鹽池采油區污染土壤石油降解菌的篩選鑒定及其降解 特性

沈聰 劉爽 王春霞 嚴雪梅 代金霞

（1. 寧夏大學生命科學學院，銀川 750021；2. 寧夏環境科學研究院，銀川 750004）

近幾十年來，隨著原油工業的迅速擴張，大量原油在開采、煉制和運輸過程中的泄漏風險也成比例增加，對土壤和海洋環境構成了嚴重威脅［1］。僅陸地運輸產生的原油泄漏就造成了約10%的土壤污染［2］。石油的主要成分具有較大毒性，污染物進入土壤后難以去除，長期污染會引起土壤生物群落結構發生改變，從而損害作物生長并導致土地生產力急劇下降［3］。污染物還會隨著徑流進入周圍的流域和地下水，對人類健康和生態系統功能具有廣泛的負面影響。切實有效地解決石油污染土壤的修復問題，己成為國內外研究的熱點［4］。

目前，微生物修復作為一種環境友好、經濟有效的技術，成為了有較大發展潛力和應用前景的修復技術，是當前治理石油污染土壤最為有效的途徑之一［5］。向石油污染土壤中投加環境適應強、降解效能高的菌種或菌群是提高生物修復效率的主要手段［6］。因此，篩選高效石油降解菌株以研制新型土壤修復劑是微生物修復的關鍵。作為最大的微生物資源庫，土壤也是石油降解菌的重要來源之一。迄今為止，已報道的能夠降解石油的土壤微生物已有200多種，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）［7］、紅球菌屬（Rhodococcus）［8］、微桿菌屬（Microbacte- rium）［9］、芽孢桿菌屬（Bacillus）［10］、產堿桿菌屬（Alcaligenes）［11］等都是常被分離篩選出的石油降解菌群。但細菌的降解能力會受到石油烴性質、菌體自身特性及降解環境的影響，由于異源細菌缺乏適應性，在新環境中添加異源細菌作為生物強化劑的修復效果并不顯著［12］。因此，廣泛開展從原油污染土壤的土著微生物中篩選環境適應強、降解效能高的菌種并優選其作為生物強化劑的應用，可有效地促進石油污染土壤的生物修復效率。本研究從寧夏鹽池縣油田開發區原油污染土壤中分離篩選石油降解菌株，結合菌株的形態、生理特征及16S rRNA序列分析對其進行初步鑒定，通過菌株的交互作用和降解特性分析，構建高效的石油降解菌群，研究其對原油污染土壤的修復效果，以期為鹽池地區石油污染土壤的微生物修復提供高效菌源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤來源 供試土壤：土壤樣品采集于寧夏鹽池縣大水坑牛毛井村采油三廠附近。共設置4個樣地，每個樣地按照五點取樣法，去除表層土后取2 cm-10 cm處污染土壤0.5 kg左右，將每個樣地的5份土樣混勻裝入無菌袋中帶回實驗室備用。

1.1.2 主要培養基 富集培養基：K2HPO40.8 g；NaH2PO40.4 g；NaCl 0.2 g；CaCl20.1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；NH4Cl 2.0 g；適量原油；蒸餾水1 000 mL；pH 7.0-7.2；121℃滅菌20 min。

無機鹽培養基：NaCl 10.0 g；NH4Cl 0.5 g；KH2PO40.5 g；K2HPO41.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；CaCl20.02 g；KCl 0.1 g；FeCl2·4H2O 0.02 g；蒸餾水1 000 mL，微量元素1 mL，pH 7.5。

分離培養基：無機鹽培養基1 000 mL，原油3.0 g，瓊脂18.0 g-20.0 g，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 石油降解菌的分離純化和富集篩選 分離培養基篩選石油降解菌：稱取10.0 g油污土壤加入到已滅菌的90 mL蒸餾水中，在28℃、150 r/min 條件下振蕩培養1 h，靜置30 min，將上清液梯度稀釋至10-2-10-4后，各取0.1 mL涂布于分離平板上，每個梯度設置3個重復，在28℃培養箱中培養2 d-7 d，挑取單菌落在分離平板上劃線純化3-4次，直至獲得單一菌落。

石油降解菌的富集篩選：稱取5.0 g油污土壤加入到100 mL含1%石油的富集培養基中，28℃，150 r/min振蕩培養7 d，按5%的接種量將富集液轉接在含有3%石油的富集培養基中，在相同條件下培養7 d，再次按5%的接種量轉接于含有5%石油的富集培養基中振蕩培養7 d，進行富集馴化。將以上富集液吸取梯度稀釋后涂于LB平板上，28℃培養2 d-3 d，根據菌落形態進行劃線純化，直至得到單一菌株。

