黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母中的表達及產酶 條件的優化

廖兆民 蔡俊，2，3 林建國 杜馨 王常高

（1. 湖北工業大學生物工程與食品學院，武漢 430068；2. 湖北工業大學生物工程與食品學院工業微生物湖北省重點實驗室，武漢 430068； 3. 湖北工業大學生物工程與食品學院發酵工程教育部重點實驗室，武漢 430068）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，GOD）是一種非常重要的黃素糖蛋白，屬于氧化還原酶，在有氧條件下能專一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2［1］。GOD的應用十分廣泛，在醫藥行業，GOD常應用于生物傳感器和固定化酶［2］。GOD的反應產物過氧化氫在食品領域可作為抗菌劑和氧化劑［3］，葡萄糖酸也可以作為色素穩定劑、酸化劑和螯合劑等［4］。另外，飼料中添加GOD能促進仔豬的生長和發育［5］。

葡萄糖氧化酶廣泛分布于動植物和微生物體內，但目前工業上生產葡萄糖氧化酶的主要菌株為點青霉和黑曲霉［6］。霉菌GOD具有廣譜應用的特點，能讓GOD在更高溫度和更長時間內保持穩定，從而提高經濟效益［7］。盡管已經有許多成功的研究通過使用遺傳修飾和其他方法來優化霉菌GOD的產生，但是不同霉菌GOD積累的機制尚不完全清楚，且霉菌發酵生產GOD的過程中存在產生真菌毒素、發酵副產物較多等不利于后期分離GOD的缺點［8］。

異源表達重組GOD能有效解決以上問題［9］。特別是以畢赤酵母為宿主細胞構建工程菌，具有蛋白表達量高、發酵成本低和便于分離純化等優點，并且可以選擇含醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）強啟動子的質粒進行表達載體構建［10］，同時重組酵母細胞可進行高密度連續補料發酵，有效控制外源基因的表達［11］。

本研究通過多序列比對設計簡并引物，從黑曲霉中克隆得到GOD，并將其構建在pPICZαA載體上，轉化至畢赤酵母GS115，實現了黑曲霉GOD的異源表達；以重組酵母為研究對象，系統優化誘導溫度、pH、搖床轉速和甲醇濃度等，實現了重組GOD的高效表達；在30 L發酵罐中高密度發酵放大試驗，通過共表達His4，采用DO-STAT的甲醇流加策略高密度發酵，進一步實現了葡萄糖氧化酶的高效表達，為葡萄糖氧化酶的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 黑曲霉（Aspergillus niger）菌株由湖北工業大學生物工程與食品學院微生物制劑研究團隊保藏。大腸桿菌（Escherichia coli）Top10菌株購自天根生化科技有限公司。畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115由武漢輕工大學生物與制藥工程學院楊江科教授饋贈。畢赤酵母表達載體pPICZαA購自淼靈生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶Kpn I、Not I、Pme I為NEB公司產品；葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、鄰聯茴香胺、牛血清白蛋白購自Sigma公司；真菌提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；高保真DNA聚合酶、DNA Marker、蛋白Marker，質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA片段純化試劑盒等購于TaKaRa公司；pGM-Simple-T Fast克隆試劑盒購于天根生化科技有限公司；其他分析純試劑購自國藥集團；PCR擴增引物由南京金斯瑞公司合成。

1.1.3 培養基 黑曲霉的培養用PDA培養基。大腸桿菌的培養和轉化用LB培養基和低鹽LB培養基。酵母的培養、轉化和蛋白的誘導產生用YPD、BMGY、BMMY等培養基。分批發酵用BSM培養基。

培養基組分成分（1 L）：PDA：馬鈴薯200 g和葡萄糖20 g。LB：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g和NaCl 10 g。低鹽LB：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g和NaCl 5 g。YPD：蛋白胨20 g、酵母粉10 g和葡萄糖20 g。BMGY：蛋白胨20 g、酵母粉10 g、pH 6.0磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、YNB 13.4 g、甘油10 g和生物素 400 μg。BMMY：蛋白胨20 g、酵母粉10 g、pH 6.0磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、YNB 13.4 g、甲醇5 g和生物素400 μg。BSM：80% H3PO426.7 mL、CaSO40.93 g、K2SO418.2 g、MgSO4·7H2O 14.9 g、KOH 4.13 g、甘油40 g和PTM1 4.35 mL。

