植物硝態氮吸收和轉運的調控研究進展

劉海光 羅振 董合忠

（1. 山東師范大學生命科學學院，濟南 250014；2. 山東棉花研究中心，濟南 250100）

氮素是植物生長發育必不可少的營養元素，維持著植物體內正常物質循環和能量代謝［1］。在農業生產中，合理控制氮肥用量是作物獲得高產的重要措施。氮肥供應不足，不能發揮品種和灌溉等其他農藝措施的增產效果。因此，近幾十年來，增施氮肥已成為我國追求作物高產的重要手段。自1961年以來，氮肥施用量增加了8倍多，2017年我國的氮肥用量為2.311×107t［2-3］。氮肥施用量持續增加，但作物產量并未成比例增加，盲目大量的增施氮肥導致植物氮素利用效率（nitrogen use efficiency，NUE）大幅下降［4］。氮肥過量施用，不僅增加了能源損耗，提高了農作物的生產成本，給農業生產可持續性造成了巨大的阻礙，而且使土壤質量下降、水體富營養化和溫室氣體排放等一系列環境污染問題也日益突出［5］。

植物氮素利用主要包括吸收和轉運兩個過程，要提高作物氮素利用效率，就必須深入了解氮素吸收和轉運關鍵組分的功能和調控機制［6］。近年來，隨著分子生物技術的不斷發展，關于植物氮素利用相關酶和基因的功能與調控機制得到深入揭示。本文綜述了近年來國內外關于植物氮素吸收和轉運生理過程和分子調控機制等方面的最新研究成果，并對今后的研究進行了展望，以期為科學施用氮肥和提高氮肥利用效率提供依據和指導。

1 植物氮素吸收機制

植物可以吸收無機氮，也可以利用一些含氮的有機物，相較于有機氮，無機氮則更容易被植物吸收。土壤中的無機氮包括NO3-和NH4+，對于大部分植物尤其是旱生植物來說，NO3-是主要氮源［7］。土壤中的NO3-濃度波動很大，為了適應土壤中NO3-的濃度變化，植物進化出兩種NO3-吸收系統，分別是高親和力轉運系統（high-affinity transporter system，HATS）和低親和力轉運系統（low-affinity transporter system，LATS）［8］。兩個轉運系統吸收硝態氮都是主動耗能的過程，通過質子梯度提供能量，相互依存，協同合作使植物能夠有效吸收土壤中的NO3-［9］。

植物從土壤獲取NO3-主要是由硝態氮轉運蛋白（nitrate transporter，NRTs）介導的，包括2個NRT1轉運蛋白（NRT1.1和NRT1.2）和4個NRT2（NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4和NRT2.5）轉運蛋白（圖1）。在擬南芥中，AtNRT1.1是一種雙親和NO3-轉運體，這取決于Thr101位點殘基的磷酸化狀態，當介質中NO3

圖1 根中硝態氮吸收運動模式圖（改自文獻［5］）Fig. 1 Model diagram of NO3- uptake and transport in root (Modified from reference［ 5］)

-含量較低時，AtNRT1.1的Thr101位點殘基磷酸化，使其轉變為高親和轉運體，參與低濃度硝態氮的吸收；當介質中硝態氮濃度較高時，AtNRT1.1去磷酸化，轉變為低親和轉運體，參與高濃度狀態下的NO3-吸收［10］。這種磷酸化由蛋白激酶CIPK23調節［11］。雙親和性并非NRT1.1所獨有，鉀轉運蛋白KUP和硝酸鹽轉運蛋白MtNRT1.3也顯示出雙親和轉運蛋白的活性［12］。NRT1.1在根、幼葉以及花蕾中表達，除了吸收土壤中的NO3-，還可以作為NO3-的信號感受器參與調控植物的側根發育、基因表達和種子萌發等［13］，這說明NRT1.1在植物生長發育過程的調控中具有多效性。在谷類作物中已鑒定出NRT1.1的同源基因。例如，小麥中的同源基因TaNPF6.1、TaNPF6.2、TaNPF6.3和TaNPF6.4以及水稻中的OsNPF6.3、OsNPF6.5（OsNRT1.1b）和OsNPF6.4，由于作物種類的不同，它們都具有各自獨特的表達模式［14-16］。

