糖酵解調控雞體外PGCLC形成的功能研究

張晨 左其生 鄒藝琛 趙娟娟 張亞妮 李碧春

（揚州大學農業科技發展研究院 教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室 揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009）

原始生殖細胞（primordial germ cell，PGC）的形成需要多種因素的參與，從遺傳的角度來說，基因表達、信號傳導、表觀遺傳修飾等都對PGC的形成具有調控作用。不僅如此，Brinster等［1］提出PGC （小鼠）具有特別的能量代謝方式——偏愛丙酮酸氧化而不能氧化葡萄糖。因此代謝變化也可能參與PGC的形成。

相比遺傳和表觀遺傳因素的調控，代謝方式的變化對表型變化的影響更為直接和明顯。研究發現能量代謝方式在不同細胞中并不相同，大多的癌細胞中［2］能量代謝方式主要以糖酵解途徑為主，氧化磷酸化途徑不參與癌癥發生過程；而正常細胞通常以線粒體氧化磷酸化產能，而不依賴糖酵解途徑［3］。在PGC細胞中也同樣表現為氧化磷酸化為主的能量代謝模式［4］；在精原干細胞（spermatogonial stem cell，SSC）中，為了維持其自我更新能力，細胞通常利用糖酵解途徑進行產能［5］。這種現象提示我們能量代謝模式的改變可能影響細胞的命運決定。重編程過程印證了這一猜想，體細胞的氧化磷酸化代謝轉變為iPS的糖酵解依賴代謝模式是多能性獲得的基礎［6］。因此代謝組的重組可能是引起細胞分化的原因。然而代謝途徑的變化在PGC形成中的調控研究尚不明確。

甲萘醌VK3可通過單電子還原反應，產生半醌基團；或通過雙電子還原得到氫醌。通過醌的氧化還原循環可產生活性氧簇等，增加氧化還原反應［7］。研究表明，VK3可作為丙酮酸激酶PKM2的專一性抑制劑，而不抑制PKL和PKM1，有效抑制糖酵解途徑［8］。然而對VK3功能的研究主要集中在對癌癥的抑制效果上［9-10］，在細胞分化中的調控作用還未有研究。相反，研究表明［11-12］DASA58可靶向激活PKM2，PKM2是參與糖酵解過程的糖酵解酶，可催化合成丙酮酸和ATP，因此DASA58被認為是糖酵解途徑的激活劑，在癌癥發生和免疫過程的研究中較為常見，其在細胞分化中的功能還不得而知。

為了研究PGC形成機制，本研究前期建立了BMP4體外誘導模型［13］，BMP4能夠通過BMP4信號促進體外雞胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）向原始生殖細胞樣細胞（primordial germ cell，PGCLC）的分化，而BMP4信號抑制糖酵解途徑關鍵激活劑 GSK的功能［14］，因此推測糖酵解可能參與PGC的形成。本研究對體外誘導過程中糖酵解相關基因的表達進行檢測；在添加糖酵解激活劑和抑制劑后，qRT-PCR檢測了相關基因的表達及類胚體/PGC-like的形成，以期為深入研究代謝系統在PGC形成中的調控機制奠定研究基礎和提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞及主要試劑 新鮮受精蛋來自中國農業科學院家禽研究所試驗禽場如皋黃雞。ESCs由實驗室分離所得。高糖DMEM、Knockout培養基、胎牛血清、雞血清、丙酮酸鈉購自Gibco公司（美國）；β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、bFGF、hSCF購自Sigma（美國）；mLIF 購自millipore（德國）；BMP4購自ProSpec（以色列）、VK3購自Macklin（中國）、DASA58購自MCE（美國）。

青鏈霉素購自（北京）索萊寶科技有限公司；TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑、反轉錄試劑盒、定量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DDX4購自Abcam。

ESC因子培養基：Knockout DMEM+10%胎牛血清+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+1 mmol/L丙酮酸鈉+2 mmol/L的L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1 000 IU/mL LIF+10 ng/mL bFGF+5 ng/mL SCF+1×青鏈霉素+2%雞血清。

BMP4誘導培養基：高糖DMEM+1×非必需氨基酸+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+1×青鏈霉素+1 mmol/L丙酮酸鈉+ 10 ng/mL LIF+40 ng/mL BMP4+50 ng/mL EGF。