補料培養基：含12 mL/L PTM1的50%（W/W）甘油和2 g/L L-組氨酸。誘導培養基：含12 mL/L PTM1的甲醇。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉全基因組的提取 按照索萊寶科技有限公司真菌基因組提取試劑盒方法提取黑曲霉基因組DNA。

1.2.2 簡并引物的設計 在NCBI數據庫中下載多個有活性的黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列，13個NCBI序 列 號 分 別 為：AJ294936.1、AY803992.1、 DQ661005.1、DQ836361.1、EU532181.1、EU532182.1、FJ979866.1、HQ269422.1、J05242.1、JX105360.1、KC333175.1、KJ774107.1和X16061.1。通過分析其氨基酸序列設計簡并引物，其5′端引物序列Z1為：5′-ATGCARACTCTKKTTGTGAG-3′，其3′端 引 物 序列Z2為：5′-TCACTGCATRGAAGCATAAT-3′。

1.2.3 葡萄糖氧化酶基因的擴增 簡并引物以黑曲霉全基因組DNA為模板進行PCR。反應體系為 50 μL：10×PCR buffer（含Mg2+）5.0 μL、Z1（10 μmol/L） 1.5 μL、Z2（10 μmol/L）1.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4.0 μL、模板DNA 1.0 μL、rTaq酶 1 μL和ddH2O 36 μL。PCR反應條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 4 min，共30個循環；72℃ 10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。將回收產物與T載體連接，對重組質粒進行測序。

1.2.4 GOD基因重組表達載體的構建 為了確保分泌表達的GOD的N端帶有天然的氨基酸殘基，在上游引物5′端引入了表達載體pPICZαA的α-factor信號肽中Xho I酶切位點序列（下劃線部分）和Kex 2信號肽酶切位點序列（斜體部分），并去掉GOD ORF中的信號肽序列，下游引物5′端引入了Not I酶切位點序列（下劃線部分）。引物序列為：GOD-F：5′-CCCTCGAGAAAAGAAGCAATGGCATCGA AGC-3′，GOD-R：5′-TTGCGGCCGCCTGCATGGAAGC TAAT-3′，PCR反應體系和條件同上。PCR產物經純化回收后用限制性核酸內切酶Xho I和Not I雙酶切，與同樣雙酶切后的表達載體pPICZαA進行連接，轉化到E.coli Top10。酶切鑒定陽性克隆，并送至北京擎科生物有限公司進行測序。

1.2.5 畢赤酵母的轉化及搖瓶水平誘導培養 將重組質粒pPICZαA-GOD經Pme I酶切線性化，用DNA片段純化試劑盒回收至高純度的DNA。將5-10 μg線性化的pPICZαA-GOD質粒電擊轉化至80 μL畢赤酵母GS115感受態細胞，然后將轉化細胞涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃避光靜置培養2-3 d，用無菌牙簽挑取陽性轉化子依次點種到含有500、1 000和2 000 μg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃避光靜置培養2-3 d，觀察酵母轉化子的生長情況，逐級篩選含有多拷貝目的基因的重組酵母菌株。挑選6株含多拷貝目的基因的重組酵母菌株轉接至YPD液體培養基（50 mL培養基/250 mL三角瓶）中，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養24 h。將發酵液按1%的接種量接種到BMGY液體培養基中（25 mL培養基/250 mL三角瓶中），于30℃、220 r/min條件下振蕩培養16-18 h，OD600=4-6，離心收集全部菌體，用BMMY液體培養基（50 mL培養基/500 mL三角瓶中）重懸菌體，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養96 h，每24 h補加發酵液體積0.5%的甲醇，將GOD表達量最高的轉化子命名為GS115/pPICZαAGOD。

1.2.6 葡萄糖氧化酶活力測定 采用鄰聯茴香胺分光光度法［12］。在7 mL離心管中，加入鄰聯茴香胺緩沖溶液2.5 mL，18%葡萄糖溶液0.3 mL，100 U/mg辣根過氧化酶溶液0.1 mL，混勻，37℃預熱3 min，分別加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 U/mL葡萄糖氧化酶標準液，37℃反應3 min，加入2 mL 2 mol/L硫酸終止反應，于540 nm測定吸光度值繪制標準曲線。發酵上清液經稀釋后測定540 nm處的吸光值，根據標準曲線公式，計算發酵上清液葡萄糖氧化酶活力。酶活力定義為：在溫度為37℃，pH為6.0的磷酸鈉緩沖溶液的反應條件下，每分鐘將1 μmol/L的葡萄糖催化氧化為葡萄糖酸和過氧化氫所需要的GOD的量為一個GOD的活力單位。