1.2.2 石油降解菌的鑒定 菌株的生理生化特征測定：對純化的菌株進行革蘭氏染色、硝酸鹽還原、淀粉水解、明膠實驗、VP實驗、甲基紅實驗和過氧化氫酶等生理生化特征進行測定，根據《常見細菌系統鑒定手冊》［13］，結合菌體和菌落形態對菌株進行初步鑒定。

菌株的分子鑒定：將純化后的菌株接種于LB培養液中振蕩培養至對數期，取1 mL菌懸液，采用細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302，北京天根）提取菌株的總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，用細菌16S rRNA基因通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3′）對菌株的16S rRNA基因進行PCR擴增。擴增結束后 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結果利用eZtaxon網站（https：//www.ezbiocloud.net/）進行同源性搜索，獲得相近的相關菌株的16S rRNA序列，對各菌株的分類地位進行分析，并將篩選獲得的16S rRNA基因序列提交至GenBank數據庫，獲得序列登錄號。

1.2.3 菌株產表面活性劑能力測定 將活化后的菌株接種到含有1%石油的無機鹽培養基中，28℃，150 r/min振蕩培養48 h后，將培養液于4℃，10 000 r/min離心15 min，取上清。同時，在干凈的培養皿中加入20 mL蒸餾水，滴加100 μL預熱至50℃的石油，靜置，待水面形成均勻油膜后，取100 μL發酵上清液加于油膜中心，中心油膜被擠向四周形成排油圈，形成穩定的排油圈后測定其直徑，每處理3次重復［14］。

1.2.4 菌株對原油降解率的測定 根據菌株形成排油圈的大小，挑選具備較強的產表面活性劑能力的菌株，制成OD600為1.20±0.05的菌懸液，取500 μL接種至含3%原油的無機鹽培養液中，振蕩培養14 d后采用重量法分別測定原油殘余含量并計算降解率。以不接菌的含原油無機鹽培養液為對照，每個菌株做3次重復。

降解率/%=（對照原油質量-處理原油質量）/對照原油質量×100%

1.2.5 高效石油降解菌對污染土壤的修復作用 采用濾紙片法檢測菌株之間的拮抗性。選取互不拮抗且降解能力最強的2株菌，調整菌株OD600=1.00±0.05，將兩個菌株按照體積比1∶1混合形成復合菌群。分別將兩個單一菌及復合菌按照2%的總接菌量接種于LB培養液中，28℃，150 r/min，恒溫培養一定時間后棄去上清液，菌體洗滌2次后加無菌水制成OD600為1.40±0.05的液體菌劑。將原油污染土壤自然風干后，碾碎混勻過2 mm篩，分裝于規格為40 cm×27 cm×15 cm的塑料花盆中，每盆加4.0 kg。在第0天和第30天在將制好的單一菌劑和復合菌劑分別按10%的接種量接種于裝有石油污染土壤的塑料盆中，攪拌均勻，以不加菌劑的土壤為對照。實驗期間，各組樣品土壤含水率維持在15%-20%，每3 d翻耕一次，增加土壤透氣性。覆土90 d后測定污染土壤中總石油含量。

2 結果

2.1 石油降解菌的分離及其多樣性

2.1.1 菌株的生理生化特征 通過對菌株進行分離和富集培養，共分離出石油降解菌25株，其中5株菌分離自含5%石油的富集培養基。在富集培養過程中，上層的原油被降解為大小不一的乳化顆粒，表明土壤中的石油降解菌能夠利用高濃度的石油為碳源和能源進行生長和繁殖，產生的代謝物導致原油成分被破壞，疏水性降低，從而形成乳化顆粒。分離的菌株在LB平板上大多形成乳白色或淺黃色、濕潤或干燥的菌落。生理生化特征測定結果表明，18個菌株為革蘭氏陽性菌，革蘭氏陰性菌有7株，多數菌株硝酸鹽還原和H2O2酶反應陽性，V.P反應陰性，各菌株的特征，如表1所示。

表1 菌落形態和菌株的生理生化特征Table 1 Colony morphology and physiological and biochemical characteristics of strains