1.2 方法

1.2.1 ESC細胞誘導 收集0 d的種蛋，藥匙法獲得雞胚胚盤，ESC因子培養基吹散成細胞懸液，經400目濾布過濾后收集細胞，接種至60 mm培養皿，差速培養12 h，收集上清，接種至24孔板，體外擴增、傳代、備用［15-16］。將傳至第2代的ESCs以2×105個/孔接種于24孔板中，更換培養基為BMP4誘導培養基，接種至24孔板中，培養6 d，每隔2 d添加200 μL培養基。實驗分組為：BMP4組，BMP4+VK3組，BMP4+DASA58組。

1.2.2 細胞形態觀察 在細胞誘導的第6天觀察細胞形態，分別記錄20×10和40×10倍鏡下的細胞形態變化并進行拍照。利用Image J對20×10倍鏡下的類胚體數量進行統計。

1.2.3 RNA提取 將收集的細胞置于1.5 mL無酶管中，加入1 mL Trizol進行裂解，用移液器吹勻細胞，在室溫靜置5 min。加入200 mL氯仿，蓋緊蓋子后，劇烈振蕩15 s，室溫靜置2 min。冷凍離心機中4℃ 12 000×g離心15 min。小心打開管蓋，緩慢吸取400 μL上清，加入等體積異丙醇，輕輕混勻，在室溫靜置10 min。冷凍離心機中4℃ 12 000×g離心10 min，棄去上清。加入1 mL 75%的乙醇，輕輕混勻，此時可見白色RNA沉淀。冷凍離心機中4℃ 7 500×g離心5 min，棄去上清。晾干RNA，加入20 μL無酶水溶解。置于60℃促溶10 min，獲 得RNA。

1.2.4 qRT-PCR 分別收集誘導2 d、4 d和6 d的細胞，Trizol裂解后提取RNA。利用天根反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，參照天根實時熒光定量PCR試劑說明書進行定量檢測目的基因的表達。引物序列參照表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.2.5 流式細胞分析 收集誘導至6 d細胞，PBS清洗后，加入10%FBS的PBS 37℃封閉2 h，PBS清洗3次后，用一抗進行孵育，37℃孵育2 h或4℃過夜。PBS清洗3次后，用對應的二抗進行孵育，37℃孵育2 h。PBS清洗3次后，上機檢測。

1.2.6 數據分析 利用SPSS統計軟件建立數據庫并處理數據，數據組間差異用單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較，試驗數據以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。結果以平均值形式表示。

2 結果

2.1 雞PGC-like細胞形成中糖酵解相關基因低 表達

在體外雞ESC誘導形成PGC-like的不同時間點對糖酵解過程相關基因的表達進行檢測，qRTPCR檢測結果顯示，誘導第6天時，糖酵解相關基因Pgk1的表達顯著降低（P<0.05），Hk1、Pkm2、Ldha、Glut1、Pfkp和Aldoc的表達極顯著降低（P<0.01）（圖1）。以上結果說明在PGC-like形成過程中糖酵解過程被抑制。

圖1 PGC-like形成中糖酵解相關基因的表達Fig. 1 Expression of glycolysis-related genes in the formation of PGC-like

2.2 糖酵解激活劑/抑制劑調控糖酵解過程

為研究糖酵解過程在PGC-like形成中發揮的作用，本研究將糖酵解抑制劑VK3和糖酵解激活劑DASA58加入PGC-like誘導體系中，分別在不同誘導時間點檢測糖酵解相關基因的表達。qRT-PCR檢測結果顯示在誘導第2天時，添加VK3后，糖酵解相關基因Hk1、Pkm2、Glut1、Pfkp、Aldoc表達極顯著降低（P<0.01），而添加DASA58后，Ldha和Pfkp表達顯著升高（P<0.05），Hk1和Pgk1表達極顯著升高（P<0.01）。而在誘導第4天時，添加VK3后，Hk1、Pkm2、Ldha、Glut1、Pfkp、Aldoc和Pgk1表達極顯著降低（P<0.01）。誘導第6天時，添加DASA58后，Glut1、Pfkp和Pgk1表達極顯著升高（P<0.01）（圖2）。以上結果說明糖酵解抑制劑VK3和激活劑DASA58可調控糖酵解過程。

圖2 體外誘導過程中糖酵解抑制劑/激活劑對糖酵解相關基因的影響Fig. 2 Effects of glycolysis inhibitors/activators on glycolysis-related genes during the induction in vitro

2.3 糖酵解途徑抑制類胚體形成

本研究在BMP4誘導體系中添加VK3和DASA58，并在第6天觀察其對類胚體形成的影響。細胞形態學觀察顯示BMP4誘導后，出現帶有囊腔形態的典型類胚體特征細胞，且細胞發生聚團生長的現象；在此基礎上，添加VK3后，帶有囊腔形態的類胚體數量增加并大量聚團（P<0.01）；而添加DASA58后，無典型的類胚體樣細胞形成（圖3）。以上結果說明抑制糖酵解途徑促進類胚體的形成。