1.2.7 共表達載體pPIC9k的轉化 由于重組酵母為組氨酸缺陷型菌株，將pPIC9k經BspE I酶切線性化后電轉至重組酵母GS115/pPICZαA-GOD，挑取陽性轉化子命名為GS115/pPICZαA-GOD/His4在搖瓶水平進行誘導表達，培養條件同1.2.5。

1.2.8 搖瓶發酵條件的優化 為了探究搖瓶中重組畢赤酵母產GOD最佳條件，通過對誘導過程中的溫度、pH、甲醇體積分數和搖床轉速等4個因素進行了優化。挑取酶活最高的多拷貝酵母轉化子轉接至YPD培養基中，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養24 h。將發酵液按1%的接種量接種到BMGY液體培養基中，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養16-18 h，OD600=2-6，離心收集全部菌體，用BMMY液體培養基重懸菌體，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養96 h，每24 h補加發酵液體積0.5%的甲醇。誘導溫度分別設置為15℃、20℃、25℃、30℃和35℃；pH分別設置為4、5、6、7和8；甲醇體積分數分別設置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%；搖床轉速分別設置為160、190、220、250和 280 r/min。誘導96 h后測定OD600和酶活來確定最佳誘導條件。

1.2.9 GS115/pPICZαA-GOD的高密度發酵 選取搖床水平上酶活最高的轉化子，研究其在30 L發酵罐中的發酵產酶過程。挑取平板上的單菌落接種于YPD培養基培養24 h，按3%接種量轉接于BMGY培養基（100 mL培養基/500 mL三角瓶中）至OD600≈10接種于含10 L BSM培養基（含2 g/L組氨酸）的30 L發酵罐，接種量為10%。誘導前用濃氨水控制pH 5.0，培養溫度控制在30℃。發酵過程分為3個階段，第一階段為甘油分批階段，酵母細胞消耗底水培養基積累菌體。底水培養基中甘油耗盡時（DO值陡升）進入甘油流加階段，開始流加50%甘油和2 g/L組氨酸，至生物量達到約180-220 g/L，停止流加甘油和組氨酸，1 h后發酵液中甘油耗盡（溶氧值DO陡升）進入誘導階段，開始流加甲醇，每12 h取樣測定發酵上清液酶活和細胞濕重，并進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍R-250染色，脫色液（乙醇150 mL、冰醋酸50 mL和水800 mL）脫色。1.2.10 GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度發酵 按3%接種量轉接于BMGY培養基（100 mL培養基/ 500 mL三角瓶中）至OD600≈10接種于含10 L BSM培養基的30 L發酵罐，接種量為10%。誘導前用濃氨水控制pH 5.0，培養溫度控制在30℃。底水培養基中甘油耗盡時開始流加50%甘油至23 h，停止流加甘油，饑餓培養1 h開始流加甲醇，甲醇流加方式采用低甲醇高溶氧的DO-STAT流加策略，通過降低甲醇流加速度使溶氧維持在10%左右，每12 h取樣測定發酵上清液酶活和細胞濕重。

2 結果

2.1 多序列對比和黑曲霉GOD的克隆分析

多序列比對結果如圖1，以黑曲霉全基因組DNA為模板（圖2），簡并引物Z1和Z2進行PCR擴增（圖3）。經測序發現，該GODDNA長1 818 bp，GC含量為58%，無內含子，編碼606個氨基酸。通過同源分析，與黑曲霉Z-25的GOD（GenBank登錄號：FJ979866.1）有100%的核酸序列相似性。去除信號肽的GOD的PCR擴增結果見圖4。

圖1 部分黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of glucose oxidase amino acid sequences from partial A. niger

圖2 黑曲霉全基因組的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of whole genome extraction from Aspergillus niger

圖3 簡并引物Z1、Z2的PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of degenerate primers Z1 and Z2

