植物半胱氨酸蛋白酶在植物生長發育中的功能研究

莫黎杰 劉夏瞳 李慧，2 陸海，2

（1. 北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2. 北京林業大學林木育種國家工程實驗室，北京 100083）

植物蛋白酶廣泛參與蛋白質的成熟、重建和降解，在植物生長發育過程中發揮著重要作用，調節著細胞增殖、分化、衰老和程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）等多個生物學過程［1-2］。蛋白酶功能異常會導致植物正常的生長發育進程受到影響。

蛋白酶通過水解肽鍵將底物裂解為小分子肽段。根據其催化位點分為4大類：半胱氨酸蛋白酶，絲氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶［3］。MEROPS蛋白酶數據庫（http：//merops.sanger.ac.uk）中根據進化關系將蛋白酶分為253個家族和61個亞家族［4］。擬南芥植物基因組編碼約500-800蛋白酶，分布在60多個家族，30個不同亞家族中［2］，其中半胱氨酸蛋白酶約有140種，可以將其分為5個家族的15個亞家族［5］，本文將重點對半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白酶進行綜述。植物半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CPs）分為木瓜蛋白酶家族（C1）、液泡加工酶（vacuolar processing enzyme，VPE）、天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶家族（C14）、鈣依賴半胱氨酸蛋白酶家族（C2）和其他半胱氨酸蛋白酶家族［3］。木瓜蛋白酶C1家族可分為C1A和C1B亞家族［6］，其中C1A半胱氨酸蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶中數量最多的蛋白之一［7］。C1A亞家族的催化位點由高度保守的催化三聯體組成：Cys 25，His 159和Asn 175，此結構域是區分該亞家族的重要分類標志［8］。根據功能和結構特征，可進一步將C1A半胱氨酸蛋白酶分為9個亞類，分別是：RD21Alike、RD19A-like、CEP1-like、XCP2-like、XBCP3-like、THI1-like、SAG12-like、AALP-like及CTB3-like［9］。

已有研究報道，植物半胱氨酸蛋白酶在調控植物生長發育中發揮著重要的功能。它們參與種子的貯藏蛋白的降解，根、莖、葉和花等器官的衰老和程序性死亡過程，對目前已經研究的參與植物生長發育過程的主要半胱氨酸蛋白酶及物種進行統計 （表1）。本文對植物半胱氨酸蛋白酶在植物各組織生長發育中的功能研究及其進展進行綜述并展望，旨為進一步研究半胱氨酸蛋白酶的功能提供參考。

表1 半胱氨酸蛋白酶參與植物生長發育過程Table 1 Cysteine proteases involved in plant growth and development processes

1 葉衰老過程

葉片衰老是植物自然的生理過程，在葉片衰老過程中，葉肉細胞中的蛋白質被降解，半胱氨酸蛋白酶介導的蛋白質降解在該過程中發揮重要作用。葉片中蛋白質降解后，產生的營養物質（如氨基酸）被重新轉移到生長或儲存組織等部位，從而維持植物進一步的生長發育［10］。研究報道，通過對擬南芥［11］和大麥［12］葉片衰老過程中進行分析發現半胱氨酸蛋白酶的表達和酶活性在葉片衰老過程中會顯著增加。Bhalerao 等［13］對田間衰老的白楊葉片和溫室中幼嫩的葉片分別構建cDNA文庫，并對其基因表達模式進行分析發現，老葉中半胱氨酸蛋白酶的表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）豐富，且相關基因上調。

在多個植物中，半胱氨酸蛋白酶特別是木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶C1A，參與葉片衰老過程中蛋白的降解［14］。例如，SAG12［15］、RD21A［16］、AtRD19A、RD19C、ALP / SAG2 / AALP / ALEU［17］、CTB1和CTB3等［18］。除擬南芥以外，其他植物種中發現與擬南芥AtSAG12同源的蛋白，編碼這些蛋白的基因在葉衰老過程中上調或在葉片衰老過程中被誘導，參與調控葉片的衰老過程［14，18］。例 如，油 菜（Brassica napus）BnSAG12（BnSAG12-1和BnSAG12-2）［19］、煙草NtCP1［20］和NtSAG12［21］、水稻OsSAG39［22］、橡膠樹HbSAG12H1［23］及辣椒CaCP［24］。