圖3 體外誘導過程中糖酵解抑制劑/激活劑對類胚體形成的影響Fig.3 Effect of glycolysis inhibitor/activator on embryoid body formation during the induction in vitro

2.4 糖酵解途徑抑制PGC-like形成

研究表明PGC-like形成經歷類胚體過程，類胚體中能表達PGC標記基因的細胞可稱為PGC-like。本研究前期已證明DDX4能夠作為標記PGC的特異蛋白進行流式分析。因此，在BMP4誘導過程中添加VK3和DASA58后第6天收集細胞，流式分析檢測PGC-like的陽性比例，結果顯示當添加VK3后，PGC-like的陽性數量顯著升高（P<0.05），而添加DASA58后，陽性細胞數量顯著降低（P<0.05）（圖4）。以上結果說明糖酵解途徑抑制體外PGC-like 的形成。

圖4 體外誘導過程中糖酵解抑制劑/激活劑對PGC-like形成的影響Fig. 4 Effect of glycolysis inhibitor/activator on PGC-like formation during the induction in vitro

3 討論

糖酵解關鍵酶的表達影響糖酵解效率參與生物學過程，常見的糖酵解關鍵酶包括HK1/2、5-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、6-磷酸果糖-1/2-激酶（PFK1/2）、GLUT-1和LDH-A等，這些關鍵酶的上調往往造成較高的糖酵解率，在癌癥和重編程過程中較為常見［17-19］。糖酵解關鍵酶（如Pglym78/pgam2）功能的喪失對成肌細胞融合能力（果蠅和斑馬魚胚胎）也會有所影響。本研究發現與心臟發育過程中糖酵解系統的正面調控作用不同［20］，在體外雞PGC-like形成中糖酵解基因的mRNA表達普遍下降，可能由于在干細胞中糖酵解系統具有不同的表達模式。結合Zhou等［21］發現的ES細胞的能量生產具有二價特征，會根據需要從糖酵解轉換為線粒體呼吸。本研究推測體外ESC向PGC-like誘導分化過程中，以糖酵解為主要能量代謝途徑的模式逐漸瓦解，細胞轉化為線粒體呼吸。這一推測還需要進一步對線粒體呼吸相關指標進行檢測。

研究報道，甲萘醌VK3通過激活氧化還原反應抑制糖酵解過程［22-31］。本研究發現添加VK3后，有效抑制糖酵解相關基因的表達，暗示其可能對氧化磷酸化過程起激活作用。而DASA58作為PKM2的激活劑，在本研究中未出現顯著激活PKM2的結果，可能是檢測時間點過晚或是40 μmol/L的工作濃度難以滿足激活PKM2的需要。同時，本研究還觀察到添加DASA58后，Glut1、Pfkp、Pgk1的表達有所上升，說明DASA58的加入確實影響糖酵解系統的穩態，對糖酵解途徑具有一定的激活作用。

能量代謝確實影響細胞的命運決定。ESC細胞往往以糖酵解途徑為主要代謝方式，因此培養液中高濃度的葡萄糖有利于ESC的增殖，而葡萄糖濃度的變化則會影響ESC的分化［32-34］。研究表明AMP激活的蛋白激酶（AMPK）激活劑AICAR能啟動ATP產生的分解代謝途徑，抑制小鼠類胚體的形成［35］。本研究發現體外雞PGC-like形成中糖酵解相關基因表達降低；抑制糖酵解過程促進類胚體形成，激活糖酵解后類胚體形成減少。類胚體是PGClike形成的必經階段，糖酵解途徑對類胚體形成的調控暗示其對PGC-like的形成也有相似的調控模式。本研究通過流式分析也證明了這一點。這種能量代謝的調控模式與小鼠體內PGC形成過程氧化磷酸化升高、糖酵解降低的模式不謀而合。說明糖酵解過程不是體內外PGC形成所必需的，相反，氧化磷酸化可能在體內外PGC形成中起主導作用。然而PGC形成過程涉及多種調控因素，其中能量代謝的調控機制仍需進行深入挖掘。

4 結論

本研究發現ESC向PGC-like誘導過程抑制了糖酵解相關基因的表達。在添加VK3后糖酵解基因表達降低，促進類胚體/PGC-like的形成；而添加DASA58后，Glut1、Pfkp、Pgk1的表達升高，抑制類胚體/PGC-like的形成。本研究可為后續研究體內外PGC形成中能量代謝調控模式提供參考和理論。