除了NRT1.1，NRT1.2編碼的蛋白質也在低親和性的NO3-轉運系統中發揮作用［8，17］。相關研究結果表明，AtNRT1.2不僅可以在外界NO3-濃度較高的情況下吸收NO3-，還可以轉運脫落酸（abscisicacid，ABA）［18］。在擬南芥中AtNRT1.2表達不受NO3-的誘導，呈現組成型表達模式［19］。而在煙草（Nicotiana tabacum）分離和鑒定得到的NpNRT1.2表達嚴格依賴高濃度NO3-［20］。從甘藍型油菜（Spinacia oleracea）中克隆到了擬南芥低親和性NO3-轉運蛋白的同源基因BnNRT1.2，受NO3-誘導表達，并且BnNRT1.2不僅可轉運NO3-，也可以轉運氨基酸（L-組氨酸）和肽［21］。這些研究表明，同一個基因由于物種不同可能衍生不同的功能。在NRT2家族中NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4和NRT2.5參與低濃度硝態氮的吸收。在擬南芥中AtNRT2.1在根系NO3-吸收中起主導作用，Cerezo等［22］在atnrt2.1的突變體中發現HATs的活性降低了63%-75%。另外，OsNRT2.1在水稻中的過表達只是略微促進了水稻幼苗的生長，但并沒有影響NO3-的吸收，這可能是由于缺乏與高親和力NO3-運輸的重要輔助因子OsNAR2.1的共同調節［23］。進一步研究發現，在OSNAR2.1基因的NO3-誘導啟動子的驅動下，OsNRT2.1轉基因植株的生物量顯著增加，產量提高了38%，農業氮素利用效率提高到野生型植株的128%［24］。這些研究表明NRT2.1在低濃度NO3-的有效吸收和生物量增加中的重要作用。而AtNRT2.2發揮的作用較小，是對AtNRT2.1功能的補充；反向遺傳學的研究表明，只有在NRT2.1缺失的情況下，NRT2.2才顯著性表達［22］。AtNRT2.4也在根中表達，但其根系吸收NO3-的能力較弱，主要參與NO3-由韌皮部向葉片的運輸，其親和性比AtNRT2.1和AtNRT2.2更高［25］。AtNRT2.5主要位于根表皮和皮層，并且其轉錄受到N饑餓的強烈誘導，為植物有效利用氮素、正常生長提供保障［26］。

2 植物氮素轉運機制

氮素供應充足時，植物的氮素利用效率主要取決于氮素吸收效率；而在氮素缺乏的條件下，植物的氮素利用效率則取決于體內氮素的運轉效率［27］。有時作物產量的提高并不是因為提高了對NO3-的吸收能力，而是由于氮素高效轉運提高了體內氮素的利用效率。研究發現，在作物的籽粒中，50%-90%的氮來自于營養器官氮素的轉運再利用，開花后植物體內貯存氮的轉運是生殖器官獲得氮素的重要途徑，甚至比重新吸收的氮對籽粒的貢獻更大［28-29］。因此，研究植物氮素轉運機制對于提高植物氮素利用效率同樣具有現實意義。

植物從土壤中吸收的NO3-，一部分會被儲存在液泡中；一部分被還原成NH4+并進一步同化形成氨基酸合成蛋白質參與根系氮代謝［30］。未被利用的NO3-和氨基酸等有機態氮則進入木質部導管在蒸騰拉力的驅動下向地上部運輸［31］，在地上部的莖、葉以及其他生殖生長器官中被還原，經同化反應形成谷氨酰胺和谷氨酸參與體內氮代謝［32］。

