20 μg/mL時能夠顯著抑制Xaj的生長（P < 0.01），因此，白藜蘆醇對Xaj的最低抑菌濃度（MIC）為20 μg/mL；隨著白藜蘆醇濃度的升高，抑制活性越強，當白藜蘆醇濃度達到45 μg/mL時，基本能夠完全抑制Xaj的生長，即最低殺菌濃度（MBC）為45 μg/mL；在亞抑菌濃度（5 μg/mL、10 μg/mL和15 μg/mL）下，白藜蘆醇均不能顯著抑制Xaj的生長（P ＞ 0.05）。

圖1 白藜蘆醇對Xaj的抑菌活性檢測Fig. 1 Detection of the antibacterial activity of resveratrol against Xaj

2.2 白藜蘆醇對Xaj生物被膜形成的影響

本研究采用結晶紫法分析白藜蘆醇在亞抑菌濃度下對Xaj生物被膜（bacterial Biofilm，BF）形成能力的影響。結果發現，在添加15 μg/mL白藜蘆醇的情況下，Xaj在指形管壁上形成的紫色圈明顯少于陰性對照組（圖2-A）；再用無水乙醇溶解管壁結晶紫，比較實驗組與對照組生物被膜的形成量，發現添加15 μg/mL白藜蘆醇情況下形成生物被膜量僅為對照組的40%左右（圖2-B），表明在15 μg/mL的亞抑菌濃度下，白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj生物被膜的形成。

圖2 白藜蘆醇對Xaj生物被膜形成的影響Fig. 2 Effect of resveratrol on Xaj biofilm formation

2.3 白藜蘆醇對Xaj產胞外多糖的影響

本研究通過液體搖瓶發酵法測定白藜蘆醇對Xaj胞外多糖（EPS）產生的影響，發酵5 d后進行觀察。在未添加白藜蘆醇時，Xaj的EPS產量為7.47 mg/mL；而添加15 μg/mL白藜蘆醇進行培養時，發酵液中基本無絮狀沉淀物產生，EPS產量基本為0 mg/mL（圖3），表明在15 μg/mL的亞抑菌濃度下，白藜蘆醇對Xaj的EPS產生有明顯抑制作用。

圖3 白藜蘆醇對Xaj產胞外多糖的影響Fig. 3 Effect of resveratrol on extracellular polysaccharide production by Xaj

2.4 白藜蘆醇對Xaj分泌胞外酶的影響

利用添加相應物質的固體平板，分別在亞抑菌濃度下檢測了白藜蘆醇對Xaj分泌胞外酶（蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶）的影響。研究結果顯示，添加15 μg/mL白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj的蛋白酶的分泌（圖4），對淀粉酶的分泌有促進作用（圖5），而對纖維素酶的分泌沒有影響（圖6）。

圖4 白藜蘆醇對Xaj分泌胞外蛋白酶的影響Fig. 4 Effect of resveratrol on extracellular protease secreted by Xaj

圖5 白藜蘆醇對Xaj分泌胞外淀粉酶的影響Fig. 5 Effect of resveratrol on extracellular amylase secreted by Xaj

圖6 白藜蘆醇對Xaj分泌胞外纖維素酶的影響Fig. 6 Effect of resveratrol on extracellular cellulase secreted by Xaj

2.5 白藜蘆醇對Xaj運動性的影響

通過運動性半固體平板進行運動性實驗。結果表明在濃度為15 μg/mL時，白藜蘆醇對Xaj運動性沒有影響（圖7）。

圖7 白藜蘆醇對Xaj運動性的影響Fig.7 Effect of resveratrol on Xaj motility

3 討論

胞外多糖是生物膜的主要組成成分，它在抑制植物防衛反應，及菌體生物膜的形成中扮演著重要角色［18］。本研究表明一定量的白藜蘆醇能明顯抑制核桃細菌性黑斑病菌胞外多糖的產生，對生物膜的形成也有抑制作用，測定的胞外多糖合成量與生物膜的形成情況成正相關，與理論相符。植物細胞壁是病原菌入侵的主要屏障之一，而植物病原細菌可通過II型分泌系統（T2S）分泌降解植物細胞壁的酶（主要有纖維素酶、淀粉酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶等）及多種毒性因子，破壞寄主細胞，從而達到進入寄主體內并獲得生長繁殖所需的營養的目的［19］。在檢測白藜蘆醇影響胞外酶分泌的研究中，白藜蘆醇既有促進效果，又有抑制作用，說明細菌分泌的3種胞外酶的活性不同，對白藜蘆醇具有不同的敏感性。研究可見纖維素酶的水解透明圈非常明顯，較另外兩種酶的圈直徑都大，表明該病原菌具有較強的纖維素酶分泌能力（與之前已發表的數據一致［20］），因此，濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇不足以抑制其纖維素酶的分泌，后續研究中將選用更高的亞抑菌濃度進行相關實驗。