圖4 葡萄糖氧化酶的PCR擴增Fig.4 PCR amplification of glucose oxidase

2.2 酵母表達載體的構建與鑒定

將重組質粒pPICZαA-GOD（圖5-A）轉化至感受態細胞大腸桿菌Top10，并在含Zeocin的低鹽LB平板上篩選陽性菌落。提取陽性菌落質粒，經Xho I和Not I雙酶切后，得到約3.5和1.8 kb的2個DNA片段，亦與預期大小相符（圖5-B）。重組質粒測序結果顯示去除信號肽的GOD已正確插入到pPICZαA載體α-因子信號肽序列的下游，表明含黑曲霉GOD的畢赤酵母表達載體pPICZαA-GOD構建成功。

圖5 重組質粒pPICZαA-GOD構建及雙酶切鑒定Fig.5 Construction of recombinant plasmid pPICZαAGOD and identification by double restriction endonuclease digestion

2.3 多拷貝轉化子的篩選

根據黑曲霉GOD基因序列的限制性酶切圖譜，選擇限制性內切酶Pme I對重組質粒pPICZαAGOD進行線性化（圖6），遷移速度較慢的為線性化的pPICZαA-GOD片段。同時，用Pme I對空載體pPICZαA進行線性化處理，作為后續試驗的陰性對照。將線性化的重組質粒pPICZαA-GOD和空質粒pPICZαA電擊轉化至畢赤酵母GS115感受態。在YPD平板生長3 d后，用無菌牙簽挑取單菌落依次點種在含有Zeocin濃度分別為500、1 000和2 000 μg/mL的YPD平板上。2 d后，酵母陽性轉化子在YPD抗性梯度平板上的生長情況如圖7所示，挑取6株在含Zeocin 2 000 μg/mL的YPD平板上生長較好的重組酵母單菌落，進行下一步的誘導表達。

圖6 pPICZαA-GOD和pPICZαA線性化產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of the linearized products of pPICZαA-GOD and pPICZαA

圖7 酵母轉化子的高濃度zeocin抗性篩選Fig.7 Screening of high concentration zeocin resistance of yeast transformants

2.4 GOD在畢赤酵母GS115中的表達

將上述6株重組酵母菌分別命名為A1、A2、A3、A4、A5和A6，在BMMY培養基中進行甲醇誘導表達，每24 h取樣測定發酵上清液中葡萄糖氧化酶活力。圖8為6株重組酵母菌誘導培養96 h的產酶曲線圖。隨著誘導時間的延長，發酵上清液中葡萄糖氧化酶活力不斷增加。其中，重組酵母菌A6產葡萄糖氧化酶的能力最佳，甲醇誘導96 h時，發酵上清液中葡萄糖氧化酶的活力達到32.25 U/mL。因此，將重組酵母菌A6命名為GS115/pPICZαA-GOD，用于后續試驗的研究。

圖8 高zeocin抗性酵母轉化子表達葡萄糖氧化酶的活力曲線Fig.8 Activity curve of glucose oxidase expressed by transformants with high zeocin resistance in yeast

通過共表達質粒pPIC9k，在重組酵母細胞中共表達His4，如圖9-A重組酵母GS115/pPICZαAGOD/His4甲醇誘導96 h后，GOD表達量相比原始重組酵母提高了11%。同時，OD600相比原始重組酵母提高了65%，說明通過共表達His4補償畢赤酵母GS115為組氨酸缺陷型菌株的不足，使得細胞密度大幅度提升從而提高了重組GOD表達量。

圖9 GS115/pPICZαA-GOD與GS115/pPICZαA-GOD/His4的搖瓶水平誘導結果Fig.9 GS115/pPICZαA-GOD and GS115/pPICZαA-GOD/His4 shake flask level induction results

2.5 重組酵母產GOD的搖瓶發酵條件優化

通過對誘導溫度、pH、甲醇體積分數和搖床轉速等4個因素進行優化。結果表明，如圖10-A，誘導溫度對重組酵母生長和GOD表達量均有較大的影響。15-25℃酵母生長情況差別不大，但重組GOD表達量卻有較大差異，15℃時GOD表達量為10.7 U/mL，隨著誘導溫度升高，生物量和表達量均上升。30℃時，GOD酶活達到最高31.05 U/mL，當溫度繼續升高時，GOD活性開始下降，這可能是由于畢赤酵母在高于30℃的條件下不利于蛋白質的表達。pH對誘導過程中細胞生長影響不大，當pH6時，GOD酶活最高為36.5 U/mL（圖10-B）。甲醇體積分數對重組酵母產GOD的影響如圖10-C，用1.0%甲醇進