1.1 SAG12（senescence-associated gene 12）參與調控葉片衰老過程

半胱氨酸蛋白酶SAG12的表達模式與葉片衰老過程嚴格相關，Lohman等［15］在擬南芥中發現半胱氨酸蛋白酶SAG12蛋白酶在葉片衰老過程被誘導。SAG12啟動子上游-603和-571 bp處含有一段高度保守的區域［25］，負責衰老特異調節，被作為擬南芥葉片衰老標記基因使用［26-28］。Otegui等［29］對ProSAG12：GUS轉基因擬南芥分析發現衰老葉片中的SAG12僅含SAV的葉肉和保衛細胞中表達，將SAG12與GFP融合表達，發現SAG12定位于衰老葉片葉肉細胞和保衛細胞中具有強烈蛋白水解活性的衰老相關的囊泡中（senescence associated vacuoles，SAVs）。雖然與野生型相比，擬南芥sag12純合突變體并無明顯的葉衰老表型［29］。但是，James等［30］發現sag12純合突變體中SAG12酶活性降低能夠誘導其他天冬氨酸蛋白酶CND41-like活性增加，來彌補SAG12活性的缺失，共同參與葉片衰老過程中的Rubisco降解。同樣，在油菜葉片衰老過程中，半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等多種蛋白酶被激活，參與Rubisco蛋白降解和氮素轉移［31］。James 等［30，32］研究發現，SAG12在葉片衰老過程中的氮素轉移發揮重要作用。在低氮條件下，SAG12不僅能將葉片衰老過程中釋放的氮素轉移到種子中，還能將根中蛋白質降解釋放出的氮素轉移到種子中，為其提供氮素，從而確保種子產量。

水稻中存在與AtSAG12同源的蛋白，即Os-SAG12-1［33］和OsSAG12-2［34］。Singh等［34］對OsSAG12-2的生化功能進行研究，大腸桿菌中重組OsSAG12-2能夠自我水解成有功能的蛋白酶，該酶具有蛋白水解酶功能，能水解偶氮酪蛋白底物。OsSAG12-1與AtSAG12相似度最高，在衰老和病原體感染過程中，OsSAG12-1的表達被誘導，RNAi轉基因水稻株系中該基因表達下調，誘導細胞死亡［33］；在鹽和紫外線脅迫誘導條件下，OsSAG12-2在RNAi轉基因植株中表達下調會增強脅迫誘導的細胞死亡，過量表達OsSAG12-1 和OsSAG12-2可減緩死亡過程［33］。說明OsSAG12-1和OsSAG12-2都是脅迫誘導細胞死亡的負調節因子［34］。

1.2 HvPap-14參與葉綠體蛋白的降解來介導葉片衰老過程

作為單子葉植物，大麥被用于研究單子葉植物中葉片衰老的模式植物。大麥的C1A家族由41個成員組成（HvPap-1至HvPap-42），在黑暗誘導條件下，對大麥葉片衰老過程中C1A家族成員的蛋白酶基因表達模式分析發現，HvPap-4、HvPap-7、HvPap-8、HvPap-13、HvPap-14、HvPap-15和 HvPap-22在衰老葉片中表達上調［18］。Díaz-Mendoza等［18］對黑暗誘導衰老葉片中的大麥半胱氨酸蛋白酶進行研究發現，HvPap-1和HvPap-19定位于衰老葉片葉肉細胞的小囊泡（可能是SAV），它們參與葉綠體蛋白降解的過程。HvPap-1在黑暗和氮缺乏的條件下被誘導［12］。在自然衰老和黑暗誘導衰老過程中，過表達HvPap-1加速了葉片的衰老，而HvPap-1沉默則延遲了葉片衰老過程［12］，說明HvPap-1參與調控葉片衰老過程。在干旱脅迫條件下，HvPap-1和HvPap-19表達上調，HvPap-1和HvPap-19的敲除可減少干旱脅迫條件下葉片蛋白質的降解［35］。HvPap-14基因在衰老的葉片中表達量最高［36］。Frank等［37］免疫電鏡分析發現其酶原存在于類囊體膜和類囊體腔中，而HvPap-14的成熟酶定位于葉綠體類囊體膜上；體外激活實驗證實HvPap-14酶原在pH<6條件下被激活為成熟酶；酶活分析發現HvPap-14的底物是LHCB（葉綠素a/b結合蛋白），PSBO（光系統II的外周蛋白）和葉綠體蛋白Rubisco大亞基，說明在葉片衰老過程中，大麥HvPap-14大量表達并被激活，通過參與葉綠體類囊體膜蛋白和Rubisco大亞基的降解，來介導葉片衰老的過程［12］。