由根向地上部分轉運是調節NO3-在植物體內分配的關鍵步驟，NO3-在地上、地下部分的分配比例分別由向上運輸的木質部介導和向下運輸的韌皮部介導［32］（圖2）。為了將根系吸收的NO3-轉移到植物的地上部分，它必須裝載到根部的木質部導管中。NRT1.5主要參與了這一步驟［33］，NRT1.5在根部靠近原生木質部周圍的中柱細胞中表達，是一種低親和力的雙向（流入-流出）硝酸鹽轉運體，負責將NO3-運出中柱鞘細胞，裝載到木質部，轉運到地上部分［34］。在nrt1.5突變體中，根部向地上部轉運的NO3-相較于野生型減少，同時nrt1.5木質部傷流液NO3-含量也低于野生型植株［33］。在nrt1.5突變體中發現，地上部分K+含量相對缺乏，經研究表明NRT1.5是連接NO3-和K+信號通路的重要組成部分［34］。NRT1.8是已知的與NRT1.5一致性最高的蛋白，其氨基酸序列一致性高達64%［35］，但是它卻表現出與NRT1.5完全相反的作用。NRT1.8主要在根的木質部薄壁細胞中表達，通過卸載木質部中的NO3-來影響NO3-從根到地上部分的運輸，nrt1.8突變體主要表現為木質部汁液中NO3-含量的增加和根到地上部NO3-轉運的增加，這表明nrt1.8在將NO3-從木質部汁液中移回根細胞的過程中發揮了作用［36］。而對于韌皮部介導NO3-向下運輸，目前只鑒定出了負責根部韌皮部裝載的基因NRT1.9，負責韌皮部卸載的基因尚未找到［37-38］。在nrt1.9突變體中，根韌皮部分泌物中硝酸鹽含量降低，硝酸鹽向下運輸減少，表現出促進根-冠運輸和植株生長的作用［38］。這表明NRT1.8和NRT1.9都是從根到莖NO3-運輸的負調控因子，但機制不同。迄今為止，對NRT基因與作物NO3-長距離運輸關系的研究主要集中于小麥、水稻和油菜［39］。其中，對于小麥，只研究了NRT1.5和NRT1.8基因對氮素脅迫的響應［40］；對于水稻，已分析了過量表達的NRT1.5的水稻品系的氮素生理特性［41］；對于油菜，分析了NRT1.5、NRT1.8和NRT1.9對NO3-缺乏的響應，并構建了一個共表達網絡，以尋找參與NO3-從油菜幼苗根到地上部運輸的關鍵基因［42-43］。根據現有證據，基本可以確定NRT1.5、NRT1.8和NRT1.9調控NO3-在作物中的運輸和分配。

圖2 NO3-在植物體內部運輸簡易模式圖（改自文獻［32］）Fig. 2 Simplified model diagram of NO3- transportation inside the plant (Modified from reference［ 32］)

NO3-被運輸到葉片后，植物根據葉的發育階段、氮需求和硝態氮儲存能力決定硝態氮的同化或儲存。不同組織間硝態氮的協調分配是高等植物高效利用硝態氮的關鍵［44］。在擬南芥中NRT1.4介導NO3-在葉柄中的儲存，是雙向轉運蛋白，對硝態氮在葉片中的分配中起重要作用，nrt1.4突變體中葉柄處NO3-積累少而葉片積累多，導致葉片比野生型的葉片寬，這表明葉片中NO3-的分布影響了葉片的展開［45］。隨著植物生長發育或者在缺氮的條件下，老葉片中的NO3-不斷向新葉中轉移，NRT1.7主要介導了這一過程［46］。在成熟葉片中，NRT1.7在葉脈的韌皮部中表達，負責裝載老葉中的NO3-，運輸至新葉，供新葉重新利用［37］。nrt1.7突變體在老葉中保留了大量的NO3-，在老葉的韌皮部汁液中含有更少的NO3-，并減少了NO3-向嫩葉的運輸。另外，NRT1.11和NRT1.12這兩個基因在展開的葉片中表達較高，主要功能是促進NO3-從成熟和較大的展開葉片到最幼嫩組織的再分配，而nrt1.11、nret1.12雙突變體在高NO3-條件下表現出生長缺陷［47］。如上所述，NRT1.4負責NO3-在葉片中的分配，NRT1.7負責裝載老葉中儲存的NO3-，NRT1.11和NRT1.12負責在較大的展開葉中重新分配木質部攜帶的NO3-。與野生型相比，nrt1.4葉片更寬，nrt1.7功能的喪失會降低植物在N饑餓條件下的生長，而nrt1.11、nrt1.12雙突變體在高NO3-條件下表現出生長缺陷。這表明植物為適應不同的硝酸鹽條件而采取不同的NO3-分配策略，以維持生長發育的需求。