行誘導時，獲得的酶活最高為45.2 U/mL，但隨著甲醇濃度的升高，細胞密度和酶活力顯著降低。搖床通過不同轉速的振蕩影響培養基中的溶氧值從而影響細胞生長和目的蛋白的表達（圖10-D），當搖床轉速達到250 r/min時，細胞密度最大且此時重組GOD表達量最高。通過對重組酵母產GOD的發酵條件進行優化，結果表明最佳發酵條件為：在30℃、pH 6.0、250 r/min條件下誘導96 h，每24 h向發酵液中添加甲醇至終濃度為1.0%，重組GOD酶活達到50.1 U/mL，較優化前提高了55.3%。

圖10 重組酵母產GOD發酵條件的優化Fig.10 Optimization of fermentation conditions for GOD production by recombinant yeast

2.6 GS115/pPICZαA-GOD的高密度發酵

如圖11所示，發酵0-18 h，處于甘油分批階段，生物量增長至103 g/L。發酵18 h時監測到DO值迅速上升，說明底水培養基中甘油耗盡，此時開始流加補料培養基，進入甘油流加階段。該階段重組酵母細胞不表達葡萄糖氧化酶蛋白，當生物量達到180 g/L以上時，停止流加甘油和組氨酸。24 h時發酵液中甘油耗盡（溶氧值DO陡升），生物量達到183.5 g/L，此時開始流加甲醇誘導酵母細胞表達GOD，發酵液中GOD活性逐漸增加。發酵72 h時生物量開始下降，由于重組酵母細胞為組氨酸缺陷型菌株，此時生物量下降的原因很有可能是培養基中組氨酸已耗盡，部分菌體衰老自溶。隨著甲醇的持續誘導，發酵上清液中GOD活性繼續增加。發酵120 h（誘導96 h）時發酵液中GOD活性達到最高307 U/mL，相比搖床水平，酶活提高了5.1倍。SDS-PAGE結果（圖12）表明，發酵液中GOD蛋白表達量也在不斷積累，發酵上清中GOD純度非常高，僅含有少量的雜蛋白，有利于GOD的分離。

圖12 30 L發酵罐中重組畢赤酵母表達葡萄糖氧化酶蛋白的SDS-PAGEFig.12 SDS-PAGE of glucose oxidase protein expressed in recombinant P. pastoris in 30 L bioreactor

2.7 GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度發酵

如圖13，發酵0-18 h，處于甘油分批階段，細胞濕重增長至138 g/L。24 h時發酵液中甘油耗盡（溶氧值DO陡升），細胞濕重達到225.5 g/L，較重組酵母GS115/pPICZαA-GOD提高了22.9%。此時開始以低甲醇流速誘導酵母細胞表達GOD，采用DO-STAT控制培養，整個誘導階段溶氧控制10%左右，逐步提高轉速和通氣量。發酵108 h（誘導84 h）時細胞濕重達到最高440 g/L，相比GS115/pPICZαA-GOD提高了72.5%。發酵120 h時GOD活性達到最高461 U/mL，相比GS115/pPICZαA-GOD提高了50.2%。

圖13 重組畢赤酵母GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度發酵曲線Fig.13 High density fermentation curve of recombinant P. pastoris GS115/pPICZαA-GOD/His4

3 討論

葡萄糖氧化酶廣泛應用于食品、醫藥、紡織和飼料等領域［13-16］。目前，大多數研究旨在產葡萄糖氧化酶菌株的誘變育種和產酶條件的優化，也有部分研究通過基因工程的手段異源表達重組葡萄糖氧化酶基因［6］。畢赤酵母作為甲基營養型酵母特別適合外源蛋白的表達，更易于進行基因操作，例如基因打靶、高頻DNA轉化、通過功能互補進行克隆、在細胞內或細胞外水平高效表達蛋白質，以及執行更高級別的真核蛋白質修飾的能力，如糖基化、二硫鍵形成和蛋白水解處理［17］。即使在連續和大規模的工業化發酵過程中，畢赤酵母也可以用最簡單的培養基培養到非常高的細胞密度［18-19］，同時整合的載體有助于重組元件的遺傳穩定性。由于畢赤酵母自身的天然蛋白分泌水平相對較低，因此重組分泌型蛋白的純化方式也更加簡單［20-21］。本研究依據已報道的多個黑曲霉葡萄糖氧化酶DNA序列設計簡并引物，從黑曲霉中成功克隆出GOD，通過BLAST，與黑曲霉Z-25的葡萄糖氧化酶基因（GenBank登錄號：FJ979866.1）相似性達100%。