總之，半胱氨酸蛋白酶通過催化葉綠體中Rubisco蛋白的降解，實現氮素的轉移，是葉片衰老過程中蛋白質降解的重要途徑。除了SAG12，越來越多的半胱氨酸蛋白酶被發現參與該過程，它們之間存在功能相似性，在不同衰老條件下，其酶學機制及蛋白質降解底物和降解途徑是否也存在相似性，有待進一步研究。

2 維管組織的PCD過程

植物維管組織中木質部細胞中導管分子和纖維細胞發生程序性細胞死亡（PCD）過程，其液泡破裂，并釋放出半胱氨酸蛋白酶和其他水解酶，內容物降解并形成空腔，同時次生壁發生增厚，從而使導管分子（tracheary element，TE）具有輸水功能［38-39］。

2.1 ZCP4參與導管分子PCD過程

半胱氨酸蛋白酶在導管分子PCD過程中被誘導。體外培養百日草懸浮細胞可誘導形成導管分子，被廣泛用于研究導管分子分化的模式系統。百日草ZCP4編碼木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶，在TE早期分化過程的PCD中起作用［40-41］。ZCP4基因在TE分化早期［42-43］表達，在擬南芥中表達proZCP4∶GUS，觀察其在木質部導管分子分化過程中的表達模式發現，ZCP4在子葉、胚軸和根中早期分化的導管分子（TE）中特異表達，而且僅在未成熟的導管分子中表達，而不在成熟導管分子和其他細胞中表達，說明可作為導管分子早期分化的標記基因［44］。對ZCP4啟動子進行分析發現，11 bp的導管分子順式作用元件TERE（tracheary-elementregulating cis-element）序 列（CTTNAAAGCNA）是TE特異表達所必須的，它決定了該基因在TE特異性表達模式。除ZCP4以外，TERE順式作用元件也存在于TE分化過程中與PCD相關的蛋白酶基因和與次生壁形成相關基因的啟動子中，說明TERE順式作用元件也決定了這些基因在TE中的表達特 異性［45］。

2.2 AtXCP1（xylem cysteine protease 1）和AtXCP2參與木質部導管分子PCD過程

擬南芥半胱氨酸蛋白酶AtXCP1和AtXCP2為同源蛋白，二者在木質部中特異性表達，并在木質部導管分子（tracheary elements，TEs）PCD中發揮作用［46］。XCP1和XCP2編碼約40 kD的前體蛋白，在酸性條件下中，去除N端信號肽和和前體結構域，XCP1和XCP2被激活，形成具有活性的成熟蛋白酶。利用XCP1和XCP2啟動GUS融合蛋白表達，研究其在擬南芥中的表達模式，發現二者均在分化的TE中表達［46］。XCP1和XCP2在根的TE自溶過程中發揮作用［47］。Avci等［47］將根中TE的自溶過程分為兩個步驟，第一步是微自溶（micro-autolysis）即中央大液泡完整時發生的自溶；第二步，大規模自溶（mega-antolysis）即中央大液泡破裂后引起的自溶。通過對xcp1、xcp2單突變體和 xcp1 xcp2雙突變體根中TE的自溶過程進行電鏡分析發現，XCP1和XCP2主要參與中央液泡破裂前的微自溶過程，同時也與其他水解酶一起，參與了液泡膜破裂后細胞內容物清除的過程。在xcp1單突變體和xcp1 xcp2雙突變體中，由于XCP1表達缺失，TE空腔中出現內容物未完全降解的現象，而且xcp1 xcp2雙突變體中未降解的內容物比xcp1更致密，而xcp2突變體的表型與野生型差不多，說明在微自溶過程中XCP1發揮的作用要大于XCP2的作用［47］。