在對植物NUE的研究中，液泡NO3-起著不容忽視的作用［48］。NRT2.7和CLCa是兩個能將NO3-轉入液泡的轉運蛋白。已經有研究證明NRT2.7在種子中具有重要的功能，在種子成熟晚期該基因高度表達，起到種子中液泡NO3-累積的作用［49］。而AtCLCa是第一個被發現的NO3-/2H+逆向轉運蛋白，也是唯一被證實參與液泡NO3-累積的氯離子通道（CLC）蛋白，其突變體液泡中的NO3-累積量減少50%左右，并且NO3-含量從根到冠都降低，說明CLCa在液泡中累積NO3-起著非常重要的作用［50］。在玉米ZmCLCa基因功能的驗證研究中，證明了ZmCLCa可以提高植物對氮素的吸收，有利于玉米在低氮環境下的吸收，但是對于ZmCLCa在積累硝酸鹽過程中的機制還需要進一步的研究［51］。CLC家族的另一個成員CLCb也能轉運NO3-，但尚不確定它是否參與NO3-進出液泡［52］。另外，AtCLCc負責NO3-和氯的動態平衡，可調節氯的運輸，對氣孔運動和耐鹽性至關重要［53］。與NRT家族相比，CLC家族蛋白在調控液泡NO3-累積方面起著更為重要的作用，可以顯著影響植株NO3-的利用。

3 植物氮素轉運蛋白的表達調控

植物氮素的吸收和轉運主要是由氮素轉運蛋白介導的，為了保障氮素能夠被植物有效的吸收和利用，需要精準調控氮素轉運蛋白活性。國內外學者對植物氮素轉運蛋白的表達調控已經做了大量的研究工作，植物氮素轉運蛋白的調控可分為轉錄水平上的調控和蛋白水平上的調控。

研究發現，NRT基因的表達受到NO3-水平的調控。Okamoto等［54］用1 mmol/L NO3-溶液處理擬南芥，利用半定量PCR的方法研究NRT1.1-1.4和NRT2.1-2.7的表達狀況，根據它們對NO3-供應的響應差異把它們劃分為NO3-誘導、NO3-抑制和NO3-組成型基因，AtNRT1.1、AtNRT2.1和AtNRT2.2被NO3-強烈誘導，表達量升高，AtNRT2.4受NO3-誘導程度較小，它們均屬于NO3-誘導型基因；AtNRT2.5被NO3-強烈抑制，表達量下降，屬于NO3-抑制型基因；而AtNRT1.2、AtNRT1.4、AtNRT2.3、AtNRT2.6和AtNRT2.7不受NO3-影響，屬于表達組成型基因。誘導型（抑制性）基因一般在接觸NO3-很短的時間內表達增強（下降），數小時至10余小時后達到高峰（低谷），此后表達量開始降低（升高），說明該基因表達受到反饋調控，NO3-對NRT表達的調控具有時間動態變化特點［55］。另外，不同物種的NRT對NO3-的響應與擬南芥不完全一致，如在擬南芥中AtNRT1.1為NO3-誘導型基因，而在黃瓜中CsNRT1.1屬于NO3-組成型基因［56］。除了NO3-，其他的氮素營養，如NH4+、谷氨酸和谷氨酰胺均會抑制NRT基因的表達。