本研究構建的畢赤酵母工程菌株GS115/pPICZαA-GOD在30℃、220 r/min條件下0.5%甲醇誘導96 h酶活可達32.25 U/mL。適宜的誘導條件是高效表達重組蛋白的必要條件，經優化得到最佳誘導條件為：在30℃、pH 6.0、250 r/min條件下誘導96 h，每24 h向發酵液中添加甲醇至終濃度為1.0%，重組GOD酶活達到50.1 U/mL，提高了55.3%。甲醇濃度為0.5%時，細胞密度最大，但酶活卻不是最高，說明細胞密度越高并不一定代表蛋白表達量越高，誘導劑的濃度也是影響蛋白表達的重要因素之一。劉瑜等［22］報道在畢赤酵母SMD1168中表達黑曲霉QYW3221 GOD，甲醇誘導7 d后酶活最高達14.9 U/mL。周亞鳳等［23］報道在畢赤酵母GS115中表達黑曲霉9029 GOD，經甲醇誘導3-4 d，發酵液中GOD活力達30-40 U/mL。Crognale等［24］將變換青霉P16 GOD在畢赤酵母X-33中異源表達，在3 L發酵罐中，發酵15 d后GOD活力達到50 U/mL。本研究在30 L發酵罐中誘導表達4 d，GOD酶活達到307.52 U/mL，是搖瓶水平的6.1倍，達到了目前研究中的較高水平，但由于重組酵母為組氨酸缺陷型菌株，若使用BSM培養基分批發酵則需要額外添加L-組氨酸，從工業化的角度來說，添加L-組氨酸大大增加了生產成本。

本研究通過共表達質粒pPIC9k引入His4，搖瓶水平研究表明，共表達His4使重組酵母的生物量提高了65%，GOD活力提高了11%。本研究采用“低甲醇-高溶氧”的DO-STAT流加策略在30 L發酵罐中誘導96 h，GS115/pPICZαA-GOD/His4細胞濕重達到432.5 g/L。此時發酵上清液中GOD活力達到最高，為461 U/mL，較原始重組酵母提高了50.2%。根據葡萄糖氧化酶的DNA序列推測其分子量為64 kD，郭瑤等［25］報道黑曲霉Z-25所產GOD的分子量為76 kD，與推測的分子量相比多出的部分為糖基化部分，糖基化程度為15.8%。畢赤酵母會對重組GOD進行高糖基化修飾［26］，本研究中重組GOD分子量約為90 kD，比黑曲霉Z-25所產GOD的分子量高約14%，這可能是過度糖基化造成的。GOD是一種糖蛋白，糖基化修飾是畢赤酵母中GOD正確折疊和裝配的重要過程。后續研究中將通過酶工程技術，共表達凝集素伴侶加快糖基化修飾過程，這可能是促進畢赤酵母分泌表達GOD的有效策略。

4 結論

從黑曲霉中克隆獲得GOD，實現了黑曲霉GOD在畢赤酵母GS115中的高效表達，最佳發酵條件為重組畢赤酵母GS115/pPICZαA-GOD在30℃、pH 6.0、250 r/min使用1.0%甲醇誘導表達，GOD表達量相比優化前提高55.3%。通過30 L發酵罐高密度發酵，相比搖瓶水平，酶活提高5.1倍，達到307.52 U/mL。首次在畢赤酵母GS115中共表達His4，并采用DOSTAT的甲醇流加策略在30 L發酵罐水平上實現了GOD的高效表達，大大提高了重組酵母細胞濕重和GOD酶活，最高酶活可達到461 U/mL，同時降低了發酵成本，避免了發酵過程中添加組氨酸。