2.3 γVPE參與木質部纖維細胞的PCD過程

液泡加工酶（VPE）屬于一類新的半胱氨酸蛋白酶，在植物中調節液泡蛋白的成熟和活化，通過液泡降解來介導植物細胞的程序性細胞死亡過程（PCD）。在擬南芥中有αVPE、βVPE、γVPE和δVPE四個蛋白酶，根據其表達部位，可以分為營養性VPE和種子型VPE，其中αVPE和γVPE在營養器官表達，βVPE和δVPE在種子中表達［48］。研究表明，γVPE在營養組織中表達，且在莖的形成層，初級韌皮部和初級木質部中特異性表達［49-50］。γVPE在木質部細胞的PCD過程中發揮重要作用。在與野生型擬南芥相比，γvpe突變體中木纖維細胞內容物降解延遲和細胞次生壁增厚。體外實驗表明，γVPE在pH 值為7.0時以酶原形式存在，在pH 值為5.5條件下可通過自催化轉化為40 kD成熟酶。半胱氨酸蛋白酶CEP1也與木質部發育過程中PCD和次生壁增厚有關［51］，與γVPE存在上下游酶原激活關系，共同調控木質部細胞的PCD過程。體外實驗表明，γVPE能在體外催化CEP1酶原，使其轉化成成熟蛋白。在γvpe擬南芥突變體的莖發育過程中，利用Western能檢測大量CEP1酶原，但缺少CEP1成熟酶，說明γVPE的缺失導致CEP1蛋白酶的成熟受到抑制。表明γVPE通過激活CEP1酶原的成熟來調控莖木質部細胞的發育，參與莖發育過程中木質部纖維細胞的PCD過程［52］。

半胱氨酸蛋白酶是調控維管組織PCD過程的關鍵酶類，參與該過程的蛋白酶存在普遍的冗余現象，多個酶擁有相似或相近的功能，卻隸屬于不同的半胱氨酸蛋白酶家族，它們如何協調發揮作用有待進一步研究。

3 種子萌發過程

隨著谷物種子的發育和成熟，貯藏蛋白聚集于胚乳中；當谷物種子萌發時，蛋白酶從盾片上皮細胞和糊粉層釋放到胚乳中，降解胚乳中的貯藏蛋白，產生的氨基酸和小肽被盾片吸收，然后運輸到正在生長的幼苗中，為幼苗的生長和發育提供所需的氨基酸［53-54］。半胱氨酸蛋白酶的正常啟動是保證種子正常萌發和幼苗正常生長發育的關鍵［55］，因此必須嚴格控制蛋白酶活性啟動時間節點，以避免蛋白質在非萌發期被降解而影響種子萌發。

醇溶蛋白是谷物種子中的主要儲存蛋白，在玉米和小麥種子種子萌發過程中，半胱氨酸蛋白酶能夠降解約90%醇溶蛋白。在大麥中，42種蛋白酶參與其種子萌發，其中27種是半胱氨酸蛋白酶［56］。木瓜蛋白酶類的半胱氨酸蛋白酶（C1A）和液泡加工酶（VPE）是參與雙子葉植物和單子葉植物種子萌發的主要蛋白酶［3，55，57］，負責降解種子存儲蛋白，為幼苗的生長提供營養。不同物種中多個半胱氨酸蛋白酶均參與種子萌發過程中的蛋白質降解過程，如單子葉植物大麥EPA［58］、EPB［53-54］、HvPap-19和HvPap-20［59］、aleurain［60］、HvPap-1［61-62］、HvPap-4和HvPap-6［63］、WEB-1［64］、水稻OsVPE-1［65］和REP-1［66］；雙子葉植物擬南芥AP2，PAP3和RD19A［9］；紫云英pSK19［67］，黑吉豆SH-EP［68］和菜豆PvCEP-1［69］等。