近幾年，我國局部核桃生產地區的細菌性黑斑病的發生隨著種植面積不斷擴大而愈發嚴重。目前，我國對于核桃黑斑病的研究還處于初步階段，缺乏系統和深入的研究，且采取的防治方法都存在一定的局限性，如選育抗病品種過程繁瑣而且周期過長，抗性品種的選育與推廣速度遠遠低于病原菌變異的速度；外源噴灑含銅化學農藥（或銅鋅制劑與抗生素類農藥交替使用）的化學防治方法雖然是目前較為有效的黑斑病防治手段，但長期使用將導致農藥殘留，造成抗銅細菌的滋生，引起食品安全及生態平衡破壞等弊端。因此，開發科技含量的防病技術與綠色環保藥物，進行綜合性科學防治，以高效控制核桃細菌性黑斑病的發生是當下一項重要任務。

由于植物中白藜蘆醇的含量很低，加之提取與制備工藝復雜，且需要獲得較高純度才能達到一定抑菌效果，因此將其作為天然殺菌劑進行應用的成本頗高，可考慮用化學方法人工合成白藜蘆醇衍生物，并對其抑菌效果及殺菌譜進行研究驗證，為開發合適的新型抑菌劑提供理論依據。在利用其抗菌活性的同時，其與已知抗菌藥物潛在的協同作用也是一個不容忽視的重要方面，與其他抗菌劑的配合使用是否可增加藥效，也是值得考慮的問題。目前，關于白藜蘆醇抑菌的研究，主要集中在人體致病菌，少見對植物致病菌抑制效果的報道，因此在農業方面的應用稍有欠缺，應更多地關注其對于農林作物病害的防治。在未來，需要更多的研究來闡明白藜蘆醇被開發成生物制藥產品和新型植物源農藥的潛力。

本研究發現白藜蘆醇對核桃細菌性黑斑病菌的毒力因子產生的表型均有一定影響，但關于白藜蘆醇抑制核桃細菌性黑斑病病原菌的機制目前尚不清楚，有待深入研究。研究表明脂肪酸合成代謝與病原菌致病性具有相關性［21］，因此可聯系該細菌脂肪酸合成代謝途徑中關鍵基因的功能，進一步確定白藜蘆醇的作用靶點，探討其作用機制。有研究報道白藜蘆醇能抑制奇異變形桿菌的遷徒生長，推測原因是白藜蘆醇作用于一種含組氨酸的磷酸根離子的細菌雙組分信號系統［22］。雙組分信號轉導系統（twocomponent signal transductionsystem，TCSTS）是原核細胞中一種非常重要的信號傳遞機制，也是細菌最主要的感應-響應調節機制［23］。而DSF依賴的群體感應系統是調控病原微生物致病性和環境適應性的重要方式，也是防治植物細菌性病害的重要切入點。鑒于此，課題組擬開展“白藜蘆醇與環二鳥苷酸代謝相關酶（一種TCSTS受體/感應蛋白）的相互作用”的研究，建立白藜蘆醇與細菌DSF群體感應之間的關聯。另外也可通過掃描電鏡和透射電鏡動態地觀察在白藜蘆醇作用后，細菌細胞微觀結構的變化，或利用電導率儀測定細胞膜的通透性，從而揭示其作用機制。

4 結論

本研究通過K-B濾紙片法初步確定白藜蘆醇對核桃細菌性黑斑病菌XajDW3F3具有抑制作用。在此基礎上，進一步通過液體培養法，測定了白藜蘆醇對Xaj的最低抑菌濃度（MIC）為20 μg/mL，以及最低殺菌濃度（MBC）為45 μg/mL。并選擇在亞抑菌濃度為15 μg/mL的條件下檢測白藜蘆醇對Xaj毒力因子的影響。研究結果表明在此濃度下白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj生物被膜的形成；對該菌對胞外多糖（EPS）的產生也有明顯抑制作用；而在檢測對胞外酶分泌的影響時發現白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj的蛋白酶的分泌，對淀粉酶的分泌卻有促進作用，而對纖維素酶的分泌沒有影響。另外運動性實驗結果顯示白藜蘆醇對Xaj運動性沒有影響。