NRT基因的表達還受激素等信號分子調控，研究發現，ACC處理油菜可以促進根系生長和根毛增多，但卻降低BnNRT2.1表達［57］。在擬南芥中，對成熟根系施加IAA處理，會引起側根的發育，在處理30 min后，全株NRT1.1 mRNA含量顯著增加，而對NRT2.1的轉錄有明顯抑制作用［58］。在低氮條件下，ABA還可以通過調控NRT2/NAR基因表達量來促進小麥NO3-的吸收［59］。Ruffel等［60］研究發現根區NO3-差異分布下，高N側根系生長加快、NO3-吸收顯著增強。進一步研究發現，高N側根系能夠合成反式玉米素（tZ）；然后，反式玉米素作為 “根-冠”信號分子運輸到地上部，誘導地上部葉片中谷氨酰胺合成；谷氨酰胺作為“冠-根”間信號分子運輸到根系，調控根系中硝態氮吸收［61］。研究發現根區NO3-不均勻分布下“根-冠-根”“CEPCEPR-CEPD”信號通路在促進高氮側根系硝態氮吸收過程中具有重要作用［62-63］。

晝夜節律也可影響NRT基因表達，白天時，植物維持對NO3-較高的吸收速率，進入夜間后NO3-的吸收速率逐漸降至最低，AtNRT1.1和AtNRT2.1基因的表達量也在白天達到最高，而在夜間降至最低［64］。進一步研究發現在夜晚的條件下供應蔗糖，AtNRT1.1和AtNRT2.1表達量上調，說明NRT基因受晝夜節律調節的關鍵因素是光合產物的量，Lejay等［65］的研究發現，6-磷酸-葡萄糖作為信號物質可調節AtNRT1.1和AtNRT2.1的表達。

磷酸化是NRT在蛋白水平上最主要的調控方式，而NRT1.1則是最早發現可以被磷酸化的NRT。最近的結構分析表明，NRT1.1在Thr101的磷酸化控制著NRT1.1的結構靈活性。當NO3-濃度高時，NRT1.1去磷酸化，轉運蛋白采用結構柔性較低的二聚體構象，起到低親和力轉運蛋白的作用；當NO3-濃度下降時，NRT1.1在Thr101殘基上磷酸化，從而使NRT1.1二聚體解耦連，磷酸化的轉運蛋白獲得了更高的結構靈活性和攝取活性，并作為一種高親和的轉運蛋白發揮作用［66-67］。而在NRT2.1，發現了Ser11、Ser28和Thr521三個磷酸化位點［68-69］。Ser28已被證明在重新補充高濃度（3 mmol/L或10 mmol/L）NO3-后5 min內迅速去磷酸化，但在低濃度（0.3 mmol/L）NO3-下仍保持磷酸化［68］，這表明高氮條件下，NRT2.1翻譯后修飾對調節根系NO3-吸收具有重要作用。

4 提高NUE的主要途徑

提高氮肥利用率，減少氮肥損失及其對環境的壓力，既是一個全球性課題，更是我國農業可持續發展面臨的嚴峻挑戰［70］。提高氮素利用率的基本原則是，提高植物對氮肥的吸收能力，盡量避免土壤中氮的過量積累、減少氮素損失；提高氮素向生殖器官轉運，提高經濟系數［71］。提高氮素利用率的技術途徑有很多，歸納起來主要有農藝途徑、工藝途徑和生物途徑［72］。