3.1 半胱氨酸蛋白酶B（endoprotease B，EPB）參與儲存蛋白的降解

體外實驗證實，半胱氨酸蛋白酶EPA和EPB均可降解醇溶蛋白。在黑小麥中發現的EP8是EPA的同源蛋白，在種子萌發過程中在糊粉層中合成，負責在種子發芽過程中動員存儲的蛋白質，其活性可被內源性胱抑素TrcC-4抑制［54］。Koehler 等［70］從大麥中分離和鑒定出半胱氨酸蛋白酶B（EPB1和EPB2）。Mikkonen等［53］通過原位雜交發現EPB在種子發芽后24 h在上皮細胞中表達，然后定位于胚乳周圍的糊粉組織表達。種子萌發過程中，胚中赤霉素含量增加并轉移到糊粉層，誘導相關蛋白酶基因的表達。赤霉素能夠誘導EPB基因的表達，EPB-1啟動子中含有赤霉素順式作用GARE元件RTAACARANTCYGG，嘧啶盒（YCTTTTY）和Box I（TATCCAT）是GA誘導所必需的［71］。

3.2 βVPE介導種子儲存蛋白的成熟和δVPE參與種皮發育過程

βVPE和δVPE屬于種子型VPE，βVPE在種子發育晚期儲存蛋白形成時期表達，介導種子儲存蛋白的成熟過程，而且是儲存蛋白加工成熟過程所必需的，在βvpe突變體種子中，90%VPE活性喪失［48］。當βVPE缺失后，αVPE、γVPE和天冬氨酸蛋白酶起到部分彌補βVPE的作用［72］。在種子中，種皮緊緊包裹胚和胚乳，在休眠階段保護胚免受機械損傷、病蟲害侵襲及紫外線破壞，種皮還能為胚胎發育轉移母體營養的橋梁作用。在種子發育早期，種皮ii2和ii3兩層細胞會經歷PCD過程。而δVPE僅在種子發育早期的種皮ii2和ii3兩層細胞中表達，參與種皮發育過程中特定細胞層的細胞死亡過程。免疫電鏡結果顯示，δVPE定位于PCD過程中的ii2和ii3細胞內外細胞壁上。當δVPE缺失突變，這兩層細胞的PCD延遲［73］。

3.3 HvPap-1參與種子萌發過程中蛋白質動員

對半胱氨酸蛋白酶41個成員在大麥種子萌發過程中的表達模式進行分析發現［18］，HvPap-4，Hv-Pap-6和HvPap-10在發芽的種子中高水平表達而且具有種子特異性表達模式［63］。HvPap-1由GA誘導，定位于胚中的蛋白體和囊泡，負責胚乳中的蛋白質降解，參與大麥種子萌發過程中蛋白質動員作用［61］。過量表達HvPap-1減少了種子中的淀粉量并提高了發芽率，而抑制HvPap-1表達則增加種子中的淀粉量且降低發芽率［62］。大麥中HvPap-1，HvPap-6和HvPap-19 定位于胚中，但HvPap-1，HvPap-6和HvPap-19 蛋白酶積累存在差異，可能不同的C1A半胱氨酸蛋白酶具有特異降解存儲蛋白的能力。

總之，半胱氨酸蛋白酶參與降解或動員種子中存儲蛋白，在種子發芽和幼苗生長中起重要作用，半胱氨酸蛋白酶的表達和活性受GA，ABA和胱抑素等的調節。

4 根的發育過程

研究表明，擬南芥中3種含KDEL基序的半胱氨酸蛋白酶［74-77］，即AtCEP1、AtCEP2和AtCEP3，以及毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5［78］在根的發育過程中起作用。