2.1.2 菌株的16S rRNA基因序列分析 通過對獲得的石油降解菌的16S rRNA基因進行擴增，獲得大小約為1 500 bp左右的目的片段，部分菌株的PCR電泳圖，如圖1所示。

圖1 部分菌株16S rRNA基因擴增產物電泳圖Fig. 1 16S rRNA gene electrophoresis diagram of partial strains

將所測序列與eZtaxon網站已有的模式菌株進行同源分析，結果表明分離的菌株分別隸屬于12個屬，多樣性非常豐富。結合菌株生理生化特征進行鑒定，其中隸屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的菌株分別有6株，為優勢菌屬；3株為紅球菌屬（Rhodococcus）；2株為芽孢桿菌屬（Bacillus）；其余8個屬各有1株，包括微桿菌屬（Microbacterium）和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）等常見的石油降解菌。將菌株的16S rRNA基因序列提交至GenBank數據庫，獲得序列登錄號（表2）。

表2 菌株16S rDNA序列比對結果及登錄號Table 2 Strain 16S rDNA sequence comparison results and registration numbers

2.2 高效石油降解菌的篩選

表面活性劑有降低表面張力的作用，可使均勻鋪展的石油膜發生外排作用。通過對污染土壤中的石油降解菌進行富集培養，有降解作用的菌株可以利用石油作為唯一碳源和能源進行生長繁殖，產生的代謝產物導致原油成分被破壞，疏水性降低，使得培養液上層油膜分散，在液面聚集成小油粒。通過對25株菌進行排油圈的測定發現，各菌株產表面活性劑能力差別較大，其中紅球菌屬3株菌S16、S18 和S25產生的排油圈顯著大于其他菌株（圖2），說明這些菌株具有較高的產表面活性劑能力。

圖2 石油降解菌產生物表面活性劑能力Fig. 2 Ability of petroleum degrading bacteria to produce surfactant

根據排油圈大小，選擇8株具備較強的產表面活性劑能力的菌株，以不加菌劑為對照，通過重量法測定菌株對原油的降解能力。結果表明，菌株對原油的降解能力各不相同，降解率在25.0%-50.0%之間，隸屬于紅球菌屬的菌株S25和S18降解能力最強，降解率分別為50%和47.2%；Cytobacillus屬菌株S19和鏈霉菌屬菌株S10次之，降解率均為44.4%；假單胞屬菌株S23降解率僅為S25菌株的一半，降解能力最小（圖3）。

圖3 石油降解菌對石油的降解率Fig. 3 Degradation rate of petroleumby degrading bacteria isolates

2.3 單一和復合菌劑對石油污染土壤的修復效果

通過菌株的拮抗性檢測，篩選菌株S25和S18用于復合菌群構建并進行土壤修復實驗。分別將兩個菌株制備成單一菌劑和復合菌劑施入石油污染土壤中，覆土90 d后通過重量法測定污染土壤中總石油含量。結果表明，分離出的菌株對石油污染土壤有較強的的修復能力，其中，單一菌劑S18對油污土壤中石油的降解率為62.7%，菌株S25的降解率為75.4%，而二者制備的復合菌劑的降解效果要顯著強于單一菌劑，降解率達到84.7%（圖4）。

圖4 高效石油降解菌對污染土壤石油的降解率Fig. 4 Degradation rate of petroleum in polluted soil by high efficiency petroleum degrading bacteria

3 討論

石油降解菌廣泛存在于在石油污染土壤中。目前已報道的能夠降解石油的微生物分布于100 多個屬200 多種。常見的有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬、不動桿菌屬、產堿桿菌屬和節桿菌屬等。楊智等［8］對玉門油田污染土壤石油降解菌多樣性的研究表明，分離的石油降解菌分屬于21屬，假單胞菌屬、紅球菌屬、微球菌屬（Micrococcus）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、無色桿菌屬（Achromobacter）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為優勢菌屬；趙碩偉等［15］從勝利油田污染土壤中分離篩選出的3 株高效石油降解菌株均屬于紅球菌屬；吳濤等［16］從黃河三角洲石油污染土壤中分離得到 1 株高效耐鹽石油烴降解菌 BM38，確定為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）。本研究從寧夏鹽池縣油田開發區原油污染土壤中篩選出25株石油降解菌，通過形態特征、生理生化特征和 16S rRNA基因序列分析，表明這些石油降解菌隸屬于12屬，常見的有鏈霉菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、紅球菌屬和類諾卡氏菌屬等。此外，還包括微桿菌屬、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、短芽孢桿菌屬Brevibacillus等石油降解菌，這與眾多研究中報道石油降解菌較一致［17-18］。而白蟻菌屬Isoptericola、博德特氏菌屬Bordetella和纖維菌屬Cellulosimicrobium等作為石油降解菌的研究目前鮮有報道。白蟻菌屬目前已知有4種，部分菌株有嗜熱嗜鹽特性，能降解甲殼素、產生水解酶促進紙漿漂白，或具備解磷、分泌吲哚乙酸、產ACC脫氨酶等促生能力；博德特氏菌屬菌株多為人類病原菌，目前也有報道從石油污染土壤中分離出博德特氏菌，對汽油或潤滑油具有優良的降解性能［7，19］；纖維菌屬主要局限于土壤、海洋等中溫環境，目前主要從熱泉、南極積雪和海洋沉積物中分離出，其降解石油的作用還有待于進一步研究。