農藝途徑主要是根據作物的生長發育特點和需肥規律優化田間管理，改進傳統的施肥技術，改善土壤有效氮素含量，以達到提高氮素利用率的目的。具體措施包括合理控制氮肥用量、氮肥深施、氮肥后移、少量多次施肥、合理灌溉、水肥一體化、根區施肥、平衡施肥等［73］。根區定位施肥技術，可以大幅提高養分利用效率，減少面源污染［74］；西北內陸棉區膜下滴灌條件下采用的水肥一體化和水肥協同技術能有效提高旱區棉花的氮肥利用率［75］；根區鹽分差異分布條件下向低鹽根區施肥有利于鹽脅迫條件下氮素的吸收利用［76］。

工藝途徑則是通過改進傳統的氮肥制造工藝，研制新型的高效氮肥，使其按照植物的需氮規律提供氮素營養，降低氮肥淋溶、揮發損失，提高氮肥利用效率。如控釋肥就具有養分釋放與植物吸收同步的特點，一次性基施可以滿足全生育期的需要［77］。在滴灌施肥條件下，新型水溶氮肥則更利于實現水肥耦合，提高氮肥吸收利用，降低氮肥的淋溶 損失［78］。

生物途徑是通過植物基因型在氮素吸收利用方面的差異，挖掘植物本身的遺傳因素，篩選和培育氮高效品種，以提高氮素利用率［79］，是提高氮利用效率的最理想方式，不僅經濟有效，而且有利于減少污染和對生態環境的破壞。傳統技術和手段培育氮素高效植物品種的效率很低、難度很大。但是，隨著轉基因技術，特別是基因編輯等分子生物學技術的發展和應用，培育氮高效型植物品種已成為可能，目前已經報道利用Cas9等基因組編輯技術，可以刪除小麥中消耗氮素的過量儲存蛋白基因，從而提高氮素利用效率［80］，展現出廣闊的利用前景。

5 展望

研究植物本身的氮素吸收和轉運的機理機制是提高植物NUE的關鍵依據。隨著分子生物學研究的不斷深入，關于植物氮素吸收、轉運和利用氮素的生理和分子機制的研究已經取得了重要的進展，如在一些植物中已克隆到多個氮素轉運蛋白基因，并對其結構、功能和基因表達調控等方面進行了初步的研究，為有效調控氮素吸收和利用奠定了堅實的基礎。但是，氮素轉運基因家族成員眾多，使得基因篩選和功能鑒定還需要大量的工作；加之氮素的吸收和轉運以及調控是一個錯綜復雜的生物學過程，僅調控過程就涉及多種激素通路和信號分子通路的交互作用，因此還需要持續深入研究。

此外，迄今氮素相關基因的克隆和研究多集中在模式生物擬南芥上，對大宗作物氮素轉運蛋白基因的鑒定、功能分析以及氮素吸收的分子生物學研究還不多；同時由于缺乏氮高效的作物種質資源，導致關于氮素高效作物品種應用于農業生產實踐的報道極為罕見，這說明深入揭示氮素利用的分子機制及調控機制對提高氮素利用效率的迫切性和重要性。因此，今后應該加強作物氮素吸收利用相關基因的研究，利用轉基因和基因編輯等現代生物技術技術手段與常規技術結合，培育出更多真正意義上的氮素高效利用新品種，在減少環境污染氮肥用量的同時確保不減產甚至增產。

在農藝栽培方面，目前采用的栽培管理方式較為單一，采取的栽培管理技術主要目的是圍繞高產，以節肥為目標的研究尚不多見，存在的問題是采用的栽培管理方式較為單一。因此，要深入研究不同地區、不同時期、不同種植方式以及不同生境下作物氮素吸收轉運基因表達情況和調控模式的變化，以此改良改進和創新現有的栽培管理措施，為作物提供更優的生長條件，為作物氮肥的高效利用提供技術支撐，實現節肥高產相協同。

相信隨著分子生物學、遺傳學、農學及交叉學科研究的深入，將進一步揭示植物氮素吸收、轉運及調控的機制，并開發更多、更有效的大宗作物氮素高效利用技術，為其在農業和生物工程的應用奠定堅實的基礎，為節肥增產、節本增效服務。