4.1 AtCEP2參與初生根的生長過程

AtCEP2參與了初生根的生長并影響根的發育過程［77］。AtCEP1和AtCEP2均在根的表皮層根尖細胞和側根尖的頂端（PCD位點）以及在側根生長期表達［74-75］。AtCEP2定位于根冠表皮細胞壁，無活性的AtCEP2酶原被運輸或擴散到細胞壁，在pH值低于6.5時通過自催化轉化為成熟酶［74，79］。從即將發生PCD的根冠細胞釋放出的有活性AtCEP2可能擴散到鄰近的質外體和細胞壁，參與蛋白質降解，進而影響表皮細胞伸長。AtCEP2的缺失，導致LR原基延遲出現。說明AtCEP2是根細胞生長所必需的，這可能影響了細胞壁的重塑能力［77］。

4.2 PtCP5參與主根生長過程

研究發現，毛果楊半胱氨酸蛋白酶PtCP5影響根的發育過程，如張強［78］克隆獲得了毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5，通過生物信息學分析發現，PtCP5屬于木瓜類半胱氨酸蛋白酶家族中B類組織蛋白酶。利用實時定量PCR技術對PtCP5進行了組織表達定位分析，PtCP5主要在根部和葉部表達。構建了半胱氨酸蛋白酶基因PtCP5的正義植物表達載體，并通過花序侵染法對野生型擬南芥進行侵染，成功獲得PtCP5正義轉基因擬南芥株系。通過對PtCP5正義轉基因的擬南芥進行了主根長度分析，結果顯示，與野生型相比，PtCP5正義轉基因擬南芥主根長度明顯長于野生型。說明PtCP5參與主根生長影響根的發育過程。

目前檢測到AtCEP1、AtCEP2和AtCEP3以及 PtCP5等半胱氨酸蛋白酶在根中表達量較高，且對根的生長發育有一定的影響，但是這些酶如何調節根的發育機制仍需進一步研究。

5 花藥絨氈層PCD過程

花藥是花粉的發育場所，為花粉的發育提供營養物質。絨氈層是花藥囊最內層細胞，在花藥發育后期會經歷PCD，絨氈層細胞降解不正常會導致花粉敗育。半胱氨酸蛋白酶在絨氈層的PCD過程中起著重要作用［80-81］。在多種植物中發現木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶參與了絨氈層的PCD過程。例如，煙草中的NtCP56［80］；擬南芥半胱氨酸蛋白酶51（CP51）和AtCP56［82］、CEP1［83］、βVPE［84］；甘 藍型油菜BnaC.CP20.1［85］；水稻OsCP1［86］，這些蛋白酶基因的異常表達影響了絨氈層PCD進程，導致了不同程度的花粉敗育。

5.1 CEP1參與絨氈層PCD過程

半胱氨酸蛋白酶CEP1在擬南芥絨氈層細胞的程序化死亡和花粉發育的過程中起重要作用［83］。CEP1的表達量與花粉的可育程度相關，CEP1的表達量過高或者過低，都會造成花粉不同程度的敗育。根據形態變化可將擬南芥花藥的發育分為14個時期，絨氈層在第5時期開始形成，同時小孢子母細胞分化，隨后通過減數分裂形成四分體；到第9-10時期絨氈層細胞開始降解，單倍體小孢子從四分體中釋放，然后進行不對稱的有絲分裂形成雙核小孢子；到第11-12時期絨氈層細胞急劇降解完成，此時雙核小孢子中的生殖細胞核經歷一次有絲分裂形成三核花粉［87］。CEP1通過參與絨氈層降解，從而影響花粉發育。免疫組化顯示擬南芥半胱氨酸蛋白酶CEP1基因特異地的在花藥發育的第5-11時期的絨氈層中表達。免疫電鏡和western共同證實，CEP1花粉發育早期第5階段，無活性的CEP1酶原儲存于液泡中，在絨氈層細胞的PCD起始之前第6-8時期，在酸性的環境下，CEP1前體酶自催化去除信號肽和前肽，部分酶原轉化成有活性的成熟酶。在絨氈層細胞PCD過程中第9-11時期CEP1成熟酶從破裂的液泡中釋放，參與細胞質內物質的降解。在cep1突變體中，絨氈層細胞壁的降解，絨氈層分泌結構的形成和細胞核的降解被抑制，不能給花粉發育提供足夠的營養和組分，導致花粉外壁發育不正常，大部分花粉敗育。研究發現，CEP1酶原一方面可自催化轉變為成熟形式［83］；另一方面，CEP1酶原成熟還需要βVPE的參與［84］。