生物表面活性劑是由微生物產生的一類集親水基和疏水基于一體的兩親化合物，由于微生物主要在油-水界面進行石油的降解活動，生物表面活性劑能夠降低石油表面張力，增加石油在水相中的分散程度，以此增大石油降解菌和石油的接觸面積，極大的促進了微生物對石油的吸收降解［20-21］。因此根據產表面活性劑能力強弱篩選石油降解菌是一重要的指標。目前多用降解菌的排油圈直徑來表征微生物產生物表面活性劑能力。排油圈直徑越大，菌株產生表面活性劑的量越多，對石油的降解作用越強。本研究分離出的25株菌產生了不同大小的排油圈，表明這些菌株都具有產表面活性劑的能力，其中3株紅球菌的排油圈直徑最大，石油降解率也高于假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等菌株。這與已報道的假單胞菌屬和芽孢桿菌具有較強的產表面活性劑和乳化原油的能力并不一致［20］。此外，對石油降解能力的差異不僅體現在不同屬細菌之間，即使是同屬的菌株，降解能力也有很大差別，如紅球菌屬的S25和鏈霉菌屬的S10降解率顯著高于同屬其他菌株。這主要是由于環境因素、微生物活性和代謝途徑的差異等，使得大多數菌株只能選擇性地降解石油中的某一種或幾種組分。為了提高石油污染土壤的修復效果，我們結合菌株的排油圈、降解率和菌株間的交互作用等，篩選出2株紅球菌構建了復合菌群并進行土壤修復實驗，結果顯示復合菌劑的石油降解率達到了84.7%，顯著高于兩個單一菌劑。復合菌劑的不同菌株對于石油中不同的烴類物質具有不同的降解能力，能夠極大地促進石油的降解。曹文娟等［22］向油污土壤中投加復合菌劑和單一菌劑進行土壤修復70 d，結果表明復合菌劑的降解效率達到75.0%，兩個單一菌劑的降解率分別為53.0%和52.0%。孔令姣等［23］利用兩個單一菌劑和復合菌劑修復石油污染土壤70 d 后，單菌的石油降解率分別為53.8%和62.8%，而復合菌劑則高達72.8%。由于石油類化合物的復雜性，不同的微生物對石油各成分的利用率不同，因此通過構建復合菌群促進石油降解已成為石油污染土壤修復的重要途徑之一。但在構建菌群時，菌株之間的交互作用是首先要考慮的因素。有研究表明，一些混合菌群的石油降解效果明顯低于單菌，因為菌株之間存在著相互抑制作用［24］。王佳楠等［25］的研究認為，親緣關系近的芽孢桿菌屬種間存在著協同促進作用，因此同屬微生物構建的菌群對石油的降解表現出促進效果。Gong等［26］認為屬水平上一致的外源細菌能夠刺激同屬的內源細菌，從而促進微生物強化石油的降解效果。我們對石油污染土壤的修復效果也證實，用同屬于紅球菌屬的菌株構建的復合菌群降解率顯著高于單一菌株，表明二者之間通過協同促進作用，增強了石油污染土壤的修復效果。該菌群能否對野外石油污染場地的修復發揮積極的作用還有待于進一步研究。

4 結論

鹽池油田污染土壤中石油降解菌多樣性豐富，假單胞菌和鏈霉菌是優勢菌群，紅球菌屬菌株降解石油的能力較強，以2株紅球菌制備的復合菌劑對污染土壤的修復效果要顯著強于單一菌劑，具備開發為微生物修復劑的潛能。