5.2 βVPE激活其他蛋白酶共同參與絨氈層PCD 過程

Cheng等［84］利用Proβvpe：GUS檢測βVPE的表達模式，發現βVPE在擬南芥花藥發育的5-8時期高水平的表達，且在絨氈層中特異性表達。體外激活實驗顯示51 kD的βVPE酶原在pH5.2條件下可自催化轉化為27 kD成熟形式，免疫雜交顯示在花藥發育的βVPE在5-6時期以原酶和少量成熟酶的形式存在，在7-8時期完全轉化為成熟酶形式。說明花藥發育過程中βVPE在酸性條件下自催化形成有活性的成熟蛋白。在花發育過程中，βVPE酶原激活時間早于CEP1，同時βvpe與cep1突變體的花藥表型類似，表現出液泡裂解的延遲和花粉育性的降低。免疫雜交實驗證明，在βvpe突變體中花藥發育過程中，CEP1和RD19A的成熟受到嚴重抑制，RD19C完全不能被催化成成熟酶不能完全轉化為成熟酶［84］。說明βVPE作為一個早期被激活的半胱氨酸蛋白酶，處于蛋白酶激活網絡的上游，催化絨氈層發育過程中CEP1和其他半胱氨酸蛋白酶的成熟，從而參與絨氈層降解并且影響花粉發育［84］。

總之，花藥絨氈層PCD對于花粉發育至關重要，目前一些與花藥絨氈層PCD發育相關的半胱氨酸蛋白酶被報道，這些半胱氨酸蛋白酶在此過程中發揮直接或者間接作用，但是這些半胱氨酸蛋白酶在PCD過程中如何被激活；不同蛋白酶之間否存在上下游激活關系；它們之間的酶學調控網絡需要進行深入研究。

6 總結與展望

半胱氨酸蛋白酶在植物生長發育過程中發揮重要作用，不僅參與種子萌發，根生長及葉片衰老過程，還參與莖中導管分子及花藥中絨氈層細胞的細胞程序性死亡過程。半胱氨酸蛋白酶在這些組織中發揮蛋白質的降解作用，為新細胞的生長提供營養和組分，保證植物生長發育順利進行。有些半胱氨酸蛋白酶如δVPE在特定組織表達，影響特定組織的蛋白質降解及生長發育過程。但是越來越多的研究發現，某些半胱氨酸在多個組織中表達，影響多個組織的發育進程，而且半胱氨酸蛋白酶在不同組織功能不一樣，如SAG12除了參與葉片衰老，還與根發育相關［88］。βVPE除了參與種子中儲存蛋白的合成［48］，還與花藥發育中絨氈層的細胞PCD有關［84］。CEP1不僅參與花藥絨氈層PCD過程，也參與莖中導管分子和纖維細胞的PCD過程，其他半胱氨酸蛋白酶是否在不同的植物組織中參與不同的功能，或者同一蛋白酶在不同組織中是否發揮著類似功能，還需要進一步深入研究。

絕大多數的半胱氨酸蛋白酶以酶原形式存在，并且在特定的時間和地點被激活而發揮作用。體外實驗表明，不同的半胱氨酸蛋白酶激活條件不同，pH值是蛋白酶激活的重要條件，有些蛋白能夠在特定pH值條件下發生自激活，而有些蛋白酶的激活需要其他蛋白酶的參與，半胱氨酸蛋白酶在植物發育過程中如何被激活以及蛋白酶與蛋白酶之間的激活調控網絡也值得進